一種高活力纖維素酶和飼料蛋白的聯產發酵方法
2023-08-02 06:30:31 1
專利名稱：一種高活力纖維素酶和飼料蛋白的聯產發酵方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地涉及一種利用農業廢棄物(玉米芯、水稻秸稈) 發酵聯產高活性纖維素酶和飼料蛋白的方法。
背景技術：
我國是農業大國，農業纖維素廢棄物的來源廣泛，主要有玉米秸稈、稻草、麥稈、玉 米芯等，其中絕大部分被直接燃燒，不僅浪費資源，而且造成環境汙染。利用生物技術開發
農業纖維素廢棄物資源，生產高附加值產品，不但具有重要的經濟意義，同時具有環境效益
O利用纖維素酶將農業纖維素廢棄物轉變成生產和生活中所需的物質是非常有效 的手段。纖維素酶是一類複雜的酶系，它們協同作用，催化纖維素轉化為葡萄糖。根據纖維 素酶的底物、作用位點和釋放的產物，將纖維素酶分為三類，內切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶 和葡萄糖苷酶[2]。纖維素酶在工農業許多領域有著廣泛的應用。在食品工業中，纖維 素酶可應用在果蔬菜飲品的生產，啤酒麥芽糖濃度的提高，飼料的營養價值的提高中；在紙 漿和造紙工業，利用纖維素酶進行粗燥紙漿的生物修飾，可以增加紙的韌性和白度；在洗滌 工業，纖維素酶也被廣泛用作洗滌添加劑，增強洗滌效果；在生物能源開發中，纖維素酶起 了關鍵的作用，利用高活性的纖維素酶將纖維素水解生成可發酵糖，再進一步轉化為乙醇。目前，國內關於纖維素酶發酵生產已經進行有大量的研究和應用，但也存在一些瓶頸問 題(1)國內纖維素酶的生產主要採用固體發酵法。該法雖然具有投入低、工藝簡單的 優點，但是也存在自動化程度低、勞動強度大、產品質量不穩定等局限性Μ。因此，隨著液體 發酵工藝的不斷進步，採用液體發酵法生產纖維素酶是必然的趨勢。(2)利用現有的技術生產出的纖維素酶活力還有待提高，酶系組成還有待完善。一 般生產用的菌株是木黴屬真菌，這類真菌生產的纖維素酶系組成不完全，雖然具有很高的 內切葡聚糖酶活性，但是往往葡萄糖苷酶活力偏低，這樣的特點會使其應用受到一定 的限制[5]。(3)在纖維素酶的生產發酵及酶解體系中，往往會有大量葡萄糖的積累。這些積累 的葡萄糖會對纖維素酶的發酵和酶解過程產生分解代謝產物的阻遏和反饋抑制，從而影響 纖維素酶的產量和酶活。如何及時消除大量葡萄糖的積累也是酶生產中面臨的瓶頸[6]。飼料蛋白即單細胞蛋白，又稱微生物蛋白或者菌體蛋白，是指酵母菌、真菌、黴菌、 及非病性細菌等單細胞生物體內所含的蛋白質[7]。一般具有蛋白含量較高，各類胺基酸搭 配合理、種類齊全，維生素和微量元素豐富，不含膽固醇等優點，而這些優勢都是一般農作 物飼料所不能比擬的。隨著養殖業的快速發展與飼料資源不足的矛盾日趨嚴重，單細胞蛋 白飼料添加劑的需求量正日益增大[8]。生產飼料蛋白可利用多種工業廢液、農副產品加工 下腳料以及植物纖維素。馬旭光等人利用玉米秸稈為基料生產酵母飼料，並篩選得到了一 株能在玉米秸稈水解液中生長且高產單細胞蛋白的釀酒酵母菌株[9]。莊桂等人研究了以醋渣為主要原料，經酵母固態發酵生產蛋白飼料，提高了醋渣蛋白含量_。利用各類植物秸 稈、木屑等廢棄物的纖維素資源主要是生產黴菌菌體蛋白。一般是利用麴黴、木黴、青黴、根 黴、毛黴等發酵或者與酵母菌進行混菌發酵。李日強等人利用黑麴黴進行固態發酵玉米秸 稈生產飼料蛋白，其SCP轉化率達到23% [11]。吳萍等人以甘蔗渣為唯一碳源，對釀造酵母、 產黃青黴進行混菌組合的培養生產飼料蛋白，其粗蛋白含量可達22. 4 % [12]。楊國農等人以 甜菜渣為原料，對固態發酵製備菌體蛋白飼料進行了研究。將纖維素酶水解法替代常規的 黑麴黴發酵法進行原料的預處理，其粗白質質量分數達到21% [13]。雖然我國在飼料蛋白的 開發和生產中進行大量的工作。但是在實際生產應用過程中，也存在一些問題，如單獨發酵 法存在種子培養基消耗多、接種量大、發酵時間較長、投資與生產成本較高等不足；混菌發 酵工藝中，由於纖維素酶酶系不完整，產糖量相對較低，抑制了酵母菌的生長，從而影響飼 料蛋白的品質；國內採用的固態發酵法自動化程度低、勞動強度大、產品質量不穩定、飼料 蛋白中粗蛋白的含量不是很高。這些限制性因素制約著我國飼料蛋白工業的發展，傳統的 飼料蛋白的發酵工藝相比，本發明的優點如下(1)聯產所得的纖維素酶液具備較高酶活力，其內切葡聚糖酶活力可達265. 7U/ mL ；而且擁有較完整的酶系組成，其β-葡萄糖苷酶活力可達到191.4U/mL，能有效提高該 纖維素酶液的水解糖化能力；(2)所得飼料蛋白不僅蛋白含量高，其粗蛋白含量可達39%以上；並且經國家飼 料質量監督檢驗中心檢測結果表明，該飼料蛋白無毒無害，營養豐富。(3)本方法採用分期聯產發酵技術，在產酶發酵的中後期接入經馴化的產脘假絲 酵母LW05不僅能利用發酵及酶解過程中產生的葡萄糖進行生長，積累大量的菌體蛋白；同 時也消除了發酵液中葡萄糖對纖維素酶生產及酶解過程的反饋抑制效應，提高了纖維素酶 的產量及酶活力。參考文獻[1]李日強，席玉英.纖維素類廢棄物的綜合利用[J].中國環境科學.2002， 22(001) 24-27.[2] Lynd L R, Weimer P J, van Zyl W H, et al. Microbial Cellulose Utilization !Fundamentals andBiotechnology[J]. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002, 66(3) :506-577.[ 3 ] Sukumaran R K, Singhania R R, Pandey A. Microbial cellulases-Production, applications andchallenges[J].[4]劉凱，林建強，曲音波.纖維素酶生產技術[J].生物產業技術.2008,4.[5]Wen Z， Liao W， Chen S.Production of cellulase/[beta]-glucosidase by the mixed fungi cultureTrichoderma reesei and Aspergillus phoenicis on dairy manure[J]. Process Biochemistry. 2005,40(9) :3087_3094·[6]Kang S W，Ko E H，Lee J S，et al. Over-production of β -glucosidase by Aspergillus nigermutant from lignocellulosic biomass [J]. Biotechnology Letters. 1999,21(8) :647-650.[7] Chae S R，Hwang E J，Shin H S. Single cell protein production of Euglena gracilis and carbondi ox i de fixation in an innovative
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發明內容
本發明的目的在於提供一種生產工藝簡單、成本低廉、經濟環保的利用農業纖 維素廢棄物發酵聯產高活性纖維素酶和飼料蛋白的方法。為了達到上述目的，本發明採 用的發酵菌株為選育的黑麴黴FL26 (Aspergillus niger FL26)和馴化的產脘假絲酵母 LW05 (Candida utilisLW05)，以農業纖維素廢棄物為原料，發酵聯產高活力纖維素酶和優 質飼料蛋白，包括以下步驟1.菌種活化將2株優選得到的菌株分別接種於PDA固體活化培養基，30°C恆溫 培養3天。將經PDA固體培養基活化後的黑麴黴FL26和產脘假絲酵母LW05分別接入液體 活化培養基I和液體活化培養基II中，30°C、180r/min通氣培養48h。PDA固體活化培養基馬鈴薯汁(將200g馬鈴薯去皮切塊，加適量蒸餾水浸煮，用 紗布過濾)，葡萄糖20g,瓊脂20g,加水至IOOOmL,自然pH。種子活化培養基I 葡萄糖10g，蛋白腖lg，無機鹽營養液1L。種子活化培養基II 蔗糖30g，NaNO3 2g，無機鹽營養液1L。無機鹽營養液(NH4)2SO46g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2O. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸溜水 1L。2.發酵工藝先將經種子活化培養基I活化的黑麴黴FL26液體種子培養液，按照 液體發酵培養基體積10%的接種量接入液體發酵培養基，30°c、180r/min通氣培養4天。 再以原液體發酵培養基體積10%的接種量接入產脘假絲酵母LW05液體種子培養液，30°C、 180rpm繼續通氣培養2天。液體發酵培養基玉米芯(粉碎後60目過篩)20g，水稻秸稈(粉碎後60目過 篩)10g，酵母粉20g，無機鹽營養液1L，自然pH。3.產物分離將所得到的發酵終產物進行超濾處理，截留分子量為20kD，超濾時 間24h，得到的濾液即為纖維素酶液，固體殘渣用乾燥機或壓濾機脫水乾燥，粉碎後製得飼 料蛋白。4.纖維素酶製劑的生產
(1)取經超濾獲得的酶液，先加50%飽和度的硫酸銨，4°C靜置12h，IlOOOrpm離心 30min,棄去沉澱，然後補加硫酸銨至飽和度80 %，4°C靜置12h，1 IOOOrpm離心60min，收集 沉澱。用PH4. 8的醋酸緩衝液重新溶解該沉澱，得到濃縮酶液。(2)採用S^hadex G200凝膠層析除去酶液中的鹽類並對酶液進行分離純化，洗 脫速度為0. 5mL/min，可分別得到高活力的內切葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶。
圖1.混菌6天發酵聯產纖維素酶及飼料蛋白曲線圖2.高活力纖維素酶和飼料蛋白的聯產發酵工藝流程圖
具體實施例方式以下將結合附圖和具體實例對本發明作進一步說明。實施例1 發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白1.發酵原料的預處理及發酵培養基的製備用粉碎機將玉米芯、水稻秸稈粉碎，用60目過篩，烘乾備用。配製液體發酵培養基，其成分為玉米芯(粉碎後60目過篩)20g，水稻秸稈(粉 碎後60目過篩)10g，酵母粉20g，無機鹽營養液1L。121°C，0. IMpa滅菌30min。2.菌種及活化(1)菌種產高活力纖維素酶菌株Aspergillus niger FL26高產單細胞蛋白菌株Candida, utilis LW05(2)菌種活化將2株優選得到的發酵菌株分別接種於PDA固體活化培養基，30°C恆溫培養3天。 將經固體平板活化後的黑麴黴FL26和產脘假絲酵母LW05菌株分別接入液體活化培養基I 和液體活化培養基II中，30°C、180rpm通氣培養48h。PDA固體活化培養基馬鈴薯汁(將200g馬鈴薯去皮切塊，加適量蒸餾水浸煮，用 紗布過濾)，葡萄糖20g,瓊脂20g,加水至IOOOmL,自然pH。種子活化培養基I 葡萄糖10g，蛋白腖lg，無機鹽營養液1L。種子活化培養基II 蔗糖30g，NaNO3 2g，無機鹽營養液1L。無機鹽營養液(NH4)2SO46g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2 0. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸溜水 1L。3.發酵工藝先將經活化的黑麴黴FL26液體種子，按照液體發酵培養基體積10%的接種量接 入液體發酵培養基，30°C、ISOrpm通氣培養4天。再以原液體發酵培養基體積10%的接種 量接入產脘假絲酵母LW05液體種子，30°C、ISOrpm再通氣培養2天。液體發酵培養基玉米芯(粉碎後60目過篩)20g，水稻秸稈(粉碎後60目過 篩)10g，酵母粉20g，無機鹽營養液1L。發酵過程中內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和發酵殘渣粗蛋白的含量變化，如圖1 所示。發酵至第6天時，所得內切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶的酶活力及飼料蛋白的粗蛋白 含量均處於較高水平，分別為265. 7U/mL、191. 4U/mL和39. 1 %。混菌發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的工藝流程，如圖2所示。實施例2 纖維素酶製劑的生產1.產物分離將按照實施例1所得到的發酵6天終產物進行超濾處理，截留分子 量為20kD，超濾時間24h，得到的濾液即為纖維素酶液。2.濃縮酶液取經超濾獲得的酶液，先加50%飽和度的硫酸銨，4°C靜置12h， IlOOOrpm離心30min，棄去沉澱，然後補加硫酸銨至飽和度80%，4°C靜置12h，IlOOOrpm離 心60min，收集沉澱。用適量pH4. 8的醋酸緩衝液溶解該沉澱，得到濃縮酶液。3.分子篩層析收集所得濃縮酶液，採用Si^phadex G200凝膠柱層析，洗脫速度為 0. 5mL/min。通過分子篩凝膠層析，既可除去酶濃縮液中的鹽類(硫酸銨)，同時也可從濃縮 酶液中分離得到高活力內切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。經過酶學性質的研究，其中內切 葡聚糖酶的最適反應溫度為60°C，最適反應pH為4. 0 ； β -葡萄糖苷酶的最適反應溫度為 600C，最適反應ρΗ為5. 0，分子量約為130kD。實施例3 飼料蛋白的生產將按照實施例1所得到的發酵6天終產物進行超濾處理，所得固體殘渣用乾燥機 或壓濾機脫水乾燥，粉碎後製得飼料蛋白。經國家飼料質量監督檢驗中心(北京)檢測結果表明以農業纖維素廢棄物為原 料，經過聯產發酵得到的飼料蛋白，其粗蛋白、粗脂肪、灰分含量均有提高，而粗纖維則有明 顯降低；各類有益胺基酸含量提高、豐富，營養價值增加；各類維生素如A、D、E、B1、B2、葉酸 等均有提高；重金屬元素含量符合國家同類飼料基料衛生標準要求；沙門氏菌未檢出，黴 菌、細菌總數符合國家規定，黃麴黴素含量遠遠小於同類飼料基料等國家飼料衛生標準的 要求。產品屬無毒級，可作為飼料蛋白廣泛應用於養殖領域。
權利要求
一種高活力纖維素酶和飼料蛋白的聯產發酵方法，其特徵在於將黑麴黴FL26(A.nigerFL26)和產脘假絲酵母LW05(C.utilis LW05)兩種發酵菌株分別在發酵的不同時期接種到以農業纖維素廢棄物(玉米芯和水稻秸稈)為原料的培養基中，使用液態發酵工藝，同時生產高活力纖維素酶及飼料蛋白。
2.根據權利要求1所述的一種高活力纖維素酶和飼料蛋白的聯產發酵方法，其特徵在 於包括以下步驟(1)菌種活化將黑麴黴FL26和產脘假絲酵母LW05分別接種到PDA固體活化培養基 中，30°C恆溫培養3d。然後將活化後的黑麴黴FL26和產脘假絲酵母LW05分別接入種子活 化培養基I和種子活化培養基II中，30°C、180rpm通氣培養48h。(2)發酵工藝先將經活化的黑麴黴FL26液體種子，按照液體發酵培養基體積10%的 接種量接入液體發酵培養基，30°C、180rpm通氣培養4天。再以原液體發酵培養基體積10% 的接種量接入產脘假絲酵母LW05液體種子，300C、ISOrpm再通氣培養2天。(3)產物分離與純化將所得到的發酵終產物進行超濾處理，得到的濾液即為纖維素 酶粗酶液，利用鹽析、Sephadex G200凝膠層析進行純化可分別得到內切葡聚糖酶和β-葡 萄糖苷酶的酶製劑；固體殘渣用乾燥機或壓濾機脫水乾燥，粉碎後製得飼料蛋白。
3.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於 優選得到的發酵菌株黑麴黴FL26 (A. niger FL26)，具備利用農業纖維素廢棄物發酵生產高 活力纖維素酶的能力，所產纖維素酶具備完整的纖維素酶系組成，含有較高的葡萄糖 苷酶活性。
4.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於 經優選馴化得到的高產SCP菌株產脘假絲酵母LW05 (C. utilis LW05)，能利用農業纖維素 廢棄物分解產生的葡萄糖為碳源，快速生長，並和黑麴黴FL26互相配伍，有效提高纖維素 酶的酶活力和產量。
5.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2(1)中的種子活化培養基I組分如下葡萄糖10g，蛋白腖lg，無機鹽營養液1L。無機鹽營養液組成為=(NH4)2SO4 6g，KH2PO4 lg, MgSO4 · 7H20 5g，CaCl2 0. lg, NaCl 0. lg, FeSO4 · 7H20 0. 05g, MnSO4 · H2O 0. 016g, ZnSO4 · 7H20 0. 014g, CoCl2 0. 02g，蒸餾水 1L。
6.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2(1)中的種子活化培養基II組分如下蔗糖30g，NaNO3 2g，無機鹽營養液1L。
7.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2 (2)中的液體發酵培養基組分如下玉米芯(粉碎後60目過篩)20g，水稻秸稈(粉碎後60目過篩)10g，酵母粉20g，無機 鹽營養液1L。
8.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2 (2)中，黑麴黴FL26單獨發酵的時間為4天，與產脘假絲酵母LW05混合發酵的 時間為2天。
9.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2(3)中鹽析過程中所用硫酸銨飽和度區間為50-80%。
10.根據權利要求2所述的發酵聯產高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法，其特徵在於， 上述步驟2(4)中S印hadex G200凝膠層析過程中所用洗脫速度為0. 5mL/min。
全文摘要
本發明公開了一種通過發酵聯產工藝製備高活力纖維素酶和飼料蛋白的方法。其生產工藝如下以農業纖維素廢棄物(玉米芯、水稻秸稈)為主要原料，接種選育的黑麴黴FL26(Aspergillus niger FL26)進行高活力纖維素酶液態發酵，在發酵的第4天接入經馴化的產脘假絲酵母LW05(Candida utilis LW05)，繼續進行發酵。發酵完成後，經超濾後得到上清和固態殘渣兩部分。其中的上清液為高活力纖維素酶液，從中可分離純化出高活力的內切葡聚糖酶(265.7U/mL)和β-葡萄糖苷酶(191.4U/mL)，固態殘渣經烘乾、破碎即為優質飼料蛋白。飼料蛋白中粗蛋白含量可達39％以上，經國家飼料質量監督檢驗中心(北京)檢測結果表明，該飼料蛋白無毒無害，營養豐富。
文檔編號C12P39/00GK101935641SQ20101013475
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月30日 優先權日2010年3月30日
發明者傅霖, 朱立偉, 辛明秀 申請人:辛明秀;傅霖;朱立偉