利用枯草桿菌發酵生產d-核糖的方法
2023-08-01 18:45:41 1
專利名稱：：利用枯草桿菌發酵生產d-核糖的方法利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術中利用發酵的方法合成所需要的化合物的
技術領域：
，具體地說，是一種利用枯草桿菌(^3G'W^^Z^j7i's)發酵生產D-核糖的方法。
背景技術：
：D-核糖是一種具有重要生理生化功能的五碳糖，廣泛存在於動物、植物和微生物的細胞中，是生物體內遺傳物質，如核糖核酸(RNA)、若干輔酶和維生素的組成部分。D-核糖具有巨大的經濟價值，被廣泛地應用於食品、醫療和製藥領域①可用於生產飼料添加劑和食品調味品；②是合成維生素B2的重要原料；③可在臨床上用於治療心肌缺血、糖尿病、肌肉疼痛等病症；④被用於生產抗病毒和抗癌的藥物等等。隨著行業的發展和應用研究的深入，D-核糖將在食品和醫療行業發揮越來越重要的作用。D-核糖的生產方法主要有三種水解法、化學合成法和微生物發酵法。(1)水解法。它是從酵母細胞中提取核糖核酸(RNA)，然後水解得到D-核糖的一種方法。這種方法的成本高、收率低，不適宜工業化大規模生產。(2)化學合成法。是通過化學轉化，將D-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸、D-木糖、L-穀氨酸、D-葡萄糖轉化成D-核糖的一種方法。採用汞電極電解還原核糖酸-Y-內脂生產D-核糖，可應用於工業化的大規模生產，當原料濃度為180g/L時，D-核糖濃度可達到90120g/L。但是，這種方法由於使用汞電極，容易造成環境的汙染，在人類重視保護生存環境、注重社會可持續發展的今天，它已屬被淘汰的技術。(3)微生物發酵法。通常是以葡萄糖為碳源，利用轉酮醇酶缺陷菌株發酵生產D-核糖的一種方法，它成本低、汙染小、適合於工業化大規模生產的要求。目前，對利用微生物發酵生產D-核糖已有諸多報導，研究過的碳源種類包括葡萄糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘油、乙酸、乙醇、葡萄糖酸等等，研究過的氮源包括酵母膏、蛋白腖、酪蛋白、尿素、胺基酸、玉米槳等；其中，以葡萄糖為碳源，以玉米漿為氮源的培養基應用的最為廣泛。例如如Kishimoto等人利用轉酮酶缺陷型短小芽孢桿菌(A/"yzw7AATCC21951)，以200g/l葡萄糖、26g/l玉米漿為培養基進行發酵，得到92.0g/1的D-核糖，得率為0.552mol/mo1(見日本專利(JP)4，904，587〕。又如鄧崇亮等人選育得到莽草酸和次黃嘌呤雙營養缺陷型A^/力^7"No.271，以209g/l初糖為培養基進行發酵，獲得96.4g/1的D-核糖，得率達到0.553mol/mol(見微生物學通報24:214-217，1997)。再如DeWulf利用轉酮醇酶缺陷的枯草芽孢桿菌ATCC21951，以100g/l葡萄糖和50g/l葡萄糖酸為混合碳源進行發酵，得到45g/l的D-核糖，得率為O.37mol/mol(J.Appl.Microbiol.83:25-30，1997);以100g/l葡萄糖和100g/l木糖為混合碳源進行發酵時，得到60g/lD-核糖(J.Ind.Microbiol.17:104-109，1996)。儘管人們多年來對利用微生物發酵生產D-核糖進行了大量的研究，但是，目前使用的方法依然存在著發酵周期長、得率低的缺點。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種利用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌發酵生產D-核糖的方法，使D-核糖的得率有明顯的提高。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產D-核糖的方法，其具體的步驟為(1)菌株的選擇，選用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌為菌株；(2)菌種培養，將轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌菌株接入種子培養基活化，得到種子液；(3)配製發酵培養基，以葡萄糖為碳源並添加有機酸；(4)將步驟(2)獲得的種子液接入步驟(3)配製的發酵培養基進行發酵。步驟(3)所說的有機酸為短鏈有機酸。所說的短鏈有機酸包括檸檬酸、乳酸或其可溶性鹽。檸檬酸的添加濃度為0.20.55g/l。乳酸的添加濃度為37g/l。本發明利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法的積極效果是(1)選用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌為菌株，在以葡萄糖為碳源的發酵培養基中添加了有機酸，使D-核糖的產量增加達29.2%，得率增加達34.8%。(2)克服了發酵過程中D-核糖得率低的問題，使D-核糖的得率達到0.67mol/mol，遠高於現有技術的水平。(3)發酵液中的副產物減少，有利於D-核糖的分離提取。(4)對發酵代謝過程的控制簡單易行，易於產業化。具體實施方式以下通過實施例對本發明利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法作進一步說明，提供6個實施例，但本發明的保護範圍不限於以下的實施例。實施例l一種利用枯草芽孢桿菌發酵生產D-核糖的方法，其具體的步驟為(1)選用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌為菌株；(2)菌種培養，A、將冷凍保存的轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌EC2甘油懸液接於斜面培養基，於恆溫培養箱中37。C培養40小時；斜面培養基的組分為山梨醇5g/1、蛋白腖IOg/1、NaCl2g/1、酵母膏2g/1、KH2P04lg/l、K2HP042g/l、瓊脂20-22g/1，去離子水配製，pH7.07.2。B、在無菌條件下，將兩接種環斜面菌種接入裝有已滅菌的20ml種子培養基的250mL搖瓶中，於220rpm的搖床上37。C培養47小時，作為一級種子；種子培養基的組分為一水葡萄糖20g/1、KH2P04lg/l、K2HP043g/l、酵母膏3g/1、蛋白腖10g/1，自來水配製，pH6.87.0。C、按照10%的接種量將7.5mL的一級種子液，接入裝有己滅菌的67.5mL種子培養基的500mL搖瓶中，於220rpm的搖床上37。C培養9小時，得到二級種子。(3)配製發酵培養基，其組分為一水合葡萄糖180g/l、玉米漿27g/l、(NH4)2S049g/l、CaC0320g/l、MnS04H200.05g/l、MgS040.05g/l，自來水配製，pH6.0。(4)將2.5ml二級種子液接入裝有25ml發酵培養基的250ml搖瓶中，於220rpm的搖床上37。C培養70小時。發酵結束後，發酵液中的菌體乾重為4.93g/l，D-核糖濃度為41.1g/l，對葡萄糖得率為0.333mol/mol。實施例2按照實施例1所述的方法進行搖瓶發酵，但在實施例1所述的發酵培養基中分別添加了0.2g/l、0.3g/l、0.55g/l的檸檬酸，構成三組實驗組，發酵70小時後，與實施例1的發酵結果進行對比，結果見表l:表1tableseeoriginaldocumentpage6實驗結果:添加所示量的檸檬酸能提高轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌在發酵過程中D-核糖的產量與得率，其中尤以添加0.3g/l檸檬酸時D-核糖產量增加最多，比對照組產量增加10.7%，得率增加10.8%。實施例3按照實施例1所述的方法進行搖瓶發酵，但在實施例1所述的發酵培養基中分別添加了3g/l、4g/l、6g/l、7g/1的乳酸，構成四組實驗組，發酵70小時後，與實施例1的發酵結果進行對比，結果見表2:表2添加乳酸濃度菌體乾重耗葡萄糖核糖對葡萄糖得率g/1g/1g/1g/1(mol/mol)04.9314841.10.33335.4014843.20.35045.5114844.70,36265.5614850.30.40875.6314444.60.372實驗結果添加所示量的乳酸能提高轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌在發酵過程中D-核糖的產量與得率，其中尤以添加6g/l乳酸時D-核糖產量增加最多，比對照組產量增加22.4%，得率增加22.5%。實施例4按照實施例1所述的方法製得二級種子液150mL。將二級種子液接入裝有2.5L發酵培養基的5L發酵罐中進行發酵，初始通氣量1.6vvm，初始攪拌速率為600rpm，控制pH值為6.0，在37。C條件下恆溫培養，通過調節通氣量和攪拌轉速控制溶氧不低於30%，以葡萄糖完全消耗作為發酵的終點。結果，發酵在39.5小時結束，最終獲得的菌體乾重達到11.3g/l，D-核糖產量為70.9g/l，得率為0.497mol/mol;發酵液中主要的副產物為葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸濃度為27.5g/1，乙酸濃度為12.3g/l。實施例5按照實施例4所述的方法採用5L發酵罐發酵生產D-核糖，但在發酵培養基中添加0.3g/1檸檬酸，以葡萄糖完全消耗作為發酵的終點。結果，發酵在42.5小時後結束，最終獲得的菌體乾重為10.6g/l，D-核糖產量為83.4g/l，得率為0.587mol/mo1，發酵液中主要的副產物為葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸濃度為25.5g/1，乙酸濃度為8.70g/l;與實施例4不添加檸檬酸的發酵培養基生產結果對比D-核糖產量增加了17.6%，得率增加了18.1%，副產物葡萄糖酸和乙酸的濃度分別降低了7.3%和29.3%。實施例6按照實施例4所述的方法採用5L發酵罐發酵生產D-核糖，但在發酵培養基中添加6g/1乳酸，以葡萄糖完全消耗作為發酵的終點。結果，發酵在54.4小時後結束，最終獲得的菌體千重為10.4g/l，D-核糖產量為91.5g/l，得率為0.671mol/mo1，發酵液中主要的副產物為葡萄糖酸和乙酸，其中，葡萄糖酸濃度為13.3g/l，乙酸濃度為l.18g/l;與實施例4不添加乳酸的發酵培養基生產結果對比D-核糖產量增加了29.2%，得率增加了34.8%，副產物葡萄糖酸和乙酸的濃度分別降低了51.7%和90.0%。結論(1)選用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌為菌株來生產D-核糖，在以葡萄糖為碳源的發酵培養基中添加有機酸，如檸檬酸或乳酸，可明顯增加D-核糖的產量，提高D-核糖的得率。(2)檸檬酸的添加量以0.3g/1為最佳。(3)乳酸的添加量以6g/1為最佳。權利要求1、一種利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其具體的步驟為(1)菌株選用轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌；(2)種子培養，將轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌菌株接入種子培養基活化，得到種子液；(3)配製發酵培養基，以葡萄糖為碳源並添加有機酸；(4)將步驟(2)獲得的種子液接入步驟(3)配製的發酵培養基進行發酵。2、根據權利要求1所述的利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其特徵在於，步驟(3)所說的有機酸為短鏈有機酸。3、根據權利要求2所述的利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其特徵在於，所說的短鏈有機酸包括檸檬酸、乳酸或其可溶性鹽。4、根據權利要求3所述的利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其特徵在於，檸檬酸的添加濃度為0.20.55g/l。5、根據權利要求3所述的利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其特徵在於，乳酸的添加濃度為37g/1。全文摘要本發明利用枯草桿菌發酵生產D-核糖的方法，其具體步驟包括(1)將轉酮醇酶缺陷型枯草芽孢桿菌生產菌株接入種子培養基活化，得到種子液；(2)配製以葡萄糖為碳源的發酵培養基，並添加有機酸，如檸檬酸或乳酸；(3)將種子液接入發酵培養基進行發酵。本發明的積極效果是能明顯增加D-核糖的產量，提高得率；發酵液中的副產物減少，有利於D-核糖的分離和提取；對發酵代謝過程的控制簡單易行，易產業化。文檔編號C12P19/00GK101338331SQ20081004114公開日2009年1月7日申請日期2008年7月29日優先權日2008年7月29日發明者勤葉,琳吳,李志敏申請人:華東理工大學