一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法
2023-08-02 02:28:16 2
一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法，其利用多重聚合酶鏈反應（PCR）結合液相晶片來檢測多重蚊媒傳染病病原體，可以一次平行檢測包括黃熱病毒（YFV）、登革熱病毒（DV）Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型腦炎（日本腦炎）病毒（JEV）、瘧原蟲（Plasmodium）（4種，包括：間日瘧原蟲（PV）、惡性瘧原蟲（PF）、三日瘧原蟲（PM）、卵形瘧原蟲（PO））、西尼羅病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特異性及靈敏度高，結果穩定，重複性好，操作簡單，檢測速度快的優點。
【專利說明】一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物晶片和診斷試劑【技術領域】，具體涉及一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法，其針對多種蚊媒傳染病病原體設計特異性核酸探針並與多重聚合酶鏈反應(PCR)技術結合、採用液相晶片同步快速檢測多種蚊媒病原體及其分型。
【背景技術】
[0002]蚊媒傳染病是指有蚊蟲叮咬人體而傳播的疾病，近年來呈逐年上升趨勢。蚊媒傳染病一旦發生流行或暴發，將給社會穩定、人民群眾的健康、生活、生產帶來極大影響。根據國境口岸傳染病排查需要，將黃熱病、登革熱、流行性乙型腦炎(日本腦炎)、瘧疾、西尼羅熱及基孔肯雅熱六種疾病作為口岸重點關注的蚊媒傳染病。這六種疾病在非洲等國家廣泛流行、極易造成國際間的流行和傳播，而這些疾病均有發熱等症狀，沒有實驗室的檢測結果很難確診。
[0003]在對上述病原體檢測方面，目前常規的檢測手段包括分離培養方法、免疫學方法，以及核酸檢測方法，如PCR、多重PCR、RT_PCR和基於Taqman探針技術的實時螢光PCR方法等。但這些方法或多或少存在一些缺陷:如分離培養方法在技術上比較困難，且獲得病原學診斷和藥敏結果常需要3~5天以上，在臨床上難以及早進行病原學診斷和耐藥性測定，無法滿足臨床救治危重感染者的需要；免疫學方法檢測病毒的特異性抗體時，不僅需分別在患者感染的急性期及恢復期採集雙份血清，並且還可能存在抗原抗體間的交叉反應而幹擾檢測，不利於疾病的早期診斷；在核酸檢測方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基於Taqman探針技術的實時螢光PCR方法等的靈敏度高，特異性好，適合於快速檢測鑑定，但這些方法大多基於單一反應或較少數重數的多重反應的檢測，在對臨床樣本進行檢測時，對每一個樣本的數十種指標進行檢測和排除時，需要耗費大量的勞動和成本。
[0004]對於分子實驗室中大量樣本的常規檢測，研究者正致力於開發和建設以多重快速檢測為目標的檢測平臺，典型的高通量多重分析技術包括生物晶片、毛細電泳和質譜等，由於其能在同一反應容器中同時檢測多個核酸序列，因此在節約時間、勞動和成本方面更具有優勢，是高通量、特異、可靠、快速和經濟的核酸檢測方法。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒及檢測方法，其利用多重聚合酶鏈反應(PCR)結合液相晶片來檢測多重蚊媒傳染病病原體，可以平行一次檢測12種病原體或亞型，操作便捷，特異性強，靈敏度高，穩定性好。
[0006]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是:
一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒，該試劑盒包括用於檢測下列病原體的探針:黃熱病毒的探針YFV-PF、基孔肯雅病毒的探針CHIKV-PF、西尼羅WNV-PF、乙型腦炎病毒的探針JEV-PF、登革I型病毒的探針DV1-PF、登革II型病毒的探針DV2-PF、登革III型病毒的探針DV3-PF、登革IV型病毒的探針DV4-PF、間日瘧原蟲的探針PV-PF、三日瘧原蟲的探針PM-PF、卵形瘧原蟲的探針PO-PF和惡性瘧原蟲的探針PF-PF，上述探針的核苷酸序列分別參見表1，SEQ ID No:1-12。
[0007]表1用於檢測病原體的探針序列
【權利要求】
1.一種檢測多種蚊媒病原體的試劑盒，其特徵在於該試劑盒包括用於檢測下列病原體的探針:黃熱病毒的探針YFV-PF、基孔肯雅病毒的探針CHIKV-PF、西尼羅病毒WNV-PF、乙型腦炎病毒的探針JEV-PF、登革I型病毒的探針DV1-PF、登革II型病毒的探針DV2-PF、登革III型病毒的探針DV3-PF、登革IV型病毒的探針DV4-PF、間日瘧原蟲的探針PV-PF、三日瘧原蟲的探針PM-PF、卵形瘧原蟲的探針PO-PF和惡性瘧原蟲的探針PF-PF，上述探針的核苷酸序列分別依次如SEQ ID NO:1-12所示。
2.根據權利要求1所述的檢測多種蚊媒病原體的試劑盒,其特徵在於所述試劑盒還包括用於擴增下列病原體目的片段的PCR引物對: 黃熱病毒的引物對YFV-F和YFV-R，其序列參見SEQ ID NO:13-14 ； 基孔肯雅病毒的引物對CHIKV-F和CHIKV-R，其序列參見SEQ ID NO:15-16 ； 西尼羅病毒的引物對WNV-F和WNV-R，其序列參見SEQ ID NO: 17-18 ； 乙型腦炎病毒的引物 對JEV-F和JEV-R，其序列參見SEQ ID NO: 19-20 ； 登革I型病毒的引物對DVl-F和DV1-R，其序列參見SEQ ID NO:21-22 ; 登革II型病毒的引物對DV2-F和DV2-R，其序列參見SEQ ID NO:23-24 ; 登革III型病毒的引物對DV3-F和DV3-R，其序列參見SEQ ID NO:25-26 ； 登革IV型病毒的引物對DV4- F和DV4-R，其序列參見SEQ ID NO:27-28 ； 瘧原蟲的通用引物對PU-F2和PU-R2，其序列參見SEQ ID NO:29-30。
3.根據權利要求2所述的檢測多種蚊媒病原體的試劑盒，其特徵在於每對引物對中有一個5』端修飾有生物素標記，每個探針5』端均帶有胺基化修飾且連有C12鄰接臂序列、並分別與相應突光標記的微球偶聯。
4.根據權利要求2或3所述的檢測多種蚊媒病原體的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括反轉錄引物混合液，其反轉錄引物序列參見SEQ ID N0:31-38。
5.—種多種蚊媒病原體的檢測方法,基於微球的液相晶片技術，其特徵在於具體包括以下步驟: ①合成權利要求2所述的引物對和探針，將每對引物中的下遊引物5』端進行生物素標記；將每個探針5』端進行胺基化修飾且連有C12鄰接臂序列； ②將所述探針分別與相應螢光編碼的微球偶聯、然後等數目混合，製得偶聯有特異性核酸探針的微球組； ③抽提待測樣本的DNA和RNA，並採用多重反轉錄反應的方法將RNA的特定基因序列反轉錄成cDNA ； ④以cDNA/DNA為模板、採用步驟①中的引物對進行PCR擴增，製得PCR擴增產物； ⑤將PCR擴增產物與微球組溫育雜交，然後加入鏈黴親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR擴增產物上的生物素結合，形成微球-探針-PCR產物-生物素-SA-PE的複合物，利用液相晶片系統對待測樣品進行定性和定量分析。
6.根據權利要求5所述的多種蚊媒病原體的檢測方法，其特徵在於步驟③中所述反轉錄採用權利要求3中的反轉錄引物混合液。
7.根據權利要求5所述的多種蚊媒病原體的檢測方法，其特徵在於步驟④中的PCR擴增採用不對稱擴增，每對引物對中下遊引物的濃度是上遊引物濃度的31倍。
8.根據權利要求5所述的多種蚊媒病原體的檢測方法，其特徵在於步驟④中所述PCR擴增採用三個PCR反應體系，分別為PCR反應體系1、PCR反應體系II和PCR反應體系III ；其中PCR反應體系I含有西尼羅病毒引物對WNV-F和WNV-R，PCR反應體系II含有黃熱病毒的引物對YFV-F和YFV-R、登革I型病毒的引物對DVl-F和DV1-R、以及登革IV型病毒的引物對 DV4- F 和 DV4-R ；PCR 反應體系III包括 CHIKV-F 和 CHIKV-R、JEV-F 和 JEV_R、DV2_F 和DV2-R、DV3-F 和 DV3-R、PU-F和 PU-R ； 步驟⑤中，首先將PCR反應體系1、PCR反應體系II和PCR反應體系III中取等體積的擴增產物加入至同一試管內，然後再與微球組溫育雜交。
9.根據權利要求5所述的多種蚊媒病原體的檢測方法，其特徵在於步驟⑤中溫育雜交的條件為:96°C變性5分 鍾，55°C雜交30分鐘。
【文檔編號】C12Q1/70GK103911463SQ201410131703
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】史玲莉, 閆冀煥, 李雲, 滑娜, 沈軍, 吳志茹, 蘭景, 李薇, 付曉昀 申請人:河北國際旅行衛生保健中心