抗廣譜病原體的轉基因植物的製作方法

2023-07-31 07:41:06 4

專利名稱：抗廣譜病原體的轉基因植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及到基因工程的植物，其被改造用以表達一種或多種屬於temporin和/或dermaseptin家族的肽。
新近，植物育種和基因工程技術已經用於抵抗植物病原體。在一定情形下，育種者和分子生物學家已經成功地改造了對某些病原體的抗性。過去一些年裡，許多植物R(抗性)基因已經從植物中分離出來。當引入其它的易染病作物時，這些R基因產生對某些病原體的增強的抗性。例如，美國專利5,571,706介紹了菸草N基因的分離，它賦予對菸草花葉病毒的抗性。然而，儘管迄今報導的常規的育種和基因工程方法可成功地增強病原體的抗性，它們一般解決僅僅由一種病原體，或者小量緊密聯繫的病原體引起的問題。結果，儘管採用這些方法生產的作物具有增強的抗一種病原體的保護力，仍然必須採用常規的化學試劑以控制其它的病原體。
生產對廣譜病原體，包括細菌和真菌病原體，具有增強的抗性的植物，將具有極大的農業利益。本發明涉及到這樣的植物。
發明概述本發明者已經發現轉基因植物內某些肽的表達賦予廣譜病原體抗性，包括對真菌和細菌增強的抗性。這些肽是少量的、帶正電的(陽離子的)屬於temporin和dermaseptin家族的肽，它們天然存在在某些種青蛙的皮膚內。本發明提供的轉基因植物可用於常規的農業用途，例如糧食作物。還可收割和處理這些植物以提取已表達的temporin和/或dermaseptin肽，它接著可以純化以用於醫療和其它用途。
因而本發明包括表達至少一種dermaseptin或temporin肽的轉基因植物，以及生產這些植物的方法。這些植物的部分，包括種子、果實、莖、葉和根，可以以常規方式利用，作為食物原料，或者作為dermaseptin或temporin肽的來源。由於所有植物種類易感染一種或多種植物病原體，可有效地應用本發明以在任何植物種類中產生廣譜抗性。從而，本發明可應用至單子葉植物、雙子葉植物和裸子植物，包括但並非限於，玉米、小麥、水稻、大麥、大豆、棉花、一般意義的豆、油菜/菜籽(canola)、紫花苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、芸苔、棉花、亞麻、花生、三葉草；蔬菜，例如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、馬鈴薯、胡蘿蔔、蘿蔔、豌豆、小扁豆、甘藍、花椰菜、椰菜、芽甘藍、胡椒；樹果實例如柑橘、蘋果、梨子、桃子、杏、胡桃；和花，例如蘭花、康乃馨和玫瑰。
在其最基本形式中，本發明提供表達一種或多種dermaseptin和/或temporin肽的轉基因植物。dermaseptin和temporin肽家族的成員本領域是公知的。本發明可採用的dermaseptin的例子包括，但並非限於，由Mor.等人，Biochemistry，308824-8830，1991，Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994和Wechselberger，Biochim.Biophys.Acta 1388279-283，1998.介紹的dermaseptin。可採用的emporin例子包括，但並非限於，由Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92，1996介紹的temporin。在它們的天然狀態(即，在青蛙細胞中表達的)，dermaseptin和temporin肽以前體形式產生，隨後通過蛋白水解剪切加工以形成成熟蛋白質。Dermaseptin的成熟形式長度一般為大約27-34個胺基酸，而temporin的成熟形式長度一般為大約10-13個胺基酸。本發明預料這些肽的天然存在的全長(未加工過)形式，以及肽的成熟(加工過)形式和中間形式的用途。此外，也可以採用這些肽的合成形式。肽的合成形式包括任何不是天然存在的形式，以及包括在胺基酸序列上不同於天然存在肽，但仍然保持dermaseptin或temporin生物活性的肽。該序列變異體通常保留與至少一種天然存在的dermaseptin或temporin肽的至少40％的胺基酸序列同一性。
其它的可採用的dermaseptin或temporin的合成形式包括具有N-末端肽延伸的形式。這樣的肽延伸可包括通常在蛋白質加工過程中清除的dermaseptin或temporin的前體形式的部分，或者可以是合成序列。這些N-末端肽延伸可對蛋白水解剪切產生增強的抵抗力，並且也可增強肽的抗菌活性。通常地，這些N-末端延伸長度在2和25個胺基酸之間，儘管也可以採用更長的延伸。在某些實施方案中採用的N-末端延伸序列的例子包括肽序列MAMWK和MASRH。AMWK序列是天然存在的肽延伸；它是通常在加工過程中剪切的全長dermaseptin-b肽序列的部分。ASRH是一種合成的延伸序列。在每種情形下，N-末端蛋氨酸加入延伸肽以確保肽的適當表達。
本發明的基本方面基於在轉基因植物中temporin和dermaseptin肽的表達，其它的胺基酸序列也可連接這些肽中，以便製備融合肽。轉基因植物中這種融合肽的表達可提供甚至比單獨temporin或dermaseptin肽的表達更有效的廣譜病原體抗性，或者可增強已表達的temporin/dermaseptin分子的穩定性以提供更高的表達水平，因此促進源於植物組織的肽的純化。因而，在另一實施方案中，本發明提供表達融合肽的轉基因植物，它包括(1)為temporin或dermaseptin的第一肽序列；和
(2)與第一肽序列可操作地連接的第二肽序列。
第二肽序列通常地，但並不是必需地，與第一肽序列的氨基(N-)末端連接。
在某些實施方案中，第二肽序列包括陰離子的(帶負電荷的)「前區」肽序列。這種前區肽用來中和dermaseptin或temporin的陽離子本質，因而在細胞環境中可以提供增強的穩定性。因此，這些前區通常包括大量的帶負電荷的胺基酸，例如穀氨酸(Glu或E)和天門冬氨酸(Asp或D)。適合的前區包括發現在天然存在的未加工過的(全長)dermaseptin和temporin肽中的那些，以及陰離子的源自其它肽的前區，包括哺乳動物起源的那些，例如源自綿羊cathelin蛋白質的前區。包括這樣的前區的融合肽可以以P-D或P-T表示，其中P為前區肽，T為temporin肽，D為dermaseptin肽。
儘管這樣的前區肽可以直接連接入dermaseptin或temporin肽的N-末端，採用間隔肽以連接這兩種肽是有益的。本領域中連接兩種肽的間隔肽的應用是公知的；這種間隔肽通常長度在2和25胺基酸之間，並且提供一種連接第一肽序列至第二肽的靈活的鉸合部。已經被用於提供連接兩種肽的靈活的鉸合部的間隔序列包括甘氨酸(4)絲氨酸間隔(GGGGS x3)，Chaudhary等人介紹，Nature 339394-397，1989。如上介紹的N-末端肽延伸還可用於提供間隔肽功能。包括前區肽、間隔肽和dermaseptin或temporin肽的融合肽可以表示為P-S-D或P-S-T，其中S表示間隔肽。
間隔序列也可包括剪切位點，例如由蛋白酶識別和剪切的肽序列。這樣的位點有助於接著植物組織的純化之後從dermaseptin或temporin肽中清除前區。
在下列章節更詳細地介紹本發明的這些和其它的方面。序列表顯示列在附隨的序列表中的核酸和胺基酸序列，對於核苷酸鹼基採用標準字母縮寫，對於胺基酸採用三字母密碼。每個核酸序列僅僅顯示一鏈，但是通過參考顯示的鏈應認為包括互補鏈。
SEQ ID1顯示dermaseptin b cDNA序列。
SEQ ID2顯示前體dermaseptin b肽(未加工過)的胺基酸序列。
SEQ ID3顯示成熟dermaseptin b肽的27個胺基酸的序列。
SEQ ID4顯示成熟dermaseptin B肽的31個胺基酸的序列。
SEQ ID5-14顯示各種成熟(加工過)dermaseptin肽的胺基酸序列。
SEQ ID15顯示一種編碼temporin G的cDNA序列。
SEQ ID16顯示temporin G前體(未加工過)形式的胺基酸序列。
SEQ ID17顯示成熟temporin G肽的13個胺基酸的序列。
SEQ IDs18-26顯示各種成熟(加工過)temporin肽的胺基酸序列。
SEQ ID27顯示編碼MSRA2的核酸序列。
SEQ ID28顯示MSRA2的胺基酸序列。
SEQ ID29-32顯示用於產生編碼MSRA2的核酸序列的寡核苷酸。
SEQ ID33顯示編碼MSRA3的核酸序列。
SEQ ID34顯示MSRA3的胺基酸序列。
SEQ ID35-38顯示用於產生編碼MSRA3的核酸序列的寡核苷酸。
SEQ ID39-41顯示各種N-末端延伸序列的胺基酸序列。
圖2是顯示肽MSRA2(Dermaseptin B)和MSRA3(Temporin A)對大腸桿菌的抗菌作用的圖。該細胞培養物在室溫下在指定濃度的Dermaseptin B(DSB；7μg/ml，30μg/ml，和75μg/ml)，Temporin A(TA；75μg/ml，133μg/ml，200μg/ml)以及Temporin A和Dermaseptin B的組合(133μg/ml Temporin A和30μg/ml Dermaseptin B)存在時培養4小時，稀釋並塗在LB板上。在於37℃培養過夜之後，對菌落計數並記下倖存的細菌。
圖3是顯示肽MSRA2(Dermaseptin B)和MSRA3(Temporin A)對胡蘿蔔歐文菌的抗菌作用的圖。該細胞培養物於室溫下，在指定濃度的Dermaseptin B(DSB；23μg/ml，45μg/ml)或Temporin A(TA；67μg/ml，133μg/ml)存在時培養4小時，稀釋並塗在LB板上。在於28℃培養過夜之後，對菌落計數並記下倖存的細菌。
I.定義dermaseptin如本文採用的，術語「dermaseptin」指天然存在的稱為dermaseptins的陽離子肽家族的任何成分，(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-960，1994)，以及這些天然存在的肽的顯示如下定義的dermaseptin生物活性的片段和變異體。
dermaseptin首先在南美州樹蛙Phyllomedusa sauvagii的皮膚提取物中鑑別出(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994)。它們是廣譜殺微生物的肽，可抑制細絲狀真菌以及細菌、酵母和原生動物的生長(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994)。自從鑑別出第一個dermaseptin，即dermaseptin S，這個肽家族的大量的其它成分業已被表徵和克隆，包括dermaseptin-b，分離自Phyllomedusa bicolor的皮膚(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994)，(SEQ ID2)；從Pachymedusa dacnicolor分離出兩種dermaseptin，其由克隆PD-3-3和PD-2-2編碼，如Wechselberger介紹的，Biochim.Biophys.Acta1388279-283，1998(分別為SEQ ID5-6所示的肽序列)；從Agalychnisannae分離出三種dermaseptin，其由克隆AA-3-6，AA-3-3，AA-3-1編碼，如Wechselberger介紹的，Biochim.Biophys.Acta 1388279-283，1998(分別為SEQ ID7-9所示的肽序列)；以及源自Phyllomedusa sauvagii的五種dermaseptin肽，稱為dermaseptin 5、dermaseptin 4、dermaseptin3、dermaseptin 2和dermaseptin 1，如Mor和Nicolas介紹的，JournalBiochemical Chemistry，2691934-1939，1994(分別為SEQ ID10-14所示的肽序列)。這些序列易於從公眾資料庫中得到，包括得自GenBank。
dermaseptin肽通常表達為大約60-80個胺基酸長度的前體形式，並且隨後加工成大約27-34個胺基酸長度的成熟形式。例如，編碼dermaseptin-b的cDNA(SEQ ID1；Amiche等人，J.Biol.Chem.2691747-1852，1994；Chapentier等人，Biol.Chem.27314690-14697，1998；位於GenBank核苷酸序列資料庫，入藏登記號為X72387)編碼78胺基酸長度的前體肽(SEQ ID2)。加工這種dermaseptin-b的前體形式以生產兩種成熟形式，稱為dermaseptin b和dermaseptin B(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1994)。Dermaseptin b(SEQID3)長度為27胺基酸並且包括前體形式的49-75位胺基酸殘基。Dermaseptin B是另一種長度為31個胺基酸的剪切產物，包括4個胺基酸的N末端延伸(AMWK)(SEQ ID4)。Dermaseptin B包括前體形式的45-75位胺基酸殘基。除顯示dermaseptin b全長前體形式的SEQ ID1和2之外，序列表顯示的dermaseptin肽表示肽的加工過的、成熟形式。
假如可得到大範圍dermaseptin肽序列和編碼這些肽的核酸序列，本領域的普通技術人員，採用標準的分子生物學技術，能夠容易地生產這些肽和它們相應的核酸序列。
除了採用以上介紹的天然存在的dermaseptin之外，採用與天然存在的dermaseptin肽稍微不同，然而在植物中表達時仍然賦予增強的廣譜病原體抗性的肽，也可以實施本發明，這對於本領域的熟練技術人員而言是明顯的。例如，成熟dermaseptin肽N-末端的螺旋狀兩性分子部分，尤其是前18個胺基酸殘基，已經被證明對於抗菌活性重要(Mor等人，J.Biol.Chem.，26931635-31641，1994；Mor和Nicolas，Journal Biochemical Chemistry，2691934-39，1994)，並且該片段可用來代替全長dermaseptin。因此，術語「dermaseptin」也包括變異的dermaseptin肽，以及天然存在肽的片段，它們分享與天然存在的dermaseptin肽的特定序列同一性水平，或者通過一種或多種保守的胺基酸替換與天然存在的dermaseptin肽不同。
這些變異的肽和片段保留了dermaseptin生物活性，它可通過以下介紹的方法測定。變異的dermaseptin通常具有與天然存在的dermaseptin肽(例如SEQ ID3顯示的那種)至少40％的胺基酸序列同一性，並通過以下介紹的方法測定。
dermaseptin生物活性dermaseptin肽抑制細菌生長和/或真菌生長的能力。通過採用以下給定的方案可容易地確定dermaseptin生物活性。
給定的dermaseptin肽的抗菌活性通過測定其抑制果膠分解性菌株例如胡蘿蔔歐文菌或大腸桿菌DH5的能力評估。通過在LB中連續地稀釋肽並100∶1等分試樣至96孔微量滴定板的孔中，測定給定肽的活性。新鮮的細菌培養物(～0.3 A550)接著在Luria-Bertani培養基(LB)中生長(1％w/v胰腖和0.5％w/v酵母提取物)並在LB中稀釋至10-2以表示大約104-105菌落形成單位(CFU)ml-1。10∶1的細菌培養物然後接種入含有肽的孔中，樣品在37℃培養4小時。孔的成分接著以LB稀釋，塗在LB瓊脂上並在37℃放置過夜。接著數與每個dermaseptin稀釋液(和未加入肽的對照)相對應的菌落，試驗下的肽的抗菌活性通過與對照板的比較測定。
本試驗的條件下，如果它在7g/ml的濃度能夠抑制至少10％的細菌生長(即，在此濃度，細菌菌落的數量不超過對照板的90％)，就測定dermaseptin肽具有生物活性。
給定dermaseptin肽的抗真菌生物活性通過利用真菌菌株仙人掌疫黴和/或茄病鐮孢菌評估。所選擇的真菌菌株在五種穀物瓊脂(FiveCereal Agar，含有20gL-1五種穀物嬰兒食物方便薄片以及8gL-1瓊脂3的FCA(Terras等人，The Plant Cell 7573-588，1995)上生長。室溫下生長5天之後，取出菌絲體塞並倒置在新鮮FCA板中心。試驗肽的無菌溶液(10∶1)接著引入距板邊緣3cm的孔中，在同一板上建立含無菌水的對照孔。在同一板上(或者在另外的板上)可以試驗各種濃度的試驗肽。試驗板室溫下培養5天，之後測量每個孔周圍的生長抑制區。
在本試驗條件下，如果它能夠在5g/ml的濃度抑制真菌生長(即，含有這種濃度肽的孔周圍有可辨別的抑制區)，就確定dermaseptin肽具有生物活性。
temporin如本文採用的，術語「temporin」指天然存在的稱為temporins的陽離子肽家族的任何成分(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)，以及這些天然存在的肽的顯示如下定義的temporin生物活性的片段和變異體。
temporin是最初從由Rana temporaria蛙皮膚製備的cDNA庫中識別的具有抗菌活性的小型陽離子肽。這些肽顯示與從Vespa蛇毒分離的溶血肽的一些序列相似性，然而，temporin肽並不是溶血的(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)。
temporin家族的十個成分，temporin A、B、C、D、E、F、G、H、K和L，已經由Simmaco等人介紹，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996。類似dermaseptin，temporin通常表達為前體形式，隨後加工以產生成熟形式。例如，編碼temporin G的cDNA分子(示為SEQ ID15，位於GenBank核苷酸序列資料庫，入藏登記號為Y09395)編碼一種61個胺基酸的temporin G前體形式(示為SEQ ID16)。胺基酸1-22包括信號序列，胺基酸23-46包括前區，胺基酸47-59包括被加工的、成熟的temporin G肽(成熟形式示為SEQ ID17)。一般地，預計的成熟temporin肽長度在10和13胺基酸之間，一些已經被發現在C-末端醯胺化(Simmaco等人，Eur.J.Biochem.，242788-92.1996)。TemporinA、B、C、D、E、F、G、H、K和L的成熟形式分別示為SEQ ID18、19、20、21、22、23、17、24、25和26。
如果可得到大範圍temporin肽序列和編碼這些肽的核酸序列，本領域的普通技術人員，採用標準的分子生物學技術，能夠容易地生產這些肽和它們相應的核酸序列。
除了採用以上介紹的天然存在的temporin肽之外，採用與天然存在的temporin肽稍微不同，然而在植物中表達時仍然賦予增強的廣譜病原體抗性的肽，也可以實施本發明，這對於本領域的熟練技術人員而言是明顯的。從而，術語「temporin」也包括變異的temporin肽，以及天然存在肽的片段，它們顯示與天然存在的temporin肽的特定序列同一性水平，或者通過一種或多種保守的胺基酸替換與天然的temporin肽不同。
這樣的變異的肽和片段保留了temporin的生物活性，這種生物活性可通過以下描述的方法測定。如以下描述的方法測定的，一種變異的temporin具有天然存在的temporin肽(例如SEQ ID17表示的那種)至少40％的胺基酸序列同一性。
temporin生物活性temporin肽抑制細菌生長的能力。
給定的temporin肽的抗菌活性通過測定其抑制果膠分解性菌株例如胡蘿蔔歐文菌或大腸桿菌DH5的能力評估。通過在LB中連續地稀釋肽並100∶1等分試樣至96孔微量滴定板的孔中測定給定肽的活性。新鮮的細菌培養物(～0.3 A550)接著在Luria-Bertani培養基(LB)中生長(1％w/v胰腖和0.5％w/v酵母提取物)並在LB中稀釋至10-2以表示大約104-105菌落形成單位(CFU)ml-1。10∶1的細菌培養物然後接種入含有肽的孔中，樣品在37℃培養4小時。孔的成分接著以LB稀釋，塗在LB瓊脂上並在37℃培養過夜。接著數與每個temporin稀釋液(和未加入肽的對照)相對應的菌落，試驗下的肽的抗菌活性通過與對照板的比較測定。
本試驗的條件下，如果它在100g/ml的濃度能夠抑制至少10％的細菌生長(即，在此濃度，細菌菌落的數量不超過對照板的90％)，就測定temporin肽具有生物活性，給定temporin肽的抗真菌生物活性通過利用真菌菌株仙人掌疫黴和/或茄病鐮孢菌評估。所選擇的真菌菌株在五種穀物瓊脂(含有20gL-1五種穀物嬰兒食物方便薄片，以及8gL-1瓊脂3的FCA(Terras等人，The Plant Cell 7573-588，1995)上生長。室溫下生長5天之後，取出菌絲體塞並倒置在新鮮FCA板中心。一種試驗肽的無菌溶液(10∶1)接著引入距板邊緣3cm的孔中，在同一板上建立含無菌水的對照孔。在同一板上或者在另外的板上可以試驗各種濃度的試驗肽。試驗板室溫下培養5天，之後測量每個孔周圍生長抑制區。
在本試驗條件下，如果它能夠在5g/ml的濃度抑制真菌生長(即，含有這種濃度肽的孔周圍有可辨別的抑制區)，就確定temporin肽具有生物活性。
轉基因植物如本文採用的，該術語指含有通常未在該種野生型植物中發現的重組遺傳物質的植物。從而，由通過轉化被引入放重組DNA的植物細胞生長的植物是轉基因植物，含有引入的轉基因的植物的一切後代(無論是有性還是無性繁殖)也是。
序列同一性兩個核酸序列，或者兩個胺基酸序列之間的相似性，以序列之間共享的序列同一性的水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，兩個序列越相似。
比較各種序列的對比方法在本領域是公知的。下列文獻介紹了各種程序和對比算法Smith和Waterman，Adv.Appl.Math，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988；Higgins Sharp，Gene，73237-244，1988；Higgins Sharp，CABIOS，5151-153，1989；Corpet等人，Nucleic Acids Research，1610881-10890，1988；Huang，等人，Computer Applications in the Biosciences，8155-165，1992；以及Pearson等人，Methods in Molecular Biology，24307-331，1994。Altschul等人，Nature Gene 6119-129，1994介紹了一種關於序列對比方法和同源性計算的詳細的考慮。
可以從幾種來源得到NCBI基本局部序列對比搜索工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410，1990)，包括國家生物學信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和網際網路上，以和有關序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx一起使用。在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/可以訪問它。在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html可以得到如何採用該程序測定序列同一性的介紹。
用於本發明的天然存在的dermaseptin和temporin肽的變異體一般特徵在於，當採用NCBI Blast 2.0.1對比時，與天然存在的temporin或dermaseptin的胺基酸序列全長對比，具有至少40％的序列同一性(Altschul等人介紹，Nucleic Acids Res.253389-3402，1997)。為了比較超過約30個胺基酸的胺基酸序列，採用Blast 2序列功能，預設BLOSUM62矩陣設置成默認參數(間隙存在值11，每個殘基間隙值1)。當對比短肽(小於大約30個胺基酸)時，採用Blast 2序列功能，PAM30矩陣設置成默認參數(開放間隙9，延伸間隙1懲罰)，進行序列對比。當通過此方法評估時，具有與參考肽更高相似性的蛋白質會顯示更高的百分比同一性，例如至少45％，至少50％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％或者至少95％的序列同一性。
重組重組核酸是一種具有非天然存在的序列，或者具有一種通過兩個單獨的序列片段的人工結合製備的序列。這種人工結合通過由化學合成完成，更通常地，通過對分離的核酸片段的人工操作，例如，通過基因工程技術完成。
寡核苷酸(oligo)一種長度至多大約100核苷酸鹼基的線性多核苷酸序列。
探針和引物基於本發明提供的胺基酸序列，可容易地製備核酸探針和引物。探針包括與可檢測標記或報導分子連接的分離核酸。常規的標記包括放射性同位素、配體、化學發光劑和酶。標記方法和適用於各種目的的標記的選擇指南，參見，例如，Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989和Ausubel等人，Current Protocals in Molecular Biology，Greene出版公司和Wiley-Intersciences，1987。
引物是短核酸，優選DNA寡核苷酸長15個核苷酸或更多。引物通過核酸的雜交可以被退火成互補的靶DNA鏈，以在引物和靶DNA鏈之間形成雜合體，接著通過DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸。引物對可以用於核酸序列的擴增，例如通過聚合酶鏈反應(PCR)或者其它的本領域公知的核酸擴增方法。
製備和使用探針和引物的方法參見，例如，Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989；Ausubel等人，Current Protocals in Molecular Biology，Greene Greene出版公司和Wiley-Interscienes，1987；以及Innis等人，PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，1990。PCR引物對可以由公知序列衍生，例如通過採用以例如引物為目標的電腦程式(0.5版，1991，Whitehead生物醫學研究所，劍橋，MA)。本領域的熟練技術人員會理解特定的探針或引物的特異性隨其長度增加。因此，例如，一種包括20個連續核苷酸的引物會與具有比相應的僅有15個核苷酸的引物更高特異性的靶退火。因而，為了獲得更高的特異性，可選擇包括20、25、30、35、40、50或更多連續性核苷酸的探針或引物。
分離的一種「分離的」生物成分(例如核酸或蛋白質或細胞器)是已經從天然存在該成分的生物體細胞中與其它的生物學成分基本上分離或者純化，即與其它的染色體和染色體外的DNA和RNA、蛋白質和細胞器分離或從其中純化出來。已經「分離的」核酸和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質。該術語也包含通過在宿主細胞中重組表達製備的核酸和蛋白質以及化學合成的核酸。
載體一種核酸分子引入宿主細胞，因此產生一種轉化宿主細胞。載體可以包括允許其在宿主細胞克隆的核酸序列，例如複製起點。載體也可包括一種或多種可選擇的標記基因和其它的本領域公知的遺傳因子。
可操作地連接當第一核酸序列與第二核酸序列以功能關聯放置時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，啟動子可操作地連接在編碼序列上。一般地，可操作連接的DNA序列是鄰接的，並且，必需將兩個蛋白編碼以符合同一讀框的方式連接。通過正常的肽鍵，或者通過其它的共價連接，兩個肽序列可以可操作地連接。
II.dermaseptin和temporin肽的選擇a.dermaseptin肽以上提供了一些示範性的dermaseptin肽。編碼這些dermaseptin多肽的核酸分子或者通過遺傳密碼簡單應用衍生至該肽序列，或者可採用天然存在的cDNA或基因序列。例如編碼dermaseptin-b的cDNA序列如SEQ ID1所示(並且公開在Amiche等人，J.Biol.Chem.2691747-852，1994)。一般地，選擇適於表達的成熟形式的dermaseptin肽。然而，可以選擇全長dermaseptin肽的任意片段，隨具有dermaseptin生物活性的片段而定，如果它用於生產抗病原體植物。
本領域的普通技術人員可理解，具有不同程度的抗菌活性的各種dermaseptin肽，它具有比其它的更有效地抗某些病原體的作用。因此，當選擇肽用於生產具有增強的耐病原體性的轉基因植物時，在各種因素中，具體的dermaseptin的選擇取決於要表達肽的植物的種類，以及通常感染那種植物種類的病原體的種類。
選擇好所希望的要表達的dermaseptin，可通過標準分子生物學技術製備編碼該肽的核酸分子。由於dermaseptin肽相對短，合成該核酸分子最簡單的方法很可能是在商業上可得到的寡核苷酸合成儀上經由合成重疊寡核苷酸而進行。接著將寡核苷酸體外組裝成全長編碼區。這種方法也允許選擇編碼反映其中要引入核酸分子的植物的密碼子使用偏向性的特定胺基酸殘基的密碼子，從而增強表達效率。在以下的實施例中提供採用這種方法的編碼序列的產生的詳細實例。
b.temporin肽以上提供了一些示範性temporin肽。編碼這些temporin多肽的核酸分子或者通過遺傳密碼簡單應用衍生至該肽序列，或者採用天然存在的cDNA或基因序列。例如，如SEQ ID15所示的編碼temporin G的cDNA序列。一般地，選擇適於表達的成熟形式的temporin肽。然而，可以選擇全長temporin肽的任意片段，隨具有temporin生物活性的片段而定，如果它用於生產抗病原體植物。
當選擇dermaseptin肽時，本領域的普通技術人員可理解，具有變動程度的抗菌活性的各種dermaseptin肽，它具有比其它的更有效地抗某些病原體的作用。因此，當選擇肽用於生產具有增強的耐病原體性的轉基因植物時，在各種因素中，特別的temporin的選擇取決於要表達肽的植物的種類，以及引起那種植物種類損失的病原體的種類。
如以上對dermaseptin的介紹，重疊寡核苷酸的合成和裝配是一種簡單和方便的生產編碼temporin的核酸分子的方法。
c.其它肽序列的添加在轉基因植物中temporin和dermaseptin蛋白也可以以融合蛋白的形式表達。儘管可以將選擇的適於在植物中表達的temporin和dermaseptin蛋白與任何所希望的肽融合，但包括一種可操作地連接在dermaseptin或temporin氨基端的陰離子前區肽的融合蛋白的表達預期是特別有益的。為了這種目的可以採用任何陰離子前區肽，包括在天然存在的全長(即，未加工)dermaseptin和temporin肽中發現的陰離子前區。例如，包括temporin G的23-46位胺基酸的前區(顯示為SEQ ID16)可以用作一種前區。這樣的前區肽用以中和dermaseptin或temporin的陽離子本質，從而可在細胞環境中提供增強的穩定性。因此，這些區域通常包括大量的帶負電荷的胺基酸，例如穀氨酸(Glu或E)和天門冬氨酸(Asp或D)。
本領域公知的其它的天然存在的前區肽的例子包括以下蛋白的前區肽人嗜中性防衛素蛋白(Daher等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，857327-7331，1988)；牛抗菌性cathelicidin蛋白BMAP28(Skerlavaj等人，J.Biol.Chem.27128375-381，1996)；綿羊抗菌性cathelin家族蛋白(Mahoney等人.，FEBS Lett.377519-522，1995)；牛indolicidin(DelSal等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.187467-472，1992)；豬抗菌肽prophenin-2和PR-39(Zhao等人，FEBS Lett.367130-134，1995)和PMAP-37(Tossi等人，Eur.J.Biochem，15941-946，1995)；人抗菌脂多糖結合蛋白CAP18(Larrick等人，Infect.Immun.631291-1297，1995)；以及鼠蛋白E3(Scott和Collins，Blood 882517-2530，1996)。
儘管陰離子前區肽可直接與陽離子肽N-末端結合，另一實施方案包括採用間隔肽序列連接前區肽至dermaseptin或temporin肽。在本領域連接兩個肽域的間隔肽的使用是公知的；這樣的間隔肽長度通常是2和25胺基酸之間，並提供靈活的連接第一肽序列至第二肽的鉸合部。已經用於提供連接兩個肽序列的靈活的鉸合部的間隔序列包括甘氨酸glycine(4)-絲氨酸間隔(GGGGS x3)，由Chaudhary等人描述，Nature 339394-397，1989。如下介紹的N-末端肽延伸也可用於提供間隔肽功能。間隔序列肽也可包括剪切位點，例如由蛋白酶識別和剪切的肽序列，如因子Xa。這樣的位點有助於在從植物組織中純化之後從dermaseptin或temporin清除前區。在微生物體系中採用陰離子前區肽和間隔肽以表達某些陽離子肽在本領域是公知的，並且在授予Hancock的美國專利5,593,866中。
在某些實施方案中，N-末端延伸肽序列可以被加入dermaseptin或者temporin肽。這樣的肽延伸可包括通常在蛋白加工期間清除的dermaseptin或temporin的前體形式的部分，或者可以是合成的序列。這些N-末端肽延伸用於提供增強的抗蛋白水解剪切性，增強轉錄水平或增強這些肽的抗菌活性。一般地，這些N-末端延伸長度在2和25胺基酸之間，儘管也可以採用更長的延伸。在某些實施方案中採用的N-末端延伸序列的例子包括肽序列AMWK、ASRH以及ALWK。AMWK(SEQ ID39)序列是天然存在的肽延伸；它是全長dermaseptin-b肽的部分，通常在加工過程中剪切掉。已經報導向dermaseptin b肽的N-端添加這種序列(以產生dermaseptin B)可增強該肽的體外抗菌活性(Strahilevitz，Biochemistry，3310951-10960，1995)。ASRH(SEG ID41)和ALWK(SEQ ID41)肽是合成的延伸序列。在每個情形下，加入N-末端的蛋氨酸以確保這種肽的合適的延伸。本領域的熟練技術人員可理解加入任何特定的N-末端延伸肽的對生產中的肽(dermaseptin或temporin)的生物學活性的影響，可以採用以上介紹的生物學活性試驗容易地評估。
d.dermaseptin和temporin肽變異體如上描述的，大量的天然存在的temporin和dermaseptin肽是公知的，通過顯示在序列表裡的那些例示。通過引入胺基酸替換、添加的胺基酸殘基或者通過刪除胺基酸殘基，可以選擇這些天然存在的肽的變異體。這些變異肽或者通過化學合成生產(例如，以便確認這種變異肽保留功能活性)，或者在生物學表達體系中生產。在後一種情況下，可以操作編碼相應天然存在的肽的核酸序列以便它編碼變異肽。這可以通過許多方法實施，例如通過採用定點誘變或者聚合酶鏈反應。由於這種肽是相對短的分子，變異肽的編碼區還可以簡單地從頭合成並引入適合的表達載體。
胺基酸序列的最簡單的修飾包括用一種或多種胺基酸替換具有類似生物性能的胺基酸。這些所謂的保守替換很可能對所得的蛋白質活性具有最小的影響。因此，通過一種或多種保守的胺基酸替換與天然存在的temporin或dermaseptin不同的肽，在本發明中可以用於代替天然存在的肽。表1顯示在蛋白質中可替換原始的胺基酸並且被認為是保守替換物的胺基酸。
表1原始殘基 保守替換物Ala serArg lysAsn gln；hisAsp gluGln asnGlu aspGly proHis asn；glnIle leu；valLeu ile；valLys arg；gln；gluMet leu；ilePhe met；leu；tyrSer thrThr serTrp tyrTyr trp；pheVal ile；leu通過選擇比表1的那些不保守的替換物，可以得到更多的在功能或其它特徵上實質上的變化，即選擇在其下述作用上明顯不同的殘基保持(a)替換區多肽骨架結構，例如，如摺疊或螺旋構造，(b)靶位分子的電荷或疏水性，或者(c)側鏈的大小。一般希望在蛋白性能上產生最大變化的替換物是那些基團，其中(a)一種親水性殘基，例如絲氨醯基或者蘇氨醯基，替換掉疏水性殘基，例如亮氨醯基、異亮氨醯基、苯丙氨醯基、纈氨醯基或者丙氨醯基(或被其替換)；(b)半胱氨酸或脯氨酸替換掉任何其它殘基(或被其替換)；(c)一種帶正電側鏈的殘基，例如賴氨醯基、精氨醯基、組氨醯基，替換掉帶負電的殘基，例如穀氨醯基或天冬氨醯基(或被其替換)；或者(d)具有大側鏈的殘基，例如苯丙氨酸，替換掉一種不具有側鏈的基團例如甘氨酸(或被其替換)。本發明也可採用具有這些更實質的變化中的一種或多種的變異肽，條件是保留temporin或dermaseptin生物學活性。
更廣泛的胺基酸變化也可在變異dermaseptin或temporin進行。然而如上註解的，採用以上介紹的對比程序與它們各自的天然存在序列的胺基酸序列全長對比時，這些變異肽通常特徵在於，計算出它們具有至少40％序列同一性。此外，這些變異肽保留生物學活性。
採用以上介紹的試驗體系可以確認dermaseptin或temporin肽具有生物學活性。確認肽具有希望的活性之後，採用標準分子生物學技術可以容易地生產編碼該肽的核酸分子。合適時，開放讀框的選擇要考慮其中要表達肽的植物種的密碼子使用偏向性。III.dermaseptin和/或temporin引入植物一旦生產了編碼dermaseptin和/或temporin肽的核酸序列，可以採用標準技術以在轉基因植物中表達該序列，以便賦予植物抗病原體性。基本方法是克隆核酸進入轉化載體，這樣以致於它可操作地與指引該核酸在植物細胞表達的控制序列(例如啟動子)連接。這種轉化載體接著通過許多技術中的一種(例如，電穿孔法)引入植物細胞，整個植物由這些細胞再生，選擇含有這些引入的核酸的後裔植物。優選地，一切或者部分的轉化載體穩定整合入植物細胞基因組。整合入植物細胞並含有引入序列以及用於控制表達的有關的序列(引入的「轉基因」)的轉化載體的那部分被稱為重組表達盒。
含有引入轉基因的後裔植物的選擇可基於檢測改變的表型進行。這樣一種表型可直接來自引入序列所賦予的抗病力，或者作為導入到轉化載體中的可選擇的顯性標記基因引入的結果，被證明具有對化學試劑(例如抗生素)增強的抗性。
在技術和科學文獻中充滿了特徵為用克隆核酸序列轉化的植物改性的成功的例子。所選擇的用於說明本技術領域所述知識的例子包括美國專利5,571,706(「植物病毒抗性基因和方法」)美國專利5,677,175(「植物病原體誘導蛋白」)美國專利5,510,471(「用於植物轉化的嵌合基因」)美國專利5,750,386(「抗病原體轉基因植物」)美國專利5,597,945(「遺傳增強抗病力的植物」)美國專利5,589,615(「通過已修飾的25貯存清蛋白的表達具有改善的營養值的轉基因植物的生產方法」)美國專利5,750,871(「芸苔種的轉化和外源基因表達」)美國專利5,268,526(「轉基因植物中植物色素的超量表達」)美國專利5,780,708(「可繁殖的轉基因玉米植物」)美國專利5,538,880(「可繁殖的轉基因玉米植物的生產方法」)美國專利5,773,269(「可繁殖的轉基因燕麥植物」)美國專利5,736,369(「轉基因穀類植物的生產方法」)美國專利5,610,042(「小麥的穩定的轉化方法」)。
這些例子包括介紹轉化載體的選擇、轉化技術以及被設計用於超量表達所引入的轉基因的構建體的構建。
a.植物種類由許多病原體引起的疾病作用於多種植物種。這些植物是單子葉植物、雙子葉植物或裸子植物。因此，例如，dermaseptin和/或temporin肽可以引入的植物種包括，但是並非限於，玉米、小麥、稻、大麥、大豆、棉花、一般意義的豆、油菜/菜籽(canola)、紫花苜蓿、亞麻、向日葵、紅花、芸苔、棉花、菸草、亞麻、花生、三葉草、豇豆、葡萄；蔬菜，例如萵苣、西紅柿、葫蘆、木薯、馬鈴薯、胡蘿蔔、蘿蔔、豌豆、小扁豆、甘藍、花椰菜、椰菜、芽甘藍、胡椒；樹果實例如柑橘、蘋果、梨子、桃子、杏、胡桃；毛皮樹例如花旗松和火炬松；和花，例如康乃馨和玫瑰。
b.載體構建和啟動子選擇已經介紹了大量適於植物細胞穩定轉染或者轉基因植物確立的重組載體，包括在Pouwels等人，Cloning VectorsA Laboratory Manual，1985，supp.，1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，5173-184，1989；以及Gelvin等人，PlantMolecular Biology Manual，Kluwer學院出版社，1990中介紹的那些。通常，植物轉化載體包括在5′和3′調節序列和顯性選擇標記控制下的一種或多種已克隆的序列。這樣的植物轉化載體通常也包含啟動子調節區(例如，一種控制誘導或組成型、經環境或發育調節的、或者細胞或組織特異性表達的調節區)、轉錄起始位點、核糖體結合位點、RNA加工信號、轉錄終止位點和/或多腺苷酸化信號。可用於表達一種轉基因的組成型植物啟動子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子，它能夠在大多數植物組織中賦予組成型、高水平的表達(參見例如，Odel等人，Nature，313810，1985；Dekeyser等人，Plant Cell，2591，1990；Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet.220389，1990；以及Benfey和Chua，Science，250959-966，1990)；胭脂氨酸合酶啟動子(An等人，Plant Physiol.88547，1988)；章魚氨酸合酶啟動子(Fromm等人，PlantCell，1977，1989)以及具有易位增強序列的2x CaMV/35S啟動子(Kay等人，Science，2361299-1302，1987)。
響應環境、激素、化學和/或發育信號而被調節的各種植物基因啟動子也可以用於在植物細胞中轉基因的表達，包括由以下因素調節的啟動子(a)熱(Callis等人，Plant Physiol.，88965，1988；Ainley等人.，Plant Mol.Biol.，2213-23，1993；和Gilmartin等人，The Plant Cell，4839-949，1992)(b)光(例如，豌豆rbcS-3A啟動子，Kuhlemeier等人PlantCell，1471，1989，和玉米rbcS啟動子，Schaffner Sheen，Plant Cell，3997，1991)；(c)激素，例如脫落酸(Marcotte等人，Plant Cell，1471，1989)；(d)創傷(例如，馬鈴薯PinII啟動子(Keil等人，Nucl.Acids.Res.145641-5650，1986)，農桿菌屬mas啟動子(Langridge等人Bio/Technology 10305-308，1989)，和葡萄藤vstl啟動子(Weise等人.Plant Mol.Biol.，26667-677，1994)；和(e)化學品例如茉莉酮酸甲酯或水楊酸(亦參見Gatz等人.Plant Mol.Biol.4889-108，1997)。
組織特異性(例如根、葉、花和種子)啟動子(Carpenter等人，ThePlant Cell 4557-571，1992；Denis等人，Plant Physiol.1011295-1304，1993；Opperman等人，Science 263221-223，1993；Stockhause等人，ThePlant Cell 9479-489，1997；Roshal等人，The EMBO J.61155，1987；Schernthaner等人，EMBO J.71249，1988；Yamamoto等人，Plant Cell3371-382，1990；and Bustos等人，Plant Cell 1839，1989)也可以被融合入編碼序列以獲得在各個器官中特定的表達。
植物轉化載體也可以包括RNA加工信號，例如，內含子，它可以位於該轉基因ORF序列的上遊或者下遊。此外，表達載體也可包括來自植物基因的3′-非翻譯區的其它調節序列，例如，一種增強mRNA的mRNA穩定性的3′終止區，如馬鈴薯的PI-II終止區或者章魚氨酸或胭脂氨酸合酶(NOS)3′終止區。
最後，如上註明的，植物轉化載體也可包括顯性選擇標記基因，以允許易選擇出轉化體。這些基團包括編碼抗生素抗性基團(例如，抗潮黴素、卡那黴素、博萊黴素、G418、鏈黴素或奇放線菌素)和抗除草劑基因(例如，膦絲菌素乙醯基轉移酶)的那些。
c.轉化和再生技術單子葉植物和雙子葉植物的植物細胞的轉化和再生現在是常規的，專業人員可以確定恰當的轉化技術。方法的選擇隨待轉化的植物類型改變；本領域熟練技術人員會識別特定方法對於給定植物種類的適當性。適當的方法包括，但並非限於植物原生質體的電穿孔；脂質體介導的轉化；聚乙二醇(PEG)介導的轉化；採用病毒的轉化；植物細胞微注射；植物細胞微粒轟擊；真空滲入；以及根瘤農桿菌(AT)介導的轉化。本章節開始列出的專利文獻描述了轉化和再生植物的典型步驟。
d.已轉化植物的選擇採用轉化載體進行植物轉化和再生後，通常採用摻入轉化載體的顯性選擇標記選擇已轉化的植物。通常地，這樣的標記會賦予已轉化植物的秧苗以抗生素抗性，轉化體的選擇可通過暴露秧苗至適當濃度的抗生素完成。
選擇也可通過利用經轉基因賦予植物的病原體抗性完成。如以下實施例介紹的，這樣的篩選或者在轉基因植物已經再生之後完成，或者(取決於採用的轉化方法)於植物再生之前在綠化轉基因愈傷組織上進行。IV.含多陽離子肽編碼區的植物一些情形下，由編碼dermaseptin或temporin肽的轉基因單一拷貝賦予的抗性水平，可以通過引入單一陽離子肽基因的多次拷貝或者編碼不同陽離子肽的幾個基因增強。
通過採用基因工程，將多陽離子肽編碼區引入單一載體是可能的。通常地(儘管非必需地)，這樣的載體包括兩種或多種dermaseptin和/或temporin開放讀框，每個可操作地與其自身5』和3』調節序列連接。當被引入植物時，這樣的載體可導致多種陽離子肽的表達。
含多轉基因的植物的創造也可通過採用標準育種技術完成。編碼第一陽離子肽的轉基因可以被引入第一植物，編碼第二陽離子肽的第二轉基因可以被引入第二植物。所得的轉基因植物接著可雜交以生產載有兩種轉基因的後代。V.dermaseptin和temporin的生產和分離以上介紹的組合物和方法不僅可以用於生產具有增強的、廣譜病原體抗性的植物，而且也可以用於適於廣泛其它用途的dermaseptin和temporin的大規模生產。例如，植物中大量產生的temporin和dermaseptin可以純化和用於醫療用途。
植物中生物活性肽的生產現在已廣泛實施，大批的表達和純化方法是公知的。促進植物中生物學活性蛋白產生的構建體例子可以在Goodman等人的美國專利4,956,282中發現。這些構建體例子通常包含啟動子區和編碼後來在純化加工中利用的胺基酸序列的附加核酸序列。用於促進dermaseptin和/或temporin肽分離的胺基酸序列隨後可以剪切且丟棄。
表2寡核苷酸#15』-ATG GCC ATG TGG AAA GAC GTT CTG AAA AAG(SEQ ID29)ATC GGT ACT GTC GCC CTC CAT GCA GGG-3』寡核苷酸#23』-TGA CAG CGG GAG GTA CGT CCC TTC CGG CGC(SEQ ID30)GAA CCT CGT CAT CGG CTG TGG TAG AGC GTC ATT-5』寡核苷酸#35』TCT AGA GGT ACC ATG GCC ATG TGG AAA GAC G-(SEQ ID31)3』寡核苷酸#43』-GGC TGT GGT AGA GCG TCA TTC TCG AGA CGT CTT(SEQ ID32)CGA AC-5』粗體核苷酸代表寡核苷酸#1和寡核苷酸#2之間的互補性區域。寡核苷酸#1的下劃線部分與寡核苷酸#3的下劃線部分一樣，因此允許寡核苷酸#3與源自寡核苷酸#1和#2開始延長的PCR產物結合。同樣地，寡核苷酸#4的下劃線部分與寡核苷酸#2的下下劃線部分一樣。這允許寡核苷酸#4與由寡核苷酸#1和#2的延長創造的PCR產物結合。
b.temporin編碼序列核酸分子設計為temporin A的成熟的13個胺基酸長度形式，其具有6個胺基酸的N-末端延伸序列，MASRHM(SEQ ID33)。這種核酸構建體命名為MSRA3並且在單一PCR反應中採用四個重疊寡核苷酸合成。採用的寡核苷酸如表3所示。頭兩個寡核苷酸(寡核苷酸#1和寡核苷酸#2)分別包含編碼原型肽的核酸序列。然而，和用於編碼原型dermaseptin肽的寡核苷酸不同，這些寡核苷酸是完全互補的，從而消除了在寡核苷酸#3和#4結合之前對起始延伸循環的需要。在PCR反應中採用的寡核苷酸#1和寡核苷酸#2的濃度為20nM。後兩個寡核苷酸包含通過各種限制酶識別的序列。具體地，寡核苷酸#3包含XbaI、KpnI和NdeI的限制位點，寡核苷酸#4包含SstI和PstI的限制位點。在PCR反應中採用的這些寡核苷酸濃度為200nM。
產品擴增之後，採用嵌入限制位點將它克隆進常規的克隆載體。MSRA3編碼區的核酸序列顯示為SEQ ID33，已編碼的肽顯示為SEQID34。寡核苷酸#1-4顯示為SEQ ID35-38。
表3寡核苷酸#15』-ATG TIT CTG CCC CTA ATC GGG AGG GTT CTC(SEQ ID35)TCG GGA ATC CTG TAA-3』寡核苷酸#23』-TAC AAA GAC GGG GAT TAG CCC TCC CAA GAG(SEQ ID36) AGC CCT TAG GAC ATT-5』寡核苷酸#35』-GGT ACC TCT AGA CAT ATG TTT CTG CCC CTA-3』(SEQ ID37)寡核苷酸#43』-GAG AGC CCT TAG GAC ATT CTC GAG ACG TC-5』(SEQ ID38)粗體核苷酸表示寡核苷酸#1和寡核苷酸#2之間的互補性區域。如表裡描述的這些序列是完全互補的。寡核苷酸#2下劃線部分與寡核苷酸#3下劃線部分互補，寡核苷酸#1下劃線部分與寡核苷酸#4下劃線部分互補。
所得的雙鏈DNA接著克隆進一種或多種以下描述的載體。2.含各種啟動子序列的載體編碼MRSA2和MRSA3的核酸序列裝配入各種植物轉化載體，從而將其置於各種不同的啟動子控制下。
克隆MRSA2和MRSA3序列進入一種這樣的載體，將不同的序列置於包含CaMV 35S啟動子的兩個拷貝和AMV RNA4翻譯增強元件的啟動子的控制下(Kay等人，Science 2361299-1302，1987)。由連接入該載體所得的克隆以前綴pD作為名稱。因此，pDMSRA2表示包含在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強子控制下的含有MSRA2構建體的載體。同樣地，pDMSRA3表示包含在雙CaMV 35S啟動子和AMV RNA4翻譯增強子控制下的含有MSRA3構建體的載體。
設計了另一種載體，以使MSRA2構建體受重建「超級啟動子」的控制。這種啟動子包含在ocs(章魚氨酸合酶)上遊活化序列(反向)三聯體之後的mas(甘露氨酸合酶)啟動子/活化區(Langridge等人，Bio/Technology 10305-308，1989)。這種超級啟動子更詳細地介紹參見Ni等人，The Plant J.，7661-676，1995。這種特別的構建體也包括6×His標記的編碼區，位於MSRA2編碼區上遊並可操作地與其連接。因此，將這種6×His標記胺基酸序列表達為附加至被編碼的dermaseptin/MAMWK肽的N-末端。編碼這種肽的載體被命名為pRSHMSRA2。3.馬鈴薯和菸草的轉化馬鈴薯品種，Russert Burbank和Desiree，以及菸草被用作適於轉化的代表性植物品種。按照DeBlock，Theoret.Appl.Genet.76767-774，1988，加以一些改變，來實施植物的轉化。
簡要地，通過從4周齡枝分離葉子(5mm)和莖來實施菸草和馬鈴薯的轉化。切下這些葉和枝並且通過以玻璃移液管尖刮擦進一步損傷。受傷的葉子和莖接著在含15ml的S2培養基的皮氏培養皿中顛倒漂浮。這種培養基包含如Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962所列的成分，補充有30g/L蔗糖、pH 5.5的0.5g/L MES和20g/L甘露醇。
含有農桿菌(以感興趣的載體轉化)的60μl的LB培養基在後對數生長期加入每個培養皿，這些培養皿接著在低光強度(500lux)下在農桿菌存在下培養3天。接著以含有1g/L羧苄青黴素的S2培養基洗滌植物組織，以濾紙吸乾，顛倒置入S4培養基。S4培養基包含Murashige和Skoog，Physiol.Plant.15473-479，1962列出的成分，減去蔗糖並補充200mg/L穀氨酸、pH 5.7的0.5g/L MES、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺膘呤-SO4、0.5％瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/L NAA、1g/L羧苄青黴素和50μg/ml卡那黴素、10mg/L AgNO3)。室溫(RT)下在3000lux下放置植物組織樣品以允許愈傷組織形成。兩周之後，在葉和莖的傷口邊緣形成了許多小癒合組織(Calli)。取出小癒合組織並轉移入新鮮S6培養基(不含NAA的S4)。2-3周之後，這些癒合組織轉移入S8培養基(補充了0.1mg/L GA3的S6)以允許形成芽。
在S8培養基放兩周之後，第一批芽(0.5cm)轉移至S1培養基。該培養基包含Gamborg等人描述的成分(Exp.Cell Res.50151-158，1968)，並還加入20g/L蔗糖、150mg/L CaCl2、pH 5.8的0.4％瓊脂糖、1g/L羧苄青黴素和50μg/ml卡那黴素。S1培養基和芽放入Magenta瓶以允許根形成。一周之後芽已生根。為了避免選擇相同的根，避免從同一或緊密連接的癒合組織轉移芽。
再生的推定的轉基因植物轉入含1g/L羧苄青黴素和50μg/ml卡那黴素的MS培養基以進一步分析。4.抗病性癒合組織的篩選發展了適於抗病試驗的簡化早期檢測方法。對照和轉基因癒合組織生長在S4培養基(MS培養基，其中無蔗糖並補充200mg/L穀氨酸、pH 5.7的0.5g/L MES、0.5g/L PVP、20g/L甘露醇、20g/L葡萄糖、40mg/L腺嘌呤-SO4、0.5％瓊脂糖、1mg/L反式玉米素、0.1mg/LNAA、1g/L羧苄青黴素和50μg/ml卡那黴素、10mg/L AgNO3)。樣品接著在RT和3000lux下放置以允許愈傷組織形成。兩周之後，在葉和莖的傷口邊緣形成了許多小癒合組織。取出小癒合組織並轉移入新鮮S6培養基(無NAA的S4)。2-3周之後，癒合組織轉移至新鮮培養基並在植物病原體，鐮孢菌屬或疫黴屬存在的條件下生長。實驗結尾，記下存活並保持明亮綠色的癒合組織。在對照樣品中未發現抗真菌性癒合組織，發現抗真菌病原體的癒合組織已轉化。5.轉基因植物的分子鑑定採用以下描述的方法從轉基因馬鈴薯和菸草植物中分離DNA。進行純化，在某些情形下涉及一種更嚴格的方案，在其它情形下涉及一種簡單的粗提取步驟。通過獲得10克的新鮮葉組織並且立即在液氮中冷凍樣品，開始更嚴格的提取步驟。冷凍過的組織接著研成細粉並以20ml提取緩衝液(50mM Tris-HCl緩衝液、5mM EDTA、0.35M山梨醇、0.1％BSA、0.1％β巰基乙醇、10％PEG 4000)提取。通過幾層粗棉布和一層微孔布過濾勻漿。接著按照Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.842097-5100，1987，實施最後的純化步驟。
當為PCR分析目的進行分離時，主要採用粗提取步驟。對於此步驟，收集大約200mg的新鮮葉並在液氮中研成粉狀。100μl的0.5NNaOH加入粉末中並混合(旋轉)30秒。這種懸浮液離心5分鐘，5μl上清液加入45μl的100mM的Tris緩衝液(pH 8.0)中。這種粗基因組DNA提取物被用作PCR擴增的模板。
通過用提取的基因組DNA和以上表2的寡核苷酸#3和#4實施PCR反應，進行MSRA2構建體存在與否的檢測。來自此反應的期待的產物大小是129bp。這種方法允許鑑定用pDMSRA2或pRSHMSRA2構建體轉化的轉基因菸草和馬鈴薯。
通過用上表3的寡核苷酸#3和#4，或者以特異性針對2×35SCaMV啟動子的引物和上表3的寡核苷酸#4的組合，實施PCR反應，進行MSRA3構建體的檢測。鑑別出含有pDMSRA3構建體的轉基因菸草植物。
在含有在ocs(章魚氨酸合酶)上遊活化序列(反向)的三聯體之後的mas(甘露氨酸合酶)啟動子/活化區的超級啟動子的控制下，也將對照植物改造成包含GUS基因(Ni等人，The Plant J.7661-676.1995)。經PCR技術確認這種轉基因已插入菸草植物基因組。
某些情形下，通過Northern印跡分析確認轉基因的活性表達。從轉基因菸草和馬鈴薯植物中分離和純化出用於這些實驗的RNA底物。按照Verwoerd等人，Nucl.Acids Res.172362，1989，實施用於這種分離的方案。6.抗細菌病原體性為了檢測這種轉基因馬鈴薯和菸草植物對細菌病原體胡蘿蔔歐文菌的抗性，室溫下讓這種細菌在LB培養基生長整夜(A600＝2.9)。2ml等分量的歐文菌培養物在dH2O中稀釋5倍，1ml稀釋的培養物加入2ml MS液體培養基中並用於這種抗菌試驗。從轉基因植物或對照植物上新切的枝(～3.5cm)插入含有已稀釋的歐文菌培養物的試管以致該植物切邊的底部浸入細菌培養物中。試驗管室溫下在3000lux培養下並間歇地觀察。
含有pDMSRA2的轉基因馬鈴薯植物和含有pDMSRA2或pRSHMSRA2的轉基因菸草植物如上介紹進行試驗，並顯示抗病原體性在細菌培養物存在下生長一周之後，這種轉基因植物未受感染(通過視覺檢查確定)並持續生長。大不相同地，與細菌培養物鬥爭的對照植物在培養一周之後嚴重感染，生長被抑制，在暴露至真菌病原體2-3周之後植物死亡。
為了檢測轉基因馬鈴薯塊莖對細菌病原體Erwinia carotovora cvcarotovora的抗性，在塊莖圓盤上開一小孔(直徑2cm，厚3cm)。20微升的100x稀釋的隔夜的細菌培養物(大約2×107CFU)移放孔中，盤在室溫下培養6天。從盤上輕輕地清除腐爛的組織，測定塊莖組織的重量損失。由此試驗得到的結果顯示，與非轉基因對照組比較，轉基因的馬鈴薯組織抗軟腐病(


圖1)。
在微量滴定板中，以含有大約1×105細菌/ml和指定濃度抗菌肽的220μl最後體積，測定抗菌肽(SEQ ID NO34(MRSA3)和SEQ ID NO28(MRSA2))對抗大腸桿菌(圖2)和胡蘿蔔歐文菌(圖3)的抗菌作用。細胞培養物室溫下培養4小時，稀釋並塗在LB板上。在37℃(大腸桿菌)或28℃(胡蘿蔔歐文菌)過夜培養之後，菌落計數並記錄存活的細菌。兩個試驗結果顯示該肽具有顯著的抗菌活性。7.抗真菌性採用下列方案測定成熟植物對各種真菌的抗性。切1cm2×0.5cm的包含鐮孢菌屬或疫黴屬(Phytophthora sp.)培養基片並放入9cm的培養皿中的V8瓊脂培養基(250ml/L V8汁，7克/L瓊脂)新鮮板的中心，並在室溫下生長大約一個月，或者直到真菌菌絲體徹底覆蓋該培養皿。切下轉基因植物的芽(～10cm)並轉入MS培養基以進一步生長。按照各種處理，允許植物生長3天或2周直到芽生根。不傷害植物，接著將兩片1cm2×0.5cm的真菌瓊脂切片施加至植物芽的兩側。然後視覺確定所得的感染程度。
在典型的試驗中，以pDMSRA2轉化的轉基因馬鈴薯植物，以pRSHMRSA2或pDMSRA2轉化的菸草植物，以及對照的馬鈴薯和菸草植物暴露在仙人掌疫黴下。7天之後，仙人掌疫黴已在MS培養基的整個表面生長，並透入對照植物的根和莖，引起對重要植物功能的損害。對照植物的根被嚴重損害，這是明顯的。植物和真菌之間相互作用引起指示腐敗過程的黃-棕色色素的分泌。隨後，植物失水，葉子捲曲，莖的底部變柔軟，根死亡。然而，轉基因植物依然健康並無疾病症狀，即使真菌菌絲體完全覆蓋MS培養基。
以上介紹的實施也用於試驗轉基因植物對蔓延疫黴的抗性。這些試驗結果顯示轉基因植物對蔓延疫黴也具有抗性。
進行用茄病鐮孢菌進攻pDMSRA2轉基因馬鈴薯植物的另一項實施。6天之後，鐮孢菌生長遍及MS培養基表面，在對照植物中對根的損害是嚴重的，鐮孢菌穿入莖基底部，莖軟化，感染的葉子的葉脈顯示出清晰的褐變和壞死。幾天之後，對照植物萎縮並死亡。然而，轉基因植物持續生長，即使在茄病鐮孢菌的嚴重侵襲下。
在多個實施方案和實施例中已經舉例說明和介紹了本發明的原理，不背離這些原理在安排和細節上改變本發明，對本領域熟練技術人員而言是明顯的。我們要求保護一切在隨後權利要求中的精神和範圍內的一切改變。
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1.一種表達陽離子肽的轉基因植物，所述陽離子肽選自(a)temporin；和(b)dermaseptin。
2.一種包含重組核酸分子的轉基因植物，其中所述核酸分子編碼選自以下的肽(a)temporin；和(b)dermaseptin。
3.按照權利要求2的轉基因植物，其中所述肽包括一種胺基酸序列，該序列選自由SEQ ID3-14和17-26列出的胺基酸序列。
4.按照權利要求3的轉基因植物，其中所述肽進一步包括2-25個胺基酸長度的N末端肽延伸。
5.按照權利要求4的轉基因植物，其中所述N末端肽延伸選自AMWK、ASRH和ALWK。
6.一種包含重組核酸分子的轉基因植物，其中所述核酸分子編碼融合肽，該肽具有選自以下的式(a)P-D；和(b)P-T，其中D是dermaseptin肽，T為temporin肽，並且P是陰離子前區肽。
7.一種包含重組核酸分子的轉基因植物，其中所述核酸分子編碼融合肽，該肽具有選自以下的式(a)P-S-D；和(b)P-S-T，其中D是dermaseptin肽，T為temporin肽，P是陰離子前區肽，S為間隔肽。
8.一種包含核酸分子的轉基因植物，所述核酸分子編碼一種包含選自以下的胺基酸序列的肽(a)SEQ ID3-14及其片段；(b)通過一種或多種保守胺基酸替換與(a)指定的胺基酸序列不同的胺基酸序列；和(c)具有與(a)指定的胺基酸序列的至少40％同一性的胺基酸序列，其中所述肽具有dermaseptin的生物學活性。
9.按照權利要求8的轉基因植物，其中所述肽進一步包括與所述肽的N-末端可操作地連接的陰離子前區肽。
10.一種包含核酸分子的轉基因植物，所述核酸分子編碼一種包含選自以下的胺基酸序列的肽(a)SEQ ID17-26和其片段；(b)通過一種或多種保守胺基酸替換與(a)指定的胺基酸序列不同的胺基酸序列；和(c)具有與(a)指定的胺基酸序列的至少50％同一性的胺基酸序列，其中所述肽具有temporin的生物學活性。
11.按照權利要求8的轉基因植物，其中所述肽進一步包括與所述肽的N-末端可操作地連接的陰離子前區肽。
12.一種包含重組核酸分子的轉基因植物，所述核酸分子編碼一種包含胺基酸序列的肽，所述序列選自SEQ ID28和34。
13.一種生產生物學活性陽離子肽的方法，包括提供按照權利要求1的轉基因植物；和從該植物中分離出至少一種生物學活性陽離子肽。
全文摘要
公開了表達dermaseptin和/或temporin肽的轉基因植物。在某些實施方案中,這些植物具有增強的、廣譜病原體抗性並可用作農業或園藝作物。在其它實施方案中,該植物用於生產大量的dermaseptin和/或temporin肽。
文檔編號C12N5/10GK1351667SQ00805132
公開日2002年5月29日 申請日期2000年3月16日 優先權日1999年3月17日
發明者桑託什·米斯拉, 威廉·W·凱 申請人:維多利亞大學創新和發展公司