用於發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的菌株的製作方法
2023-08-02 12:48:06
專利名稱：用於發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及食品微生物應用技術領域，尤其涉及一株適合在米糠和麩皮提取液複合培養基中生長並高產灰樹花多糖的一株灰樹花誘變新菌株。
背景技術：
國內外科學研究和國內市場表明食用菌多糖能增強人體免疫力，輔助治療腫瘤等疾病，已成為腫瘤生物療法選用的輔助用品。國內由食用菌子實體製成的藥字號產品有安徽蕪湖的靈芝膠囊、浙江慶元的灰樹花膠囊等，由食用菌提取物製成的非藥字號保健品也有銷售。國際上紐西蘭產有「GanoPoly」(甘諾寶力)多糖提取物系列產品，銷往美國、澳大利亞、中國(包括香港和臺灣)等地方。該產品的發明人高益槐是國際知名食用菌產品開發專家，曾經獲得愛因斯坦發明獎。高益槐發明的「GanoPoly」系列產品主要由靈芝、雲芝、猴頭等提取的多糖與殼聚糖一道複合構成，用於提高免疫力、輔助抗腫瘤治療 等。紐西蘭安發保健品有限公司現在中國福建泉州建有食用菌多糖的生產基地。在各種食用菌多糖的研究中，現在已有研究說明，藥食兩用食用菌灰樹花的多糖也具有較好的提高免疫力、輔助抗腫瘤治療等的功效，值得引起足夠的重視，例如Ohno Naohito、SuzukiIwao等從灰樹花菌體中提取灰樹花多糖的藥效試驗表明，灰樹花多糖具有抗腫瘤作用和免疫調節作用(參考文獻見① Ohno N, Lino K, Suzuki I et al. Neutral and acidicant I tumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of LrrifolaFrondosa[J]. Chem. Pharm. Bull, 1985，33(3):1181-1186 ;② Naohito Ohno, YoshiyukiAdachi, Iwao Suzuki,et al. Characterization of the antiumor glucan obtainedfrom liquid-cultured Grifola frondosa [J].Chem. pharm. Bull. 1986, 34(4):1709 ；③Iwao Suzuki, Koichi Hashimoto, Shozo Oikawa, et al. Antiumor and immunmodulatingactivity of a β -glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa [J].chem. Pharm Bull,1986,37 (2):410.)。灰樹花(Cri/b/a /roflt/iosa)是ー種藥食兩用的食用菌,屬擔子菌亞門，層菌綱,無隔擔子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬。灰樹花有多種名稱，如貝葉多孔菌、千佛菌、慄子蘑、蓮花菌、奇果菌、舞茸等。野生灰樹花分布於日本、歐洲、北美和我國許多地區，如黑龍江、吉林、河北、四川、雲南、廣西、福建等省區。近年來，國內灰樹花已在一些省份如河北、浙江、福建等省獲得栽培，用於鮮食或提取功能成分。灰樹花栽培的缺點是佔用土地，生產周期相對較長。為高效生產灰樹花多糖，研究人員對能エ廠化生產的液體培養方法的研究十分重視，形成多種研究成果。1986年Ohno N等報導了灰樹花液態培養的研究。國內江南大學陳石良的博士論文研究了灰樹花深層發酵技術及灰樹花的抗腫瘤多糖(參考文獻見陳石良.藥用真菌灰樹花深層發酵技術及其抗腫瘤多糖的研究[D].博士學位論文.無錫江南大學，2000.)。這類研究的內容主要涉及培養基研製、培養エ藝、適宜菌種選育等。研究的重點是降低生產成本和提高多糖產量。多數エ藝採用葡萄糖、糧食類原料如澱粉、馬鈴薯等作為培養基，即使用到農產品加工的副產品如米糠或麩皮，也是作為次要成分加入，一般還是以葡萄糖、糧食類原料或其他原料為主要碳源或氮源。現有的灰樹花菌種難以在不添加葡萄糖或其他糧食類原料的米糠或麩皮的培養基上生長。本專利的設計人劉偉民、張建曾對原有灰樹花菌種進行過初步微波-紫外複合誘變的處理，其誘變菌株在米糠、麩皮培養基上(不添加葡萄糖)液體發酵產灰樹花多糖效果較好，菌絲乾重和多糖較原有菌株分別提高39. 24%和42. 58%，並提交了中國發明專利申請，申請專利的名稱是用於米糠和麩皮複合原料生產多糖的灰樹花菌株，申請號為201010579078. 5。儘管該菌株生產的多糖較實驗室原有的菌株生產的多糖有較大的提高，但誘變菌種會退化，從穩定誘變菌種、提高生產效率的角度而言，不斷誘變菌種，獲得更高的多糖產量仍是需要不斷研究的問題和更高的發明創造的目標。另外，申請號為201010579078. 5的灰樹花菌株比較適合的發酵エ藝是需要對米糠和麩皮先進行植物纖維酶的酶解，提供發酵所需的碳源，但引入酶解エ藝會増加生產成本。如果誘變出高效灰樹花菌株，在沒有先期酶解的情況下，也能高效轉化米糠和麩皮，則將達到創新的效果，本發明瞄準此目標，進行灰樹花菌種的新誘變，以求獲得新的生產灰樹花多糖的高效菌株。中國是農業大國，農副產品來源豐富。米糠、麩皮作為稻穀和小麥加工的副產物，不但其營養成分豐富，而且價格低廉。米糠中富含澱粉、纖維素等物質，而麩皮富含蛋白 、纖維素等物質。從理論上講，米糠和麩皮複合已經具備了灰樹花生長所需要的碳源和氮源物質。在灰樹花自身纖維素酶及其他酶的作用下，灰樹花可將米糠和麩皮轉化成自身的營養物質進行生長，生產灰樹花多糖。因此，運用米糠、麩皮等廉價農副產品，完全替代葡萄糖等灰樹花液體發酵所需的營養物質，生產具有輔助腫瘤治療的灰樹花多糖，將具有經濟價值。其關鍵問題為必須得到適宜在米糠和麩皮複合培養基上生長的灰樹花菌株，所以必須對已有菌株進行誘變篩選。如能篩選出適宜的灰樹花菌株，則研究和生產將有可能取得突破。目前微生物的物理選育方法主要有紫外誘變、離子束誘變、微波誘變等。本發明在實驗室已有的菌株JSUlO (即發明人已擁有的上述已申請專利的菌株)的基礎上採用原生質體雷射誘變方法，進ー步誘變得到適合在米糠和麩皮複合培養基上生長並產灰樹花多糖的高效菌株，所得菌株為首次發明得到。
發明內容
本發明解決上述現有技術中的不足，為了進一歩降低生產成本，考慮採用大宗農產品稻穀和小麥等加工的副產品米糠和麩皮作為培養基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，進行液體發酵，以節約原料成本、減少使用土地和縮短生產周期，但實現這一目標仍需要誘變篩選出在米糠麩皮提取液培養基中適宜生長的灰樹花菌株。因此，為實現上述目的，在自然選育之外，通過不同的生物技術手段對灰樹花菌株進行誘變，篩選出適宜的高產菌株尤為重要。本發明將通過原生質體雷射誘變的方法，以高產多糖為指標，定向高效轉化米糠麩皮提取液為基礎，選育出高產、低成本的灰樹花菌株。通過一系列的穩定性、遺傳性等篩選方法的建立，保證灰樹花的優良性狀，為進一歩大規模利用低成本的米糠和麩皮生產高價值的灰樹花多糖奠定基礎。本發明所採取的技術方案如下
本發明提供一種用於高效發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的灰樹花菌株 Grifola sp. JSU10-2,該灰樹花菌株 Grifola sp. JSU10-2 已經於 2011 年 4 月 7 日保藏在中國武漢的武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC )，保藏菌株編號為CCTCCM2011113，名稱為Cri/bh sp. JSU 10_2。該菌株可以在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液培養基中具有高生長速率和高多糖產量的灰樹花變株；
在本發明的ー個方面中，提供上述灰樹花菌株fri/bh sp. JSU10-2的用途，用於發酵米糠和麩皮提取液複合培養基生產灰樹花多糖。本發明的有益效果
國內外採用原生質體雷射誘變技術選育灰樹花高產菌株鮮見報導，針對不加其他碳源和氮源的米糠麩皮複合培養基進行原生質體雷射的灰樹花誘變選育未見報導，故本發明由實驗室現有的菌株fri/bh sp. CGMCC4179為出發菌株進行原生質體雷射誘變，以生長速率、菌絲乾重和菌絲多糖為指標進行篩選，最終獲得在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液複合培養基中較出發菌株生長速度更快，多糖產量更高的誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10-2，其菌絲乾重和菌絲多糖比已經提交發明專利申請的Cri/bh sp. CGMCC4179菌株又分別提高了 31. 7和32. 6%，同時米糠和麩皮不用酶解處理，節約了酶的使用成本，獲得了顯著的效果。本發明的創新不加其他碳源和氮源的米糠麩皮提取液液複合培養基技術；在Grifola sp. CGMCC4179菌株基礎上，得到在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮未用酶解的提取液複合培養基上生長速度更快、多糖產量更高的誘變新菌株Cri/bh sp. JSU 10-2,使得本發明具有明顯的經濟效益，節約原料成本、減少使用土地和降低生產周期，生產出高價值的具有輔助抗腫瘤治療效果的灰樹花多糖。該方法使用原生質體雷射誘變法誘變並篩選實驗室現有的sp. CGMCC4179灰樹花菌種，進ー步得到具有高生長速率和高多糖產量的突變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2，所得菌株適合在米糠和麩皮未用酶解的提取液複合培養基中快速生長並高產灰樹花多糖，其液體發酵的菌絲乾重和多糖較出發菌株分別提高了 31. 7%和32. 6%。灰樹花多糖具有輔助抗腫瘤治療的價值，使得灰樹花已經成為ー種重要的藥用真菌，但灰樹花多糖大規模生產依然要面對成本高、產量低等一系列問題。基於此，本發明解決了ー個技術問題提供一株在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮未用酶解的提取液複合培養基中生長速度更快、多糖產量更高的灰樹花誘變菌株Grifola sp.JSU 10-2，所述誘變株是由實驗室現有的灰樹花菌株Cri/bh sp. CGMCC4179採用原生質體雷射誘變技術選育，所述誘變株fri/bh sp. JSU 10-2在相同條件下菌絲乾重較出發菌IGrifola sp. CGMCC4179 提高了 31. 7%，多糖產量較出發菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179提高了 32. 6%，並經過拮抗試驗、蛋白電泳譜圖比、酯酶同エ酶電泳譜圖比對和過氧化物酶同エ酶電泳譜圖比對證明誘變後的菌株fri/bh sp. JSU 10-2與出發菌株Cri/bh sp.CGMCC4179遺傳特性和發酵性能不同，從而得到了新的菌株，產生了有益的效果。
圖I為本發明菌株原生質體雷射誘變選育方法的流程 戰2%Grifola sp. JSU 10-2與出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的拮抗圖，其中注左邊為 Cri/b7a sp. JSU 10_2、右邊為出發菌株sp. CGMCC4179 ；
圖3為蛋白電泳譜圖，注I. Marker ；2.出發菌株Grifola sp. CGMCC4179 ；3.Grifola sp. JSU 10-2 ； 4. JSU10-1 (另ー種誘變方法獲得的多糖產量不及本發明Grifola sp. JSU 10-2 的菌株)；
圖4為酯酶同エ酶電泳譜圖，注I.出發菌株fri/bh sp. CGMCC4179 ；2. Grifolasp. JSU 10-2 ；3. JSU10-1 ；
圖5為過氧化物酶同エ酶電泳譜圖，注I.出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179 ；2.Grifola sp. JSU 10-2 ;3. JSU10-1。
具體實施例方式本發明按照說明書附圖I所示的流程，提供了原生質體雷射誘變選育在不加其他碳源和氮源的米糠麩皮複合培養基上具有高生長速率和高多糖產量的灰樹花菌株的方法，所述方法包括下列步驟 取實驗室現有的灰樹花sp. CGMCC4179為出發菌株；
將灰樹花菌株接種於固體斜面培養基上進行恆溫培養；
菌體長成後接種於液體種子培養基中培養得到灰樹花種子液；
將種子液接種於液體發酵培養基中發酵得到灰樹花菌絲體；
純化菌絲體；
製備及純化原生質體；
將上述得到的原生質體懸液在雷射下照射進行誘變後，無光暗培養，一次篩選出生長速率較快、比較穩定的菌株；
在米糠、麩皮液體發酵培養基上進行發酵，二次篩選出高生長速率和高多糖產量的菌
株;
進行穩定性和遺傳性分析與鑑定；
在一個實施方案中，所用的固體斜面培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白腖5g/L，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L，瓊脂20g/L, pH自然。在一個實施方案中，所述恆溫為28°C。在一個實施方案中，所述液體種子培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白腖5g/L,磷酸ニ氫鉀I. 5g/L,硫酸鎂O. 75g/L,維生素B1 10mg/L, pH自然。在一個實施方案中，所述液體發酵培養基為米糠20g/L，麩皮30g/L (米糠、麩皮沸水煮3h後去渣取汁)，磷酸ニ氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.75g/L，維生素BilOmg/し pH自然，250mL錐形瓶中分裝IOOmL培養液，O. IMPa條件下滅菌30min。在一個實施方案中，所述液體發酵培養條件為在250mL三角瓶中裝IOOmL發酵培養基，接種10%，在28°C、150r/min條件下培養七天。在一個實施方案中，所述純化菌絲體方法為用滅菌的紗布過濾收集菌絲，依次用無菌水、O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩定劑多次洗滌，3500r/min離心20min，棄去上清液，用滅菌濾紙吸乾菌絲體水分。在一個實施方案中，所述製備及純化原生質體方法為加酶量按每300mg溼菌絲體加ImL酶解液，室溫下以lOOr/min水浴振蕩酶解3h。酶解結束後，用滅菌的G3砂芯漏鬥過濾除去殘留的菌絲碎片，3000r/min離心IOmin,去上清液,沉澱用滲透壓穩定劑清洗離心兩次後，得到純化的原生質體，將原生質體用滲透壓穩定劑稀釋成懸液數。
在一個實施方案中,所述酶解液為複合植物水解酶Viscozyme L (丹麥諾維信公司生產，對購得的纖維素酶進行濾紙酶活力測定，FPU酶活=1590. 41 IU/mL)，用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩定劑配製成濃度為3%的高滲酶解液，儲存於4°C冰箱中，用之前用滅菌的O. 45 μ m微孔膜過濾除菌。在一個實施方案中，所述原生質體雷射誘變為將所製得的原生質體懸液調整到適當濃度，取ImL原生質體懸液置於I. 8mL凍存管中，在LJL40-HA型氦氖雷射治療機上使凍存管與氦氖雷射光源照射方向垂直，凍存管距光源3cm，照射時間60min。在一個實施方案中，誘變結束後吸取O. 2mL塗布於米糠麩皮再生篩選培養基平板上，在28°C避光再生培養4天。在一個實施方案中，所述無光暗培養所用培養基為米糠麩皮再生平板培養基米糠20g/L (100°C水煮3小時全米糠)，麩皮30g/L (同米糠)，磷酸ニ氫鉀1.5g/L，硫酸鎂
O. 75g/L,維生素B1 10mg/L,瓊脂20g/L,pH自然,用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩定劑配製。在一個實施方案中，所述篩選方法為平板直徑測定法。在一個實施方案中，所述一次篩選步驟為取原生質體雷射照射懸液O. 2ml，用無菌玻璃塗棒均勻地塗滿米糠麩皮篩選培養基平板表面，每批塗4個平皿，待單菌落長成後選10株生長速度快且濃密的誘變菌株接種至新的篩選培養基平板上，在28°C恆溫箱中培養約3天，製備種子液，發酵生產菌絲體，製取新的原生質體懸液，進行第二批誘變。如此連續誘變5批，最後挑選出25株較優良誘變株，對其傳代培養，以菌絲生長速率為指標進行篩選，從中選出4株生長速度相對較快、形狀較好、穩定性較高的變異株。在一個實施方案中，所述二次發酵篩選步驟為一次生長確定的較優良變異株作為二次篩選的對象，與出發菌株一起進行二次發酵篩選從而確定變異株優良性狀穩定表達的菌株。將一次篩選菌株和出發菌株進行搖瓶發酵試驗，連續發酵5代，按指標確定目的誘變株。在一個實施方案中，所述搖瓶為250mL錐形瓶。在一個實施方案中，所述米糠、麩皮液體發酵培養基為米糠20g/L，麩皮30g/L(米糠、麩皮水煮3h取汁)，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L,pH自然。在一個實施方案中，所述指標為菌絲多糖和菌絲乾重。本發明中轉化米糠和麩皮複合原料的灰樹花突變株的分析鑑定方法，所述方法包括下列步驟
種子液形態比對；
穩定性分析；
遺傳性分析。在一個實施方案中，所述為種子液形態比對，將斜面上的出發灰樹花菌株Cri/bhsp. CGMCC4179和Cri/bh sp. JSU 10_2菌株接種到液體種子培養基內，在28°C恆溫震蕩搖床中培養5天，觀察包括液體(清澈度、黏度)、菌球(大小、密度)、菌絲(長度、斷裂現象)和
香味等。在一個實施方案中，所述穩定性分析為以菌絲生長速度為指標考察穩定性,對最終篩選出4株較優的變異菌株，經5次傳代，選出最優的fri/bh sp. JSU 10-2菌株，並與出發菌株sp. CGMCC4179對比。
在一個實施方案中，所述遺傳性分析包括拮抗分析、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子質量(Mr)、酯酶同エ酶同エ酶電泳分析和過氧化物酶同エ酶電泳分析。實施例I灰樹花原生質體雷射誘變 a.滲透壓穩定劑的配製
O.6mol/L的甘露醇。b.酶解液的 配製
複合植物水解酶Viscozyme L(丹麥諾維信公司生產，對購得的纖維素酶進行濾紙酶活力測定，FPU酶活=1590. 41 IU/mL):用O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩定劑配製成濃度為3%的高滲酶解液，儲存於4°C冰箱中，用之前用滅菌的O. 45 μ m微孔膜過濾除菌。c.菌絲的培養和純化
用米糠麩皮培養基作為出發菌株培養基，在250mL三角瓶中裝IOOmL發酵培養基，接種10%,在28°C、150r/min條件下培養七天得菌絲體。用滅過菌的紗布過濾收集菌絲，依次用無菌水、O. 6mol/L的甘露醇滲透壓穩定劑多次洗漆，3500r/min離心20min,棄去上清液,用滅菌濾紙將菌絲體水分吸乾。d.原生質體的製備和純化
加酶量按每300mg溼菌絲體加ImL酶解液，室溫下以100r/min水浴振蕩酶解3h。酶解結束後，用滅菌的G3砂芯漏鬥過濾除去殘留的菌絲碎片，3000r/min離心lOmin，去上清液，沉澱用滲透壓穩定劑清洗離心兩次後，得到純化的原生質體，將原生質體用滲透壓穩定劑稀釋成懸液。e.原生質體雷射誘變
將所製得的原生質體懸液調整到適當濃度，取ImL原生質體懸液置於I. SmL凍存管中，光源照射方向與管體垂直，距凍存管3cm，照射時間60min。誘變結束後吸取O. 2mL塗布於米糠麩皮再生培養基平板上，在28°C避光再生培養4天。f.誘變菌株的篩選
取雷射照射的原生質體懸液O. 2mL，用無菌玻璃塗棒均勻地塗滿米糠麩皮再生篩選培養基平板表面，每批塗4個平皿，待單菌落長成後選10株生長速度快且濃密的誘變菌株接種至新的篩選培養基平板上，在28°C恆溫箱中培養約3天，製備種子液，發酵生產菌絲體，製取新的原生質體懸液，進行第二批誘變。如此連續誘變5批，挑選出25株較優良誘變株，對其傳代培養，以菌絲生長速率為指標進行篩選，從中選出4株生長速度相對較快、形狀較好、穩定性較高的變異株。將上述灰樹花誘變株進行五代平板傳代試驗(以菌絲生長速度為指標考察穩定性)和五代搖瓶發酵試驗(以菌絲多糖、菌絲乾重為指標)，篩選出目的誘變株fri/bh sp.JSU 10-2。表I選出菌株各代生長速度
_各代生長速度(ητη%)_
蓓_號_第—！代第2代第3代第4代第5代
Grifola ψ CCMCC4119 0—348O SI 0^70 O 904
CCTCC M201HB1.000 0.902 0.83 0.882 O 925表2變異菌株各代發酵菌絲體多糖 表3變異菌株各代發酵菌絲乾重
從表中I中看出誘變菌株fri/bh sp. JSU 10-2各代的生長速度均高於出發菌IGrifola sp. CGMCC4179，其生長速度在第三代稍有退化，但並不很明顯，經過適應階段後生長速度有所提高，到第五代生長速度為0.925mm/h，高於出發菌株Cri/bh sp.CGMCC4179。從表2和3中看出誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2菌絲多糖及乾重產量相對穩定，均高於出發菌株，其第五代菌絲多糖和乾重產量分別提高了 28. 9%和12. 9%，菌株於2011年4月15日保藏在位於中國武漢的武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為 CCTCC No:M2011113，名稱為 Cri/bh sp. JSU 10-2。試驗ー變異菌株的分析
I、種子液形態學比對將斜面上的出發灰樹花菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和Cri/bh sp. JSU 10_2菌株接種到液體種子培養基內，在28°C恆溫震蕩搖床中培養5天，觀察包括液體(清澈度、黏度)、菌球(大小、密度)、菌絲(長度、斷裂現象)和香味等現象。結果為變異菌株的種子液與Grifola sp. CGMCC4179差異較大，變異菌株液體清澈度較sp. CGMCC4179差，液體黏度較大；菌球大小比sp. CGMCC4179小，密度比Cri/bh sp. CGMCC4179大；菌絲長度稍短於Cri/bh sp. CGMCC4179，有輕微的斷裂現象；均有濃鬱的令人愉悅的香味。、穩定性分析
以菌絲生長速度為指標考察穩定性，對最終篩選出25株較優的變異菌株，經3次傳代，選出較優的4株菌株，將4株變異菌株進行五代平板傳代試驗(以菌絲生長速度為指標考察穩定性)選出目的菌株Cri/bh sp. JSU 10-2，再將Cri/bh sp. JSU 10-2進行五代搖瓶發酵試驗(以菌絲多糖、菌絲乾重為指標考察穩定性)，從而確定目的誘變株Grifola sp.JSU 10-2的穩定性，其結果已經示於上述表I、表2、表3。誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2各代的生長速度均高於出發菌株，其生長速度在第三代稍有退化，但並不很明顯，經過適應階段後生長速度有所提高，到第五代生長速度為O. 925mm/h，高於出發菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179。誘變菌株 Cri/bh sp. JSU 10-2 菌絲多糖及乾重產量相對穩定，均高於出發菌株，其第五代菌絲多糖和乾重產量分別提高了28. 9%和12.9%。由此可見灰樹花經原生質和雷射誘變後產生的性狀變異可以遺傳。、遺傳性分析(I) 拮抗性分析
把同樣大小的變異菌株和出發菌株sp. CGMCC4179的菌塊接種在同一 PDA平板上，兩菌株相距一定的距離，放在28°C的恆溫培養箱中培養，3d後觀察菌落間的拮抗現象。不同種的食用菌菌絲在生長發育中，菌絲會相互限制對方的生長蔓延，產生拮抗，在交界處形成拮抗線，這就是拮抗現象。拮抗現象不僅在食用菌的不同種間存在，而且在同種但遺傳特性有差異的菌株之間也存在，菌株之間拮抗作用的強弱反映了菌株間遺傳差異性的大小，因此拮抗現象不僅可以用於判斷菌株間的親緣關係，而且可以用於育種，鑑定菌株是否產生變異。本試驗將出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179與變異菌株接於同一平板上產生了一定的拮抗，從說明書附圖2可以看出左邊變異菌株fri/bh sp. JSU 10-2的生長形態發生了一定的變化，其菌絲生長緻密，生長速度明顯快於右邊的出發菌株，且與出發菌株形成了拮抗線，說明了出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和變異菌株Cri/bh sp. JSU10-2產生了遺傳差異性。(2) 電泳分析
電泳分析試驗包含三部分SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子質量(MJ、酯酶同エ酶同エ酶電泳分析和過氧化物酶同エ酶電泳分析。SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子質量(Mr) ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養基上生長並乾燥後的菌絲O. 5g，加6mL緩衝液(內含O. 065mol/L Tris-檸檬酸，pH8.2)，_20°C下冷凍24h，置於研缽中，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(10000r/min, lOmin)，取上清液放於4°C冰箱保存備用(上清液保存時間超過15小時須重
新配置)。②貯液配製
Ars/Bis貯液配製稱取150g丙烯醯胺和4g雙丙烯醯胺置於洗淨烘乾的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用乾淨玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內，盛於棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。I. 5mol/L Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8· 8)貯液:稱取 90. 75 Tris 放入 500mL 燒杯中，加蒸餾水400mL溶解，用lmol/L鹽酸調pH值至8. 8，倒入500mL容量瓶中，加蒸餾水定容到500mL，盛於試劑瓶中放在4 V冰箱中避光保存。0. 5mol/L Tris-HCl 緩衝液(ρΗ6· 8)貯液:稱取 12g Tris 放入 IOOmL 燒杯中，加蒸餾水溶解，用lmol/L鹽酸調pH值至6. 8，倒入200mL容量瓶中，加蒸餾水定容到200mL，盛於試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。10%過硫酸銨稱取0. 5g過硫酸銨溶於50mL重蒸水中，盛於棕色試劑瓶中，現配先用。I X Tris-甘氨酸電極緩衝液貯液稱取3. 025g Tris、18. 75g甘氨酸、IgSDS用於IOOOmL蒸餾水中。IXSDS 上樣緩衝液50mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)、20%SDS、0. 1% 溴酚藍、10% 甘油、IOOmM DTT (現加)，保存於一20°C冰箱。即用時每O. 5 mL上樣緩衝液加O. 0072g DTT。1%溴酚藍溶液稱0. 5g溴酚藍加重蒸水50mL溶於滴瓶內備用。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發。染色液甲醇450mL,冰こ酸IOOmL,雙蒸水450mL,考馬斯亮藍R-250 2. 5g。脫色液冰こ酸75mL，甲醇50M1，加蒸餾水定容道1000mL。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配製(現配先用)
5% 濃縮膠組成為Tris-HCl 緩衝液(pH6. 8) 2. 50mL、Ars/Bis 貯液 I. 7mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 5. 60mL。10% 分離膠組成為Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8· 8)2. 50mL,Ars/Bis 貯液 3. 25mL、10%AP0. 10mL、TEMED4KL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 4. 25mL。
④操作步驟
A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾乾、固定。b.配製分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封於分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恆溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。c.配製濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩衝液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸乾，插點樣梳於兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固後迅速拔出梳子，用ΙΟΟμ 微量注射器抽取電極緩衝液清洗加樣孔。
e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩衝液，然後在下槽內加入電極緩衝液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。f.加樣
樣品預處理取50 μ 上樣緩衝液(現加O. 0072g DTT)和50 μ 樣品液，混勻，於沸水浴中加熱I 2min。進樣用微量注射器吸取樣品預處理液20μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢後靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩壓70V，待溴酚藍進入分離膠後加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結束後，放掉電極緩衝液，鬆開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，並切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置於脫色搖床，室溫染色I 2h。c.脫色傾去染色液，用蒸餾水清晰凝膠幾次，加入脫色液，在脫色搖床上室溫脫色幾次至背景脫淨為止。d.保存脫色完成後將凝I父保存於7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色後的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。Rf = —xl00%
『ち
式中，A為酶帶遷移距離為指示劑遷移距離。圖譜見說明書附圖3。電泳分析結果為
從附圖3蛋白圖譜中可以看出，出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179有10條譜帶，分子量分別為 44，000,36, 900,31, 100,27, 100、21，700、20，600、17，300、16，500、15，500 和
14，200道爾頓，與Cri/bh sp. CGMCC4179相比較變異菌株Cri/bh sp. JSU 10-2在分子量44，000道爾頓位置上譜帶消失，而在分子量40，900道爾頓出現譜帯。說明誘變菌株遺傳特性相對於出發菌株發生了變化。聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析酯酶同エ酶 ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養基上生長並乾燥後的菌絲O. 5g，加6mL緩衝液(內含O. 065mol/L Tris-檸檬酸，pH8.2)，_20°C下冷凍24h，置於研缽中，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(10000r/min, lOmin)，取上清液放於4°C冰箱保存備用(上清液保存時間超過15小時須重
新配置)。
②貯液配製
Ars/Bis貯液配製稱取150g丙烯醯胺和4g雙丙烯醯胺置於洗淨烘乾的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用乾淨玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內，盛於棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。I. 5mol/L Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8· 8)貯液:稱取 90. 75 Tris 放入 500mL 燒杯中，加蒸餾水400mL溶解，用lmol/L鹽酸調pH值至8. 8，倒入500mL容量瓶中，加蒸餾水定容到500mL，盛於試劑瓶中放在4 V冰箱中避光保存。O. 5mol/L Tris-HCl 緩衝液(ρΗ6· 8)貯液:稱取 12g Tris 放入 IOOmL 燒杯中，加蒸餾水溶解，用lmol/L鹽酸調pH值至6. 8，倒入200mL容量瓶中，加蒸餾水定容到200mL，盛於試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。10%AP :稱取0. 5g過硫酸銨溶於50mL重蒸水中，盛於棕色試劑瓶中，現配先用。I X Tris-甘氨酸電極緩衝液貯液稱取3. 025g Tris、18. 75g甘氨酸、IgSDS用於IOOOmL蒸餾水中。IXSDS 上樣緩衝液50mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)、20%SDS、0. 1% 溴酚藍、10% 甘油、IOOmM DTT (現加)，保存於一20°C冰箱。即用時每O. 5 mL上樣緩衝液加O. 0072g DTT。1%溴酚藍溶液稱0. 5g溴酚藍加重蒸水50mL溶於滴瓶內備用。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發。染色液A :稱取IOOmg醋酸-α -萘酯和IOOmg醋酸-β _萘酷，分別用5mL丙酮溶解，溶解後的醋酸萘酯用0. lmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 6. 4)定容至100mL。染色液B 4%的鐵氰化鉀溶液(現配先用)。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配製(現配先用)
5% 濃縮膠組成為Tris-HCl 緩衝液(pH6. 8) 2. 50mL、Ars/Bis 貯液 I. 7mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 5. 60mL。10% 分離膠組成為Tris-HCl 緩衝液(ρΗ8· 8)2. 50mL,Ars/Bis 貯液 3. 25mL、10%AP
0.10mL、TEMED4KL、20%SDS 50μ 、雙蒸水 4. 25mL。④操作步驟 A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾乾、固定。b.配製分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封於分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恆溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。
c.配製濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩衝液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸乾，插點樣梳於兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固後迅速拔出梳子，用ΙΟΟμ 微量注射器抽取電極緩衝液清洗加樣孔。e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩衝液，然後在下槽內加入電極緩衝液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。f.加樣 樣品預處理取50 μ 上樣緩衝液(現加O. 0072g DTT)和50 μ 樣品液，混勻。進樣用微量注射器吸取樣品預處理液20μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢後靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩壓70V，待溴酚藍進入分離膠後加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結束後，放掉電極緩衝液，鬆開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，並切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液A至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置於脫色搖床，37°C保溫染色15 20min，棄去染色液A，用蒸餾水稍加漂洗，再用染色液B染色，直至顯出酶帯，待酶帶清晰後用蒸餾水衝洗乾淨。C.保存染色完成後將凝膠保存於7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色後的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。電泳分析結果為
從附圖4酯酶同エ酶圖譜可知，出發菌株Grifola sp. CGMCC4179和誘變菌株Grifolasp. JSU 10-2均有2條譜帶，位置分別為-.Rn=O. 292，Rf2=Q. 580。即誘變菌株JSU10-1相比出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的譜帶位置沒變，且酶帶條數也沒有變化，但誘變菌株Grifola sp. JSU 10-2 在/ =0· 292 處的酶帶比出發菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179 略深，在/^=O. 580處的酶帶比出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179略淺，即誘變後與誘變前菌株的酶活性不同，說明誘變菌株遺傳特性相對於出發菌株發生了變化。聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析過氧化物酶同エ酶 ①蛋白提取
稱取米糠麩皮培養基上生長並乾燥後的菌絲O. 5g，置於預先在冰浴中冷卻的小研缽中，加樣品提取液(pH8. OTris-HCl緩衝液)6mL，冰浴下研磨成糊狀，4°C下離心(IOOOOr/min, lOmin)，取上清液放於4°C冰箱保存備用(上清液保存時間超過15小時須重新配置)。②貯液配製Ars/Bis貯液配製稱取150g丙烯醯胺和4g雙丙烯醯胺置於洗淨烘乾的燒杯中，カロ300mL重蒸水，用乾淨玻璃棒攪勻溶解，將溶液定容在500mL容量瓶內，盛於棕色瓶中放在4 °C冰箱中避光保存。Tris-HCl緩衝液(pH8. 9)貯液稱取36. 8gTris放入燒杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mLlmol/L HCl調pH值至8. 9後，定容至IOOmL,盛於試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。Tris-HCl緩衝液(pH6. 7)貯液稱取5. 98gTris放入燒杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mLlmol/L HCl調pH值至8. 9後，定容至IOOmL,盛於試劑瓶中放在4°C冰箱中避光
保存。 10%AP :稱取O. 5g過硫酸銨溶於50mL重蒸水中，盛於棕色試劑瓶中，現配先用。O. 04g/L核黃素溶液稱取4mg核黃素溶於IOOmL重蒸水中，盛於棕色試劑瓶中，放入4°C冰箱，可保存一周。IOXTriS-甘氨酸電極緩衝液貯液(pH8. 3):稱取6g Tris、28. 8g甘氨酸用無離子水定容到IOOOmL,用時稀釋10倍。40%蔗糖溶液稱取蔗糖40g，加無離子水定容到IOOmL，4°C冰箱中避光保存。樣品提取液(pH8. OTris-HCl緩衝液):稱取12. Ig Tris加無離子水溶解，用Imol/L HCl調pH值至8. O後，定容至IOOOmL,盛於試劑瓶中放在4°C冰箱中避光保存。0. 2%溴酚藍溶液稱取0. 2g溴酚藍溶於IOOmL無離子水中，放在4°C冰箱中保存。TEMED溶液直接用原液，小瓶分裝，避免揮發。染色液(聯苯胺染色液)稱取0. Ig聯苯胺溶於5mL無水こ醇中，加I. 5mol/LNaAc溶液IOmL, I. 5mol/LHAc溶液IOmL,蒸餾水70mL，用前滴加H2O2原液5滴(約250 μ L)。保存液7%的醋酸溶液。③凝膠配製(現配先用)
濃縮膠組成為=Tris-HCl 緩衝液(pH6. 7)0. 625mL、Ars/Bis 貯液 0. 7mL、10%AP 0. 25mL、TEMED1(^L、0. 04g/L 核黃素溶液 lmL、雙蒸水 2. 7mL。分離膠組成為Tris-HCl緩衝液(pH8. 9) I. 8mL、Ars/Bis 貯液 3. 5mL、10%AP0. 15mL、TEMED6PL、0. 04g/L 核黃素溶液 2mL、雙蒸水 7. 7mL。④操作步驟 A.電泳
a.將玻璃板洗浄、晾乾、固定。b.配製分離膠，將分離膠注入玻璃板夾層中至玻璃板上端約Icm處，緩緩注入約ImL正丁醇封於分離膠之上，保持膠面平整。放在37°C恆溫條件下靜止30-60min，直到分離膠層與正丁醇之間形成平直清晰的界面。c.配製濃縮膠，傾斜倒出分離膠表面正丁醇(也可用濾紙吸取)，以濃縮膠緩衝液淋洗分離膠上端空腔2 3次，吸乾，插點樣梳於兩玻璃板夾縫中，灌注濃縮膠，沒過梳子。d.室溫放置約60min，待濃縮膠凝固後迅速拔出梳子，用100μ 微量注射器抽取電極緩衝液清洗加樣孔。e.將凝膠連同玻璃板從制膠器上取下，放入電泳儀下槽，先將上槽加入電極緩衝液，然後在下槽內加入電極緩衝液(最高可至距平玻璃板上沿3mm處)。
f.加樣
樣品預處理取一定量的樣品液和等量的40%蔗糖溶液混合，加總體積1/5的O. 2%的溴酚藍溶液(作為指示劑)，混勻。進樣用微量注射器吸取樣品預處理液30μ ，插入樣品槽底部膠面上，推動樣品液進入樣品小槽底部，加樣畢，輕輕抽出進樣器。g.電泳
加樣完畢後靜止3min，使樣品完全沉入樣品槽底部，打開電源，開始穩壓70V，待溴酚藍進入分離膠後加大電壓至120V，待溴酚藍指示劑達到分離膠底部邊緣上約O. 5^1cm吋，即刻停止電泳。
B.檢測蛋白
a.剝膠電泳結束後，放掉電極緩衝液，鬆開斜插板，取出玻璃膠室，在兩塊玻璃下角空隙內用刀片背面輕輕撬動，除去濃縮膠，取出凝膠，並切角做記號。b.染色凝膠放入染色盤中，加適量染色液至液面完全覆蓋凝膠，將染色盤置於脫色搖床，37°C保溫染色30min，待酶帶清晰後倒去染色液，用蒸餾水衝洗乾淨。c.保存染色完成後將凝膠保存於7%的醋酸溶液中。⑤電泳圖譜分析
染色後的膠板用卡尺測量指示劑及各條酶帶的遷移距離，按式計算遷移率Rf值。4='χ100%
χ2
式中，A為酶帶遷移距離為指示劑遷移距離。圖譜見說明書附圖5。電泳分析結果為
從附圖5過氧化物酶同エ酶圖譜可知，出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179和誘變菌IGrifola sp. JSU 10_2均有2條譜帶，位置分別為Wi7=O. 226，/ 〃=. 555。即誘變菌株Grifola sp. JSU 10_2相比出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的譜帶位置沒變，且酶帶條數也沒有變化，但誘變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2在/ Λ=0. 226和/^=O. 555處的酶帶比出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179都淺，即誘變後與誘變前菌株的酶活性不同，說明誘變菌株遺傳特性相對於出發菌株發生了變化。試驗ニ突變菌株Cri/bh sp. JSU 10-2 和出發菌株 Cri/bh sp. CGMCC4179 產量比較
液體發酵培養基為米糠120g/L，麩皮120g/L，米糠、麩皮常壓下95°C浸提3h後，去渣取汁，磷酸ニ氫鉀O. 2g/L,硫酸鎂O. lg/L,維生素Bpmg/L, pH自然。O. IMPa條件下滅菌30mino液體種子培養基為馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白腖5g/L，磷酸ニ氫鉀I. 5g/L，硫酸鎂O. 75g/L，維生素B1 10mg/L, pH自然。裝樣量為發酵罐容積的80%，培養溫度為28°C，通風量為裝罐液體體積/mim，攪拌速度150r/min，罐表壓O. 05MPa,接種量8%，培養時間4d。稱重法測定菌絲乾重，苯酚硫酸法測定菌絲多糖。將液體培養所得的菌絲體經離心分離後，再用蒸餾水洗滌3次，以除去菌絲體表面所黏附的培養液，放入鼓風乾燥箱中，在60°C條件下乾燥至恆重，經稱量即得菌絲乾重。向烘乾的菌絲中加入一定體積蒸餾水，經研磨後，在80°C水浴中浸提3h,3000r/min離心取上清液，Sevage法脫蛋白後,再用3倍體積的95%的こ醇溶液醇沉提取胞內多糖，採用苯酚硫酸法測定菌絲多糖。試驗結果為(I)突變菌株Cri/bh sp. JSU 10_2和出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179在相同條件和培養基中發酵，菌絲乾重分別為10. 8g/L和8. 2g/L，突變菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌絲乾重較出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179發菌株的菌絲乾重提高了 31. 7%。(2)突變菌lGrifola sp. JSU 10_2和出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179在相同條件和培養基中發酵，菌絲多糖分別為I. 262g/L和O. 952g/L，突變菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌絲多糖較出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179的菌絲多糖提高了 32.6%。發酵試驗表明，突變菌株 Grifola sp. JSU 10-2和出發菌株Cri/bh sp. CGMCC4179相比，發酵性能發生了變化。
權利要求
1.用於發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的菌株Grifolasp. CCTCCM2011113。
2.權利要求I所述的灰樹花菌菌株sp.)的用途,其特徵在於用於由米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖。
全文摘要
本發明屬於微生物應用技術和食品生物技術領域，公開了用於發酵米糠和麩皮提取液生產灰樹花多糖的菌株。該灰樹花菌株已經於2011年4月7日保藏在中國武漢的武漢大學內中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株編號為CCTCCNo:M2011113，名稱為Grifolasp.JSU10-2。本發明通過原生質體雷射誘變，得到了利用廉價原料高產菌絲多糖的菌株，該菌株和原始菌株分別液體發酵米糠和麩皮複合培養基，誘變菌株的菌絲乾重和多糖分別比原始菌株提高了31.7%和32.6%。
文檔編號C12N1/14GK102816701SQ201110150888
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月7日 優先權日2011年6月7日
發明者劉偉民, 郭春梅, 張建, 徐立平, 顧慧敏, 任曉鋒, 李永轉, 張志才, 崔鳳傑, 趙傑文, 沈國棟 申請人:江蘇大學