篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的方法
2023-08-02 07:25:26 1
篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的方法
【專利摘要】本發明公開了篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的方法，(1)篩選培養基、驗證培養基及搖瓶培養基的製備；(2)通過菌種誘變並對突變子進行初步篩選；(3)通過搖瓶發酵實驗對突變子進行確認及多次驗證。本發明方法有效篩選出抗分解代謝產物阻遏的木黴、青黴及麴黴高效產酶突變子，使真菌發酵產纖維素酶的過程中對葡萄糖等易利用碳源的限制解除，發酵可以通過添加葡萄糖作為能源加快發酵過程並提高發酵酶活，可有效的提高木黴、青黴及麴黴等纖維素酶生產菌株發酵產酶效率並降低成本。
【專利說明】篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的 方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於菌種改良領域，具體地說是涉及一種通過菌種誘變獲得抗分解代謝產 物阻遏效應的突變子從而提高木黴、麴黴、青黴等真菌發酵產生纖維素酶活的方法。 技術背景
[0002] 木黴屬（fricAoofe/maspp·)、麴黴屬 C4>s776?rgi77w>sspp·)、青黴屬 spp.)等真菌由於具有較強的纖維素酶活力而被廣泛的研究及應用，其中木黴屬中的裡氏 木黴reesei)、麴黴中的黑麴黴)及青黴屬中的斜臥青 黴等菌株所分泌的纖維素酶具有產量高、種類相對齊全等特點， 是工業生產纖維素酶的主要菌株。它們所能合成的纖維素酶包括外切-β -1，4-葡聚糖 酶（6叉〇-6-1，4-8111。&]1&86)、內切-6-1，4-葡聚糖酶（611(1〇-6-1，4-區111。&仙86)和3-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosedase)等三大類中的數十種，常見的有2種外切酶（CBH I、 CBHΠ )、5種內切酶（EGI、EGΠ 、EGm、EGIV和EGV)及2個葡萄糖苷酶（BGI、BGΠ )。
[0003] 纖維素酶是誘導酶，其表達能力不僅與基因調控序列有關，而且同外源誘導物有 關。纖維素酶的誘導物質主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖等。其中以纖維素、槐糖 的誘導效果最好，乳糖和纖維二糖的誘導效果次之，山梨糖不僅具有誘導作用，並且可以促 進胞外蛋白的分泌。不同誘導劑的物理性質不同，如纖維素是不可溶性物質，而其他糖類為 可溶物質，這也造成了不同誘導劑進入胞內的方式不同，進入胞內所激發的的誘導方式也 不盡相同，這也造成了誘導體系的複雜性。
[0004] 纖維素酶表達是功能基因表達、誘導物正向激活和分解代謝產物阻遏機制共同作 用結果。引起分解代謝產物阻遏機制的常見物質有甘油和葡萄糖等容易利用碳源；在產酶 真菌的發酵過程中，葡萄糖等物質的存在會嚴重抑制纖維素酶的合成，該過程中起主要作 用的是CRE I (裡氏木黴及斜臥木黴）或CREA (黑麴黴）阻遏蛋白，高濃度的葡萄糖可顯著 增加 cre7 mRNA或ere Z mRNA的表達水平。CRE A對黑麴黴中的木聚糖酶基因及多種纖維 素酶基因有較強的阻遏效應；而CRE I對裡氏木黴中的9種纖維素酶基因及斜臥青黴中的 6種主要纖維素酶基因均有阻遏效應;crW (ere X)基因缺陷性的菌種即使在含有葡萄糖 的培養基中也能夠產生纖維素酶，工業中應用極為廣泛的裡氏木黴Rut C-30就是cre7基因 突變缺陷性菌株。
[0005] 裡氏木黴、黑麴黴及斜臥青黴等菌株的發酵碳源往往是難以利用的纖維素類物 質，葡萄糖含量很低甚至沒有，這雖然避免了分解代謝產物阻遏效應所造成的發酵酶活偏 低的問題，但是由於纖維素類物質較難進入菌體生理代謝，從而導致發酵過程菌體生長緩 慢，不僅延長了發酵時間，並且對總酶活的提升有嚴重影響。若能使菌株獲得抗分解代謝產 物阻遏效應，則可以在發酵產酶中通過在初始培養基中加入適量的葡萄糖等快速利用碳源 從而使菌體大量快速生長，提高菌體總量並提前進入產酶狀態；此外還可以通過發酵中途 補加葡萄糖以期延長菌種的次生代謝階段及產酶時間，從而獲得活力更高的纖維素酶。
[0006] 葡萄糖雖然對裡氏木黴、黑麴黴、斜臥青黴等真菌的產酶過程具有阻遏效應，但是 它可以被當碳源或能源物質被迅速消耗，從而削弱甚至解除分解代謝產物阻遏效應；2-去 氧基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，該物質為非代謝型天然六碳糖，並不能作為碳源或能源物 質被進入微生物生理代謝途徑；與葡萄糖相同，2-去氧基葡萄糖同樣對裡氏木黴等產酶真 菌同樣具備分解代謝產物阻遏效應，能有效抑制裡氏木黴等真菌產纖維素酶。由於以上特 性，2-去氧基葡萄糖能對裡氏木黴等真菌的產酶過程起到持續阻遏效應，利用這一性質可 以在對裡氏木黴等真菌進行菌種誘變後將2-去氧基葡萄糖作為底物加入到培養基中，從 而為獲得具有抗分解代謝產物阻遏效應的改良菌株提供了可能。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是：提供一種篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突 變子的方法，通過對木黴、麴黴及青黴屬中的纖維素酶生產菌株進行菌種誘變，製備含有 2_去氧基葡萄糖作為分解代謝產物阻遏物質，並以預處理水稻秸杆為單一碳源的篩選培養 基和驗證培養基，從而對誘變菌株進行篩選，進一步獲得具有抗分解代謝產物阻遏效應的 纖維素酶高效產酶突變菌株。
[0008] 本發明的技術解決方案是：該篩選抗分解代謝產物阻遏效應的纖維素酶高效產酶 突變子的方法包括如下具體步驟： (1) 培養基的製備 篩選培養基成分如下（l〇〇mL體系）：預處理水稻秸杆粉末1% ; ΚΗ2Ρ04 0. 2% ; (NH4) 2S04 〇· 3% ;剛果紅(λ 1% ;瓊脂粉2% ;2-去氧基葡萄糖50ppm (w/v); 搖瓶培養基成分如下（l〇〇mL體系）：預處理水稻秸杆2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 驗證培養基成分如下（l〇〇mL體系）：預處理水稻秸杆2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 2-去氧基葡萄糖0. 05 %(w/v); 水稻秸杆預處理方法：將自然風乾的水稻秸杆置於1. 2-2Mpa的高壓蒸氣中處理 5-10min，再將其用自來水衝洗2-4次，隨後置於60°C烘箱中過夜； 2_去氧基葡萄糖滅菌方法：以蒸餾水為溶劑製備質量濃度0. 1%的2-去氧基葡萄糖母 液，於115°C下滅菌30min，隨後將滅過菌的母液加入滅過菌的篩選培養基中使其最終濃度 達到50ppm(W/v)，將滅過菌的母液加入到滅過菌的驗證培養基中使其最終濃度達到0. 05% (w/v)； (2) 抗分解代謝產物阻遏突變子的初步篩選：將提前製備好的真菌孢子懸液置於30°C 恆溫搖床內培養30min，以提高休眠孢子成活率，之後進行菌種誘變(物理誘變、化學誘變)， 使孢子致死率達70%-90%，隨後均勻塗布於篩選培養基表面，置於30°C恆溫箱中避光培養； 將原始菌株的孢子塗布篩選平板作為對照；避光培養70-80h後，觀察並記錄篩選培養基中 的菌落形態，挑選直徑大於對照組原始菌株單菌落30%，且菌落直徑與產孢區直徑比值大於 2的單菌落，將其作為待確認突變子； (3) 突變子的確認及驗證：將步驟2中篩選出的突變子轉接至3ml PDB試管中（2個重 復）；30°C恆溫搖床內培養24h，隨後將其分別接種於驗證培養基和搖瓶培養基中，160 rpm 轉速下30°C恆溫培養；將其原始菌株作為對照做以上相同處理；於發酵開始後120h-180h 取發酵液樣品lml，離心取上清液；通過國標法測定上清液的纖維素酶的濾紙片酶活（FPU); 若在搖瓶培養基中突變子的FPU酶活大於原始菌株FPU的120% ;並且該突變子在驗證培養 基的FPU酶活大於其在搖瓶培養基的90%，則初步斷定該突變子為正突變子；之後重複（3) 中上述步驟三次，若結果一致，則確定該突變子為抗分解代謝產物阻遏高效產酶突變子。
[0009] 本發明特徵效果如下：通過本發明方法可以有效篩選出抗分解代謝產物阻遏的木 黴、青黴及麴黴高效產酶突變子，並使真菌發酵產纖維素酶的過程中對葡萄糖等易利用碳 源的限制解除，發酵可以通過添加葡萄糖作為能源加快發酵過程並提高發酵酶活，可有效 的提高木黴、青黴及麴黴等纖維素酶生產菌株發酵產酶效率並降低成本。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合具體的實施例進一步詳細地描述本發明。本領域技術人員應當理解，這 些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。
[0011] 實施例1 :選取裡氏木黴Rut C-30作為原始菌株，30°C下對孢子懸浮液溫浴培養 30min後，使用20w功率的紫外燈於50cm高度照射2min，使孢子致死率達88. 7% ;將經紫外 誘變的孢子懸液塗布於初篩平板培養72h進行菌落觀察，發現編號為RUV1-1的菌株菌落直 徑為1. 5cm，為原始菌種（1. lcm)的1.36倍，菌落直徑（1.5cm)與產孢區直徑（0.6)的比值 為2. 5倍；經過三次搖瓶發酵實驗RUV1-1於120h的FPU酶活分別為1. 28U、1. 21U及1. 10U， 分別為相同條件下RutC-30 FPU酶活（三次相對應的酶活為0. 91U、0. 87U、0. 82U)的1. 41 倍、1. 39倍及1. 34倍；經過三次驗證培養基發酵實驗RUV1-1於124h的FPU酶活分別為 1. 16U、1. 17U、1. 21U，分別為RUV1-1在搖瓶發酵酶活（三次相對應的酶活為1. 28U、1. 21U 及1. 10U)的90. 6%、96. 7%及110% ;Rut C-30在驗證培養基中的三次酶活分別為0. 64U、 0. 52U及0. 57U，分別為其在搖瓶發酵酶活（三次相對應的酶活為0. 91U、0. 87U、0. 82U)的 70. 3%、59. 8%及69. 5%。表明RUV1-1是具備抗分解代謝產物阻遏效應的高效產酶突變子。
[0012] 實施例2 :選取裡氏木黴QM9414作為原始菌種，30°C下對其孢子懸浮液溫浴培養 30min後，加入等體積的500 μ g/ml NTG使孢子懸浮液終濃達107, NTG濃度達250 μ g /ml， 30°C水浴處理25min，使孢子致死率達71. 5% ;將經NTG化學誘變的孢子懸液塗布於初篩平 板，培養80h時進行菌落觀察，編號為QNTG-12的菌落直徑為1. 6cm，為原始菌株（0. 9cm)的 1. 78倍，菌落直徑（1. 7cm)與產孢區直徑（0. 8cm)的比值為2. 13倍；經過三次搖瓶發酵實 驗QNTG-12於180h的FPU酶活分別為1. 43U、1. 34U及1. 28U，分別為QM9414 FPU酶活（三 次相對應的酶活為〇. 72U、0. 68U、0. 77U)的1. 99倍、1. 97倍及1. 66倍；經過三次驗證培養 基發酵實驗QNTG-12於144h的FPU酶活分別為1. 36U、1. 28U、1. 24U，分別為QNTG-12在搖 瓶發酵酶活（1. 43U、1. 34U及1. 28U)的95. 1%、95. 5%及96. 9% ;QM9414在驗證培養基中的 三次酶活分別為〇. 44U、0. 32U及0. 37U分別為其在搖瓶發酵酶活（三次相對應的酶活為 0. 72U、0. 68U、0. 77U)的61. 1%、47. 1%及48. 1%。表明QNTG-12是具備較強抗分解代謝產物 阻遏效應的高效產酶突變子。
[0013] 實施例3 :選取由裡氏木黴QM9414經過NTG化學誘變獲得的高效產酶突變子 QNT-45為原始菌種，30°C下對其孢子懸浮液溫浴培養30min後，使用20w功率的紫外燈 於50cm高度照射2min 30s，使孢子致死率達82. 1% ;將經紫外誘變的孢子懸液塗布於初篩 平板培養75h進行菌落觀察，發現編號為QNT-UV-8的菌株菌落直徑為1. 4cm，為原始菌種 (1.0cm)的1.40倍，菌落直徑（1.4cm)與產孢區直徑（0.5)的比值為2. 8倍；經過三次搖瓶
【權利要求】
1. 篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的方法，其特徵是該方法包 括以下步驟： (1) 培養基的製備 篩選培養基成分如下（lOOmL體系）：預處理水稻秸杆粉末1% ; ΚΗ2Ρ04 0. 2% ; (NH4) 2S04 〇· 3% ;剛果紅(λ 1% ;瓊脂粉2% ;2-去氧基葡萄糖50ppm (w/v); 搖瓶培養基成分如下（l〇〇mL體系）：預處理水稻秸杆2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 驗證培養基成分如下（l〇〇mL體系）：預處理水稻秸杆2% ;KH2P04 0. 2% ; (NH4) 2S04 0. 3% ; 2-去氧基葡萄糖0. 05 %(w/v); 水稻秸杆預處理方法：將自然風乾的水稻秸杆置於1. 2-2Mpa的高壓蒸氣中處理 5-10min，再將其用自來水衝洗2-4次，隨後置於60°C烘箱中過夜； 2_去氧基葡萄糖滅菌方法：以蒸餾水為溶劑製備質量濃度0. 1%的2-去氧基葡萄糖母 液，於115°C下滅菌30min，隨後將滅過菌的母液加入滅過菌的篩選培養基中使其最終濃度 達到50ppm(W/v)，將滅過菌的母液加入到滅過菌的驗證培養基中使其最終濃度達到0. 05% (w/v)； (2) 抗分解代謝產物阻遏突變子的初步篩選：將提前製備好的真菌孢子懸液置於30°C 恆溫搖床內培養30min，以提高休眠孢子成活率，之後進行菌種誘變(物理誘變、化學誘變)， 使孢子致死率達70%-90%，隨後均勻塗布於篩選培養基表面，置於30°C恆溫箱中避光培養； 將原始菌株的孢子塗布篩選平板作為對照；避光培養70-80h後，觀察並記錄篩選培養基中 的菌落形態，挑選直徑大於對照組原始菌株單菌落30%，且菌落直徑與產孢區直徑比值大於 2的單菌落，將其作為待確認突變子； (3) 突變子的確認及驗證：將步驟2中篩選出的突變子轉接至3ml PDB試管中（2個重 復）；30°C恆溫搖床內培養24h，隨後將其分別接種於驗證培養基和搖瓶培養基中，160 rpm 轉速下30°C恆溫培養；將其原始菌株作為對照做以上相同處理；於發酵開始後120h-180h 取發酵液樣品lml，離心取上清液；通過國標法測定上清液的纖維素酶的濾紙片酶活（FPU); 若在搖瓶培養基中突變子的FPU酶活大於原始菌株FPU的120% ;並且該突變子在驗證培養 基的FPU酶活大於其在搖瓶培養基的90%，則初步斷定該突變子為正突變子；之後重複（3) 中上述步驟三次，若結果一致，則確定該突變子為抗分解代謝產物阻遏高效產酶突變子。
2. 根據權利要求1所述的篩選抗分解代謝產物阻遏效應的產纖維素酶高效突變子的 方法，其特徵是：步驟（2)中所使用的菌為木黴、黑麴黴或斜臥青黴。
【文檔編號】C12R1/885GK104059904SQ201410269186
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】賀建龍, 熊鵬, 周玉珍, 徐寧 申請人:熊鵬