一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應用的製作方法

2023-08-02 01:28:26 1

本發明屬於分子生物學
技術領域：
，具體涉及一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應用。
背景技術：
：抗菌多肽是生物體合成的一類小分子防禦多肽，具有廣譜殺菌作用，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有較強的殺滅作用，對某些真菌、支原體，尤其對耐藥性細菌也都有很好的殺滅作用，是動物固有免疫系統的重要成員。一般的抗生素是通過阻斷生物大分子的生物合成來發揮作用，而抗菌多肽可以在細菌細胞膜上穿孔而形成離子性通道，造成細菌細胞膜結構破壞，引起胞內水溶性物質大量滲出，最終導致細菌死亡。隨著傳統抗生素的廣泛使用，許多病原菌已經產生耐藥性，因此，活性多肽在抗菌方面就有明顯優勢。現有技術中，科學工作者們已經從細菌、真菌、高等植物、無脊椎動物、脊椎動物乃至人體中發現並分離獲得上千種具有抗菌活性的多肽。比如大豆生物活性多肽lunasin是從大豆中分離鑑定的一個天然多肽，分子量約為5kda，全長43個胺基酸殘基，將此基因轉染哺乳動物細胞，能阻斷有絲分裂並引起染色體斷裂，最終導致細胞凋亡，研究表明，lunasin具有抗結腸癌、乳腺癌和前列腺癌的功能，還具有抗炎作用，對巨細胞具有抗氧化作用。然而天然分離的活性多肽lunasin存在含量低、活性較低的缺陷，不利於分離純化，限制了其應用。技術實現要素：本發明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應用，對現有多肽lunasin結構進行改進，在細胞中高效表達，易於分離純化，活性較高。本發明的第一個目的是提供一種具有抗菌抗炎活性的多肽，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，胺基酸序列如seqidno.2所示。本發明的第二個目的是提供一種應用權利要求1所述的多肽製備的重組載體，所述重組載體是將如seqidno.1所述的核苷酸序列插入質粒pet-32a(+)中得到的。本發明的第三個目的是提供一種包含權利要求2所述的重組載體的轉化體。本發明的第四個目的是提供一種權利要求1所述的多肽在抑制lps引起的炎症反應中的應用。本發明的第五個目的是提供一種權利要求1所述的多肽在抗痤瘡丙酸桿菌中的應用。與現有技術相比，本發明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應用，具有以下有益效果：g-lunasin是對現有多肽lunasin胺基酸結構進行改進，利用第32-37位grdgrd的作用使g-lunasin進入目的細胞核內，提高與目的細胞的結合效率，與天然lunasin相比，促進高效表達，增加生物活性。grdgrd後添加h胺基酸，在不影響多肽活性的基礎上，增加其與親和ni柱的結合效率，便於分離純化。附圖說明圖1為凝膠回收後目的基因片段和質粒片段的電泳圖譜；其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為目的基因片段，2號泳道為質粒片段；圖2為陽性克隆經xbai和psti雙酶切鑑定圖譜；其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為雙酶切後的空質粒，2號泳道為雙酶切後的重組質粒；圖3為sds-page電泳檢測結果；其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為g-lunasin多肽表達產物。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明提供的一種具有抗菌抗炎活性的多肽(下文稱g-lunasin)，所述多肽的核苷酸序列如seqidno.1所示，胺基酸序列如seqidno.2所示，該多肽是對活性多肽lunasin的胺基酸結構進行改進，在如seqidno.3所示的lunasin胺基酸序列中添加胺基酸殘基，增加原有lunasin的活性和在細胞中的表達效率，減少其分離純化的難度。基於同一種發明構思，本發明還提供了一種g-lunasin的製備方法，包括以下步驟：s1，構建重組載體將如seqidno.2所示的核苷酸序列的一端添加ndei的酶切位點，另一端添加xhoi的酶切位點，得到目的基因，插入到puc57質粒中保存，得到重組質粒puc57-g-lunasin。用ndei、xhoi雙酶切重組質粒puc57-g-lunasin，酶切體系如表1所示，酶切條件為37℃，2h，凝膠回收帶有g-lunasin核苷酸序列的目的基因片段；用ndei、xhoi雙酶切質粒pet-32a(+)，酶切體系如表2所示，酶切條件為37℃，2h，凝膠回收序列較長的質粒片段；圖1是凝膠回收後目的基因片段和質粒片段的電泳圖譜，其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為目的基因片段，2號泳道為質粒片段，條帶清晰，無雜帶。將目的基因片段和質粒片段經t4連接酶連接過夜，連接體系如表3所示，構建得到重組載體puc57-g-lunasin-pet-32a。質粒pet-32a(+)廣泛應用於融合蛋白、多肽的表達，並且帶有組氨酸標籤等，便於下遊多肽蛋白的分離純化。表1重組質粒puc57-g-lunasin的酶切體系表2質粒pet-32a(+)的酶切體系質粒pet-32a(+)(30ng/μl)40μlndei3μlxhoi2μl10×buffer5μl總體系50μl表3連接體系試劑名稱使用量目的基因片段(30ng)6μl10×t4dnaligasebuffer2μl質粒片段(50ng)5μlt4dnaligase(5u/μl)1μlddh2o20μls2，轉化，製備表達工程菌將重組載體puc57-g-lunasin-pet-32a的轉化入大腸桿菌dh5αde3感受態細胞，選取陽性轉化子作為表達工程菌，轉化方法採用常規轉化方法即可。陽性轉化子的篩選也按照常規方法進行。挑取陽性克隆經xbai和psti雙酶切鑑定，結果如圖2所示，結果顯示重組載體構建正確。s3，多肽表達、純化s31，將表達工程菌接種到lb(amp抗性)培養基中，37℃，220rpm震蕩培養過夜，得到種子液，次日將種子液按照2％的體積比例轉入新鮮的lb(amp抗性)培養基中，繼續培養至od600＝0.6，然後加入iptg，使iptg的終濃度為0.1mm，30℃，220rpm震蕩培養4h，得到多肽表達菌液；取多肽表達菌液1ml，5000rpm、4℃離心5min，收集菌體；iptg誘導表達後，表達產物經sds-page電泳檢測，結果如圖3所示，其中，m泳道為dnamaker，1號泳道為g-lunasin表達產物，6kda附近可見清晰的條帶。s32，取1g菌體，加入相當於菌體質量5％的bingdingbuffer溶液a(20mm磷酸鹽，0.5m氯化鈉，5mm咪唑，ph7.4)和pmsf。pmsf用無水乙醇配製成100mm的儲存液，pmsf的工作濃度為1mm。加入bingdingbuffer溶液a和pmsf重懸細胞沉澱，加入溶菌酶(工作濃度為0.3mg/ml)，混勻，冰上放置30min。400w冰上超聲破碎細胞，超聲5s停5s，反覆40次。加入10％tritonx-100，使終濃度為0.05％，混勻，冰上放置15min。12000rmp、4℃離心20min，取上清，並用0.22μm膜過濾上清，得到過濾液，冰上保存備用。s33，將nisepharose樹脂裝入合適的層析柱，用相當於過濾液10倍體積的洗脫液分離，經bingdingbuffer溶液a(含50mmolnah2po4、5mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液b(含50mmolnah2po4、20mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液c(含50mmolnah2po4、60mmol咪唑、500mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)、溶液d(含50mmolnah2po4、100mmol咪唑、300mmolnacl，溶劑為雙蒸水，ph至7.4)洗脫，流速為12-15ml/h分別收集洗脫液，經鑑定洗脫液d中g-lunasin的純度達98.3％％，含量達0.05g/ml，而該方法提取的天然lunasin的純度為90.3％％，含量為0.03g/ml。一、g-lunasin毒性檢測分別配製0、10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液，刺激巨噬細胞raw264.7，加藥24h後mtt檢測刺激巨噬細胞活性，結果分別為100％、104％、110％、98％，結果表明0-60μm的g-lunasin多肽溶液對巨噬細胞病毒無毒性。二、g-lunasin對細胞培養基中no濃度的影響以無菌水作為陰性對照，24h後檢測no細胞培養基質中no產量為2.4μm。以1μg/ml的lps作為陽性對照組，刺激巨噬細胞raw264.7，24h後檢測no細胞培養基質中no產量為5.5μm。然後我們分別向4個lps刺激的細胞培養基質中加入10μm、30μm、60μm的g-lunasin溶液、100μm的天然lunasin溶液，24h後檢測細胞培養基質中no分別濃度為4.5μm、4.3μm、4.1μm、4.8μm。說明g-lunasin溶液能夠顯著降低lps引起的no升高現象，具有良好的生物學活性，能夠有效抑制lps引起的炎症反應，且g-lunasin比天然lunasin溶液效果更顯著。三、g-lunasin抗菌效果於大鼠耳廓中央給予痤瘡丙酸桿菌菌懸液50μl皮內注射成功構建大鼠痤瘡模型後，痤瘡模型a組不給予任何治療；b組皮損處給予克林黴素0.1％溶液外用治療；c組皮損處給予質量分數0.05％g-lunasin溶液外用治療。對照組不注射大鼠耳廓中央給予痤瘡丙酸桿菌菌懸液。三組大鼠注射部位皮膚於注射24h時開始增厚，並逐漸增加，於第5天出現粉刺、丘疹、膿皰等痤瘡樣皮損，色紅，質硬；b、c組處理2周後，膿腫基本消退，厚度變薄，顏色趨於正常。取各組大鼠右耳部注射部位皮膚組織，he染色發現對照組的大鼠左耳皮膚表皮較薄，可見毛囊，表皮、真皮交界清楚；a組表皮角化過度，毛囊面積擴大，炎性細胞瀰漫性浸潤；b、c組毛囊角化明顯減輕，真皮層可見少量炎性細胞。說明g-lunasin溶液具有良好的抗菌效果。b、c組大鼠未觀察到毒副反應。儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。序列表河南工程學院一種具有抗菌抗炎活性的多肽及其應用3patentinversion3.51141dna人工序列1tccaaatggcagcaccagcaagacagctgccgcaagcagctccagggggtgaacctcacg60ccttgcgagaagcacatcatggagaagatccaaggccgcggcggccgcggccacgatgac120gatgatgatgatgacgacgac141247prt人工序列2serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspglyargasphisaspaspaspaspaspaspaspaspasp354045343prt大豆3serlystrpglnhisglnglnaspsercysarglysglnleuglngly151015valasnleuthrprocysglulyshisilemetglulysileglngly202530argaspaspaspaspaspaspaspaspaspasp3540當前第1頁12