一種dna損傷修復能力遺傳風險評估的方法
2023-08-01 22:58:56 4
專利名稱：一種dna損傷修復能力遺傳風險評估的方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法，用於評估基因損傷修復能力的強弱，針對性的提示受檢者面對於各種可能導致基因損傷的外界因素時應採取的恰當應對措施，屬於分子生物學技術領域。
背景技術：
在基因組核酸複製的過程中，細胞內具有複雜的機制保證遺傳信息被正確的複製，因為DNA的遺傳保守性是維持物種相對穩定的主要因素。但是，在生物體內外環境多種因素影響下，也會出現DNA損傷，也稱DNA突變。絕大多數損傷被機體內一整套十分有效的修復系統所修復，有些損傷則可造成機體的不可逆損害，出現細胞衰老、死亡或形成腫瘤等。
多種因素可引起DNA損傷，如紫外線、電離輻射、烷化劑等。修復的形式也是多樣的。某些DNA損傷可以直接修復；切除修復是常見的修複方式；重組修復是DNA損傷較多時的修複方式；SOS修復是DNA損傷嚴重時的應急修複方式；細胞周期檢查點控制是真核生物誘導修復的主要機制。由於遺傳因素的不同，每個個體對於基因損傷的修復能力也有所差異，而這種差異會影響到機體對諸多疾病，尤其是癌症的易感性。
DNA損傷是基因突變的前奏，是癌變、畸變的分子基礎。外界環境和生物體內部的許多因素都會經常導致DNA分子的損傷或改變，但由於存在強大的DNA修復系統，DNA分子的損傷或突變可以通過多種機制修復(如鹼基切除修復，核苷酸切除修復，重組修復及錯配修復等)。
DNA損傷的修復機制可保護細胞的基因免遭致癌因素的侵害，從而維持細胞中基因組的完整性。近年來的分子生物學研究進展已證實，DNA修復機制是由一類DNA修復基因所控制，DNA修復基因存在多態性，其多態性可影響到DNA修復能力的高低。如果DNA修復能力有缺陷，受損的基因不能修復，便會大大地增加基因的突變的概率，使個體處於非常高的腫瘤罹患危險之中，增加了腫瘤的易感性。而腫瘤已成為二十一世紀的人類第一殺手。在2005年全世界5800萬死亡總數中，癌症佔所有死亡的760萬(或13％)。並且2005年所有癌症死亡的70％以上發生在低收入和中等收入國家。預計全世界癌症死亡將繼續增加。據估計，2015年將有900萬人死於癌症，並且2030年將有1140萬人死亡。在我國，癌症發病及死亡率一直呈上升趨勢，在城鎮居民中，癌症已佔死因的首位。為此，我國制定了《中國癌症預防與控制規劃綱要(2004-2010)》，確定肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌及鼻咽癌為我國癌症防治重點，強調癌症的早期發現、早期診斷及早期治療。
目前臨床上關於基因損傷修復能力遺傳的檢測至今尚無完善的檢測方法和統一的標準。曾有Todd等用氯黴素醯基轉移酶(CAT)反映細胞內源性P53活性來檢測DNA損傷，結果靈敏穩定。但CAT的檢測要用放射性同位素，不夠安全，而且費用較高，限制了其推廣應用。
目前的基礎研究已能從理論上證明基因分型檢測可以用於判斷基因損傷修復能力的強弱，而且檢測方法簡便、檢測成本在可接受程度中、檢測結果可信。因此，基因分型檢測用於評估DNA損傷修復能力的可行性是明確的。
不同的人在相同的環境下基因損傷修復能力存在個體差異。面對不同的基因損傷修復能力風險，需要採取不同的風險預防手段。因此，綜合利用現代科學研究成果，開發一項基於分子遺傳基礎的基因損傷修復能力評估及個性化幹預提示產品會對由於基因損傷修復能力缺陷而引起疾病的發生起到預警、個性化防治的作用，具有很強的社會意義和市場前景。目前對涉及基因損傷修復通路的一些基因已經進行了大量研究。其作用機制、生化功能、通路情況、調控、轉錄等等方面都有明確可靠的研究結果；已經有可靠的檢測方法、儀器設備和檢測試劑等。因此利用現有科學、技術研究成果來開發這樣一個產品，時機是成熟的。
發明內容
本發明的目的是提供一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法，可以讓受檢者了解自身基因損傷修復能力的強弱，加強對可能發生基因損傷的環境的辨別能力，採取適當措施防止或降低基因損傷的程度，從而有效減少由於基因損傷帶來的癌症風險。
為實現以上目的，本發明的技術方案是提供一種利用基因檢測和軟體分析進行DNA損傷修復能力遺傳風險評估的具體實施方法。
為實現以上目的，本發明的技術方案是提供一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法，其特徵在於，其方法為 步驟1.檢測的樣品類型與採樣方法 用採樣拭在20-30被測者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證採集到足量的細胞樣本； 步驟2.基因組DNA的抽提方法 採用矽膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，共抽提20-30個被測者樣本，經電泳檢測後，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測； 步驟3螢光定量PCR反應 將每一個被測者樣本分別放入5個反應孔，同時檢測5個位點，即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQID NO2Arg194Trp、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；20-30個被測者樣本就有100-150個反應孔，另外根據實驗需要增設不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應孔的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，採用TaqMan
-MGB技術，進行檢測試劑合成； 在每一個反應孔中加入試劑為螢光定量PCR反應體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X螢光定量PCR反應緩衝液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去離子水4.98μl、5個位點分別採用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC螢光探針(10μM，0.25μl)和FAM螢光探針(10μM，0.25μl)工具進行檢測(詳見下表)；
將101-151個反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然後再進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘、反應結束後取出後再放入ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量，並自動將20-30個被測者樣本檢測5個點位的數據對號入座到5個圖中，同時生成5張圖，即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala圖、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp圖、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln圖、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln圖、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp圖； 步驟4SNP基因型分析 將ABI7900型螢光定量PCR儀上顯示的最終樣本螢光信號的5個表和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC螢光信號、VIC和FAM雜合螢光信號以及純FAM螢光信號，分別代表該位點三種不同的基因型； (1)、多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala 在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.4-0.5、Y坐標軸0.2-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.2-0.4、Y坐標軸1.0-1.3區域為TT基因型、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸0.7-1.0區域為TC基因型、X坐標軸0.8-0.9、Y坐標軸0.3-0.4區域為CC基因型，其中，CC為風險基因型，攜帶風險基因型時酶的活性降低，導致多種癌症的發生風險增加； (2)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp 在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.9-1.1區域為CC基因型、X坐標軸0.3-0.5、Y坐標軸0.75-0.95區域為TC基因型、X坐標軸0.5-0.6、Y坐標軸0.5-0.6區域為TT基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時XRCC1活性降低，導致個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加； (3)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln 在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.3-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸2.1-2.2區域為TT基因型、X坐標軸0.4-0.6、Y坐標軸1.1-1.7區域為TC基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為CC基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加； (4)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln 在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.05-0.15Y坐標軸1.5-2.0區域為AA基因型、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸1.4-1.6區域為AG基因型、X坐標軸0.7-1.2、Y坐標軸0.3-0.5區域為GG基因型，其中，AA和AG為風險基因型，攜帶風險基因型時基本轉錄因子複合物不能正確識別DNA損傷位點，DNA上致癌損傷積累，癌症的發生風險增加； (5)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp 在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.4-0.5區域為空白對照、X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸2.3-2.8區域為TT基因型、X坐標軸0.8-0.1、Y坐標軸2.2-2.5區域為GT基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為GG基因型(該基因型在中國人群中頻率很低，附圖30個樣本中未檢出該基因型)，其中，GT和GG為風險基因型，攜帶風險基因型時ERCC2參與構成的轉錄因子複合物性能弱化，癌症的發生風險增加； 每一個被測者的5個點落在5個表上哪個區域，即可知道被測者DNA損傷修復能力的遺傳風險； 步驟5，根據檢測結果給予個性化指導建議，主要有以下幾點 一、避免過多、過強的紫外線照射陽光中適量的紫外線照射對人體有益，但過多、過強的紫外線，尤其是紫外線燈等的照射，會引起胸腺嘧啶二聚體的形成，還可以引起DNA之間的交聯，DNA與蛋白質的交聯，甚至DNA鏈的斷裂。紫外線對人的傷害主要限於皮膚； 二、避免電離輻射引起的基因損傷電離輻射可導致DNA分子的多種變化，如鹼基變化、脫氧核糖變化、DNA鍵斷裂、DNA鏈交聯等。這些輻射可能會引起癌症的發生。電離輻射廣泛存在於人們的生活環境中，包括天然輻射和人造輻射。在日常生活中，應注意儘量避免接觸含有放射性物質的東西，如夜光手錶等； 三、注意防止烷化劑引起的DNA損傷烷化劑種類很多，如芥子氣、硫酸二乙酯等。很多烷化劑都是致癌物。現在工業中大量使用烷化劑，應儘量避免接觸。烷化劑引起的損傷有鹼基烷基化、鹼基脫落、DNA斷鏈、DNA鏈交聯等； 四、戒菸酒並注意營養補充吸菸和飲酒會抑制DNA的修復，缺乏葉酸會增加DNA雙鏈打開的可能性，而這不容易修復，往往造成DNA永久的損傷。在日常生活中，應注意多補充富含各種營養元素的新鮮水果蔬菜及菜花、酵母等富含葉酸的食物。
本發明通過同時檢測多聚ADP核糖轉移酶家族成員1(Poly ADP-ribosepolymerase family，member 1，PARP1)的單核苷酸多態性(SNP)位點、X射線交錯互補修復基因1(X-ray repair complementing defective repair inChinese hamster cells 1，XRCC1)的單核苷酸多態性位點與切除修復複合物2(Excision Repair Cross-complementing Rodent Repair Deficiency，Complementation Group 2，ERCC2)的單核苷酸多態性位點來評估個體對DNA損傷修復能力的遺傳風險，並根據遺傳風險評估結果進行個性化健康指導，針對性的提示受檢者面對於各種可能導致基因損傷的外界因素時應採取的恰當應對措施。
目前，經證實並且機理研究清楚的與基因損傷修復能力密切相關的基因有多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)、切除修復複合物2(ERCC2)等。在不同人群中與基因損傷修復有顯著相關性的基因位點包括PARP1 Val762Ala、XRCC1 Arg194Trp、XRCC1 Arg399Gln、ERCC2Lys751Gln和ERCC2 Asn312Asp。以上位點有國內外大量的關聯分析數據支持。
一、多聚ADP核糖轉移酶(PARP1) PARP1全稱poly(ADP-ribose)polymerase family，member 1，多聚ADP核糖轉移酶，又簡寫為ADPRT，位於第一號染色體1q41-q42位置。基因全長47.3kb，mRNA全長3861bp，共有23個外顯子，該突變位點位於第17個外顯子。PARP1編碼多聚ADP核糖轉移酶。這種酶通過聚ADP核糖基化反應修正多種核蛋白。這種修正以DNA為基礎，參與多種重要的細胞活動例如分化，增殖，腫瘤轉移等。同時也參與分子水平的活動，例如修復DNA受損的細胞等等。PARP1是一種高豐度核蛋白，人類的PARP1有三個蛋白結構域，其中包括一個DNA結合區域。當DNA受損時，PARP1立刻結合到DNA鏈斷裂，通過共價作用修改各種參與DNA修復作用的蛋白的屬性，同時通過對自己的核糖基化作用，脫離DNA鏈，讓其他DNA修復蛋白與DNA鏈斷裂點結合，進行修復。當DNA受損過於嚴重時，PARP1能起到消耗細胞中NAD(nicotinamide adenine dinucleotide)和ATP的作用，同時停留在DNA鏈斷裂處，阻止其他DNA修復蛋白進行修復，啟動細胞死亡路徑。這也就是說，在某個細胞DNA受損過於嚴重的情況下，PARP1還能起到導致細胞死亡的作用，從而避免受損的DNA繼續被複製。另有其他的研究證實，PARP1能與DNA轉錄啟動因子SPA1結合，通過這個途徑，其可以抑制轉錄的進行，進而調控基因的轉錄，並且可以在DNA未修復情況下引發調亡。rs1136410是位於第一號染色體上PARP1基因上的一個C/T多態，引起PARP1基因編碼的蛋白第762個胺基酸由Val變為Ala，目前研究表明該胺基酸替換能直接導致ADPRT酶的活性的降低，進而影響到機體的基因損傷修復能力。
在關聯分析研究方面2004年，Kristin L等人對PARP1 Val762Ala多態與前列腺癌的研究中(488 cases，524 controls，高加索人)發現PARP1 Ala/Ala基因型在前列腺病人中比例明顯高出非患病人群。PARP1 Ala/Ala基因型的前列腺癌危險度為(OR＝2.65；95％CI，1.08-6.49)；PARP1 Val/Ala基因型為(OR＝1.18；95％CI，0.85-1.64)。同時利用PARP1 Val/Val基因型為參照，PARP1多態與前列腺腫瘤的關聯性在年輕男性中更加顯著[(＜65歲)男性(OR，4.77；95％CI，1.01-22.44)，(＞65歲)男性(OR，1.78；95％CI，0.55-5.82)]。在利用PARP1 Ala/Ala基因型的淋巴細胞進行氧化破壞的實驗中還發現，PARP1酶有針對氧化破壞的功能。2004年，Bingtao Hao等人使用ESCC(etiology ofesophageal squamous cell carcinoma)對數個BER基因進行研究。在對419個食道癌患者的研究中發現，PARP1 62Ala的腸癌危險度為1.25[95％(CI)1.02-1.53]，同時也發現了PARP1 Val762Ala與XRCC1 Arg399Gln的易感性在中國人口ESCC中的基因-基因交互作用。
2005年，Zhang X等人的研究發現PARP1 Val762Ala與XRCC1 Arg399Gln多態性與蛋白質能以及BER活動性有關。在針對這兩個多態性以及吸菸的因素與肺癌的關聯性研究中得出(樣本量1000，1000對照)PARP1 Ala/Ala基因型相對於Val/Val基因型 的肺癌危險度OR＝1.68[95％confidence interval(95％CI)，1.27-2.23]；在Ala/Ala基因型中，不抽菸人群和抽菸人群(＜＝16，16到28，＞28條/年)的肺癌危險度分別為1.13(0.79-1.62)，1.35(0.68-2.70)，2.46(1.35-4.51)和17.09(8.15-35.83)，(P＜0.001)。當PARP1 762Ala/Ala和XRCC1 399Gln/Gln基因型同時出現時，肺癌危險度為5.91(95％CI，2.09-16.72)。研究結果顯示，PARP1 762Ala/Ala在吸菸引發的肺癌發生中起到重要作用。2001年-2003年張志等人以聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態分析方法，檢測236例胃癌患者和708例無腫瘤正常對照的基因型。以logostic多因素回歸模型計算各基因型的胃癌風險以及基因-基因交互作用對胃癌風險的影響。結果PARP1 Ala/Ala基因型患胃癌的風險比PARP1 Val/Val基因型高2倍(OR＝2.07；95％CI＝1.33-3.21；P＝0.001)。
二、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1) XRCC1基因全稱X-ray repair cross--complementing gene 1，人類X射線交錯互補修復基因1，位於第19號染色體1q13.2-13.3位置。基因全長32.3kb，mRNA全長2087bp，共有17個外顯子，編碼634個胺基酸的蛋白。XRCC1編碼的蛋白對因電離輻射和烷基化物引起的DNA單鏈斷裂能起到有效的修復作用。XRCC1編碼的蛋白與DNA連接酶III、聚合酶β、多聚ADP核糖轉移酶交互作用，參與DNA的鹼基切除修復(Base Excision Repair，BER)通路。眾多研究顯示，XRCC1基因上部分位點的多態性，與癌症發生有密切的關係。
XRCC1有三個主要的功能區域，XRCC1通常利用與其它酶的結合，改變其它酶的活性，參與DNA修復。XRCC1在機體內各個組織中的表達量均不高，在大腸中的表達相對較大。XRCC1參與的DNA修復通路的遺傳性或獲得性缺陷將破壞基因的完整性，導致細胞向惡性轉變，從而影響個體對腫瘤疾病的易感性。
rs1799782是位於第19號染色體XRCC1基因上的一個C/T多態，引起XRCC1基因編碼的蛋白第194個胺基酸由Arg變為Trp，可能引起XRCC1活性降低，導致個體的DNA修復能力下降。rs25487是位於第19號染色體XRCC1基因上的一個G/A多態，引起XRCC1基因編碼的蛋白第399個胺基酸由Arg變為Gln。Arg399Gln位於第10號外顯子，XRCC1蛋白BCRT I區域。突變型的Gln胺基酸可能可以加強XRCC1蛋白與DNA-致癌物加合物的結合能力，從而影響個體的腫瘤易感性。
關聯分析研究方面，目前國內外學者已作了大量研究，主要成果有1、rs1799782 Chen等對中國人群109例肺癌患者和109例正常對照的研究發現，194Trp/Trp基因型個體發生肺癌的相對危險性增加(OR＝3.06，95％CI0.94~9.92)。2001年，宋春英和譚文等人對中國北京、四川、廣東和江蘇地區總共222例食管癌病例和433例健康對照的研究中發現XRCC1 26304TT變異基因型在病例組和對照組中的頻率分別為12.6％和6.7％，攜帶該基因型的個體發生食管癌的風險比攜帶其他基因型者高1.8倍。
2002年，Xing D和Qi J等人對中國人群中433例食管癌病例和524例健康對照的研究中發現XRCC1 Arg194Trp位點Trp/Trp基因型在病例組和對照組中的頻率分布存在顯著差異，食管癌風險度為2.07(95％ CI 1.34-3.20)。結果顯示，XRCC1基因多態性可能是中國人群中食管癌遺傳易感因素之一。張薇採用PCR-RELP分析技術檢測242例膀胱癌患者及225例人群對照XRCC1基因194位點的多態性。應用非條件Logistic回歸模型，調整混雜因素後，分析各基因型與膀胱癌發生的關係以及是否與吸菸因素存在著交互作用。其結果膀胱癌病例組的194Trp/Trp突變基因型頻率(11.2％)顯著高於對照組(4.0％)。調整年齡、性別、吸菸、高危職業史、膀胱感染和體質指數等因素後，攜帶194Trp/Trp基因型個體患膀胱癌的風險是194Arg/Arg基因型個體的3.64倍(95％CI 1.60-9.30)。此基因型與吸菸對增加膀胱癌發病風險無明顯交互作用。去除了吸菸的混雜效應後，194Trp/Trp基因型個體患膀胱癌的危險性是其它基因型個體的3.16倍(95％CI 1.45-6.88)。結論XRCC1基因194Trp/Trp突變基因型增加膀胱癌發病風險，與吸菸無交互作用。
2、rs25487 2001年，Divine KK和Gilliland FD等對西班牙人和非西班牙白人進行研究，通過調整年齡、種族和吸菸後，具有399Gln/Gln基因型者患肺腺癌的危險性增加，OR值為2.45(95％CI1.1～5.8，P＝0.03)。以上研究表明，個體XRCC1多態位點是否有突變以及攜帶各突變等位基因的數目不同都可能影響肺癌的易感性。Park JY等人在一項對於韓國人群的肺癌病例對照研究中，針對192個肺癌病人和135個健康人做出了分析，發現XRCC1上399位胺基酸處Gln單倍型的存在會增加鱗癌的發病風險(OR＝1.77，95％CI＝1.06-2.93)，帶有Gln/Gln基因型的攜帶者來說，肺癌的發病風險更高(OR＝3.26，95％CI＝1.17-9.15)。當將病例組按照吸菸量分為≥40包/年和≤40包/年兩組時，Gln單倍型僅僅在≤40包/年組中增加肺癌發病風險(Arg/Gln校正OR＝1.48，95％CI＝0.78-2.8；Gln/Gln校正OR＝5.75，95％CI＝1.46-22.69)。該研究提示在吸菸量較少的鱗癌發病中，XRCC1的399胺基酸編碼位點可能是一個重要的遺傳影響因素。在國內，張文娟等人對鄭州大學第一、二附屬醫院和河南胸科醫院的149例河南漢族肺癌病例和157例正常人對照進行研究發現肺癌患者中，XRCC1 194Trp變異基因型頻率為12.8％，高於對照組6.4％(P＜0.05)；此種基因型個體發生肺癌的風險是其他基因型的2.0倍(調整OR＝1.6，95％CI＝0.57～4.47)。399Gln基因型頻率在病例組中為10.7％，高於對照組8.3％(P＜0.05)；經性別、年齡和吸菸狀況調整，此基因個體發生肺癌的風險是其他基因型的2.1倍(95％CI＝0.73～6.15)。
XRCC1基因這兩個多態位點之間沒有明顯的聯合作用，但基因型均與吸菸之間有聯合作用而增高肺癌風險。李鳴川等人對中國醫科大學附屬醫院和遼寧省腫瘤醫院的126例漢族女性肺癌手術病例和157例正常人對照進行研究發現，與攜帶399Arg/Arg基因型者比較，攜帶399Gln/Gln基因型者患肺腺癌的風險是其8.695倍(95％CI為3.343～22.614)。攜帶等位基因399Gln又有油煙暴露的個體患肺腺癌的風險明顯增高，校正的比值比為5.21(95％CI為1.85～14.70，P＜0.001)。結論XRCC1基因Arg399Gln多態性可能是非吸菸女性肺腺癌的遺傳易感因素。
三、切除修復複合物2(ERCC2) 切除修復複合物2(ERCC2)，位於13號染色體19q13.3位置，共有23個外顯子。基因全長19.0kb，mRNA全長2355bp，編碼含761個胺基酸的蛋白。核苷酸切除修復通路是幾條DNA損傷修復通路之一。由ERCC2編碼的蛋白參與轉錄偶聯的核苷酸切除修復，並且是基本轉錄因子複合物BTF2/TFIIH的一個組成成分。該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，並且屬於RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2基因的突變或者失活可能導致的疾病包括癌症、著色性幹皮病、毛髮營養不良、柯凱因氏綜合症等。ERCC2在體內最主要參與的通路是NER(NucleotideExcision Repair)通路。
rs13181是位於第19號染色體ERCC2基因第23號外顯子段Lys751Gln的G/T多態。世界人群中的頻率約為G∶T＝0.202∶0.798，雜合度0.322。目前的多項研究表明，Lys751Gln的胺基酸替代位於ERCC2蛋白C-末端部，這個位點的多態性與肺癌、膀胱癌、乳腺癌、皮膚癌等疾病有關。rs1799793是位於第19號染色體ERCC2基因第10號外顯子段Asp312Asn的G/A多態。世界人群中的頻率約為G∶A＝0.778∶0.222。目前的多項研究表明，該位點的多態會導致ERCC2參與構成的轉錄因子複合物的性能發生弱化，從而使得對DNA損傷修復的能力下降，轉錄因子的能力也同時發生下降，導致一系列諸如肺癌，前列腺癌等疾病的發生。
在關聯性分析研究方面，國內外學者對於上述兩個位點的研究成果主要有 1、rs13181 2002年，Hou SM和Falt S等人對瑞典人群中185例肺癌病例和162例健康最招的研究中發現70歲以下的在非吸菸人群，攜帶ERCC2Lys/Gln和Gln/Gln基因型的肺癌風險度為OR＝3.2，95％CI＝1.3-8.0。2004年，Harms C和SalamaSA等人對110例原發性肺癌病例和119吸菸者對照的研究中未發現ERCC2Lys751Gln位點多態性與肺癌存在顯著關聯性，但是攜帶ERCC2 Lys/Gln和Gln/Gln基因型的個體有顯著的染色體異常(P＜0.05)。Popanda等進行的463名肺癌病例460名醫院非腫瘤對照的病例2對照研究結顯示，751Gln基因型的個體患肺癌的險性升高(OR＝1.39，95％CI＝0.90-2.14)。
2003年，邢德印等人對383人正常對照，肺癌患者351例，食管癌患者325例的研究發現吸菸劑量＞＝29包每年的ERCC2 751Gln攜帶者患肺鱗癌的危險度(OR)為10.74(95％CI 4.51-25.57)。2003年，Liang G和Xing D等人對中國人群中1006例原發性肺癌病例和1020例健康對照的研究中發現與攜帶ERCC2 Lys/Lys基因型的個體相比，攜帶ERCC2 Gln/Gln基因型的個體肺癌發生危險度為OR＝2.71，95％CI＝1.01-7.24。Yu等對135名食管鱗癌患者和15名對照的研究結果顯示，XPD 751Gln/Gln基因型個體患食管鱗癌的危險性升高(OR＝6.71，95％CI＝1.90-23.73)；在吸菸者中，XPD 751Gln/Gln基因型比751Lys/Lys基因型者患食管鱗癌的危險性增加8倍(OR＝8.42，95％CI＝1.02-69.58)。
2、rs1799793 Zhou W等人在高加索人群中做的1000多對肺癌和正常人的Case-control研究顯示，Asp312Asn多態位點的Asn/Asn基因型攜帶者患肺癌的風險對Asp/Asp攜帶者患肺癌風險的OR為1.47(95％CI，1.1-2.0)。此外基因和環境互作的分析結果發現Asp312Asn位點與環境有比較強的相互作用效應。Hou SM等人的對瑞典人群的肺癌Case-control研究中發現，Asp312Asn位點上的突變型主要影響了非抽菸人群的肺癌發生率。在小於70歲的非吸菸人群中為OR＝2.6，(95％(CI)＝1.1-6.5)。2003年，Liang G和Xing D等人對中國人群中1006例原發性肺癌病例和1020例健康對照的研究中發現ERCC2 Asp312Asn位點Ash/Asn基因型攜帶者與Asp/Asp基因型攜帶者相比的肺癌發生危險度為(adjusted OR＝10.33，95％ CI＝1.29-82.50)。
2003年，Xing DY和Qi J等人對中國人群中351例肺癌病例和383例健康對照的研究中發現ERCC2 Asp312Asn位點Asp/Asn和Asn/Asn基因型攜帶者與Asp/Asp基因型攜帶者相比，患肺鱗癌的風險度為(OR 1.80；95％CI1.10-2.93)；但是在肺腺癌病例中未發現攜帶Asp/Asn和Asn/Asn基因型的風險度。結果顯示，ERCC2 Asp312Asn位點多態性是中國人群中肺鱗癌遺傳易感因素之一。Hu Z等人的對這一位點進行了Meta分析，驗證了Asn是肺癌發生的風險因子。
本發明所需檢測的DNA可以利用口腔黏膜上皮細胞進行抽提獲得，採用口腔黏膜上皮細胞採樣方法和器材進行樣本採集，樣本的DNA抽提利用矽膠吸附法進行口腔上皮細胞的DNA抽提並進行DNA濃度和純度的測定。
本發明5個位點的基因分型可以採用TaqMa
-MGB技術對這些位點進行基因分型。經重複實驗驗證，基因分型的準確率達到了99％以上，重複性達到了100％。除此之外，基因測序等技術也可以作為備選的基因分型手段。
本發明的優點是 1.可在基因損傷發生前就採取幹預措施，從而避免基因損傷，從而降低與基因損傷相關的如腫瘤疾病的發病率和死亡率； 2.從分子機理上進行腫瘤發病機理的分析，可用於腫瘤分子流行病學調查和腫瘤防治措施的制定。
圖1為即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala示意圖； 圖2為人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp示意圖； 圖3為人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln示意圖； 圖4為切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln示意圖； 圖5為切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp示意圖。
具體實施例方式 以下結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。
實施例1 一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法為 步驟1.檢測的樣品類型與採樣方法 用採樣拭在26被測者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮45次，以保證採集到足量的細胞樣本； 步驟2.基因組DNA的抽提方法 採用矽膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時，共抽提26個被測者樣本，並用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測； 步驟3螢光定量PCR反應 將每一個被測者樣本分別放入5個反應孔，同時檢測5個位點，即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；26個被測者樣本就有130個反應孔，另外根據實驗需要增設不含DNA模版的NTC空白對照孔； 每一個反應孔Ash312Asp SNP位點的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，採用TaqMan
-MGB技術，進行檢測試劑合成； 在每一個反應孔中加入試劑為螢光定量PCR反應體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X螢光定量PCR反應緩衝液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有義引物1和2各0.225μl、20μM的反義引物1和2各0.225μl、10μM的螢光探針1和2各0.25μl，去離子水4.98μl；採用5個位點的正向引物、反向引物、VIC螢光探針和FAM螢光探針工具進行檢測； 本發明5個位點的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，採用TaqMan
-MGB技術，進行檢測試劑合成。
將131個反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然後再進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘檢測，經重複實驗驗證，基因分型的準確率達到了99％以上，重複性達到了100％。反應結束後取出後再放入ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量，並自動將26個被測者樣本檢測5個點位的數據對號入座到5個圖中，同時生成5張圖，即圖1為多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala圖、圖2為人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp圖、圖3為人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln圖、圖4為切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln圖、圖5為切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp圖； 採用儀器為ABI Prism
7900型螢光定量PCR儀，檢出率可達99％以上，可重複性達到100％。每小時可進行10000個SNP多態性終點檢測分析，可滿足從中通量到高通量的SNP多態性實驗的需求。
步驟4SNP基因型分析 將ABI7900型螢光定量PCR儀上顯示的最終樣本螢光信號的5個表和NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC螢光信號、VIC和FAM雜合螢光信號以及純FAM螢光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；(1)、多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala 在檢測結果圖1中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.4-0.5、Y坐標軸0.2-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.2-0.4、Y坐標軸1.0-1.3區域為TT基因型、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸0.7-1.0區域為TC基因型、X坐標軸0.8-0.9、Y坐標軸0.3-0.4區域為CC基因型，其中，CC為風險基因型，攜帶風險基因型時酶的活性降低，導致多種癌症的發生風險增加； (2)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp 在檢測結果圖2中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.9-1.1區域為CC基因型、X坐標軸0.3-0.5、Y坐標軸0.75-0.95區域為TC基因型、X坐標軸0.5-0.6、Y坐標軸0.5-0.6區域為TT基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時XRCC1活性降低，導致個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加； (3)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln 在檢測結果圖3中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.3-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸2.1-2.2區域為TT基因型、X坐標軸0.4-0.6、Y坐標軸1.1-1.7區域為TC基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為CC基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加； (4)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln 在檢測結果圖4中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.05-0.15Y坐標軸1.5-2.0區域為AA基因型、(該基因型在中國人群中頻率很低，附圖30個樣本中未檢出該基因型)、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸1.4-1.6區域為AG基因型、X坐標軸0.7-1.2、Y坐標軸0.3-0.5區域為GG基因型，其中，AA和AG為風險基因型，攜帶風險基因型時基本轉錄因子複合物不能正確識別DNA損傷位點，DNA上致癌損傷積累，癌症的發生風險增加； (5)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp 在檢測結果圖5中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸O.1-0.2、Y坐標軸O.4-0.5區域為空白對照、X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸2.3-2.8區域為TT基因型、X坐標軸0.8-0.1、Y坐標軸2.2-2.5區域為GT基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為GG基因型(該基因型在中國人群中頻率很低，附圖30個樣本中未檢出該基因型)，其中，GT和GG為風險基因型，攜帶風險基因型時ERCC2參與構成的轉錄因子複合物性能弱化，癌症的發生風險增加； 每一個被測者的5個點落在5個表上哪個區域，即可知道被測者DNA損傷修復能力的遺傳風險結果； 步驟5，根據檢測結果給予個性化指導建議，主要有以下幾點 一、避免過多、過強的紫外線照射陽光中適量的紫外線照射對人體有益，但過多、過強的紫外線，尤其是紫外線燈等的照射，會引起胸腺嘧啶二聚體的形成，還可以引起DNA之間的交聯，DNA與蛋白質的交聯，甚至DNA鏈的斷裂。紫外線對人的傷害主要限於皮膚； 二、避免電離輻射引起的基因損傷電離輻射可導致DNA分子的多種變化，如鹼基變化、脫氧核糖變化、DNA鍵斷裂、DNA鏈交聯等。這些輻射可能會引起癌症的發生。電離輻射廣泛存在於人們的生活環境中，包括天然輻射和人造輻射。在日常生活中，應注意儘量避免接觸含有放射性物質的東西，如夜光手錶等； 三、注意防止烷化劑引起的DNA損傷烷化劑種類很多，如芥子氣、硫酸二乙酯等。很多烷化劑都是致癌物。現在工業中大量使用烷化劑，應儘量避免接觸。烷化劑引起的損傷有鹼基烷基化、鹼基脫落、DNA斷鏈、DNA鏈交聯等； 四、戒菸酒並注意營養補充吸菸和飲酒會抑制DNA的修復，缺乏葉酸會增加DNA雙鏈打開的可能性，而這不容易修復，往往造成DNA永久的損傷。在日常生活中，應注意多補充富含各種營養元素的新鮮水果蔬菜及菜花、酵母等富含葉酸的食物。
位點序列的確定
根據文獻提供的位點序列信息和rs號，在NCBI SNP資料庫中進行檢索比對，獲得以上5個位點的參考序列如下
1.PARP1 Val762Ala SEQ ID NO1rs1136410
CCTTGTTAAC ATTCCAGAAA GTCCTTATGA GCTCTCAATA TGTGCAGCAG 50
GTAACAGGCT GGCCCTGACC AGCAGGAGGG TTTGCCATTC ACTGTGTTGG 100
ACCTTCTCTG CATGTAGGTT TTCTCTGCCA CCTGGGTGAG TCTGTCTCAT 150
TCACCATGAT ACCTAAGTCG GGGGCTTTCT TTTGCTCCTC CAGGCCAAGG 200
C/T SNP
GGAAATGCTT GACAACCTGC TGGACATCGA GGTGGCCTAC AGTCTGCTCA 250
GGGGAGGGTC TGATGATAGC AGCAAGGATC CCATCGATGT CAACTATGAG 300
AAGCTCAAAA CTGACATTAA GGTAACAGGG TCAGGCCTTC CTCAAGCATC 350
TTAACCTCTC ATCCTGAGAG CAGCGGTCCC AAACTTCCAT GTGTGTTAGG 400
ATCTCCTGGA AAGCTTGTTA AAACACAGGT GGCTGGCGCC CAATAATTCA 450
CTTTTCTAAC AAGTTCCCGG ACATTGCTGC TGGTGGTCCT TTGAGAACCT 500
TTGGGCGTTT CACGTGTAGA TAATGCACCT TGTTT 535
2.XRCC1 Arg194Trp SEQ ID NO2rs1799782
CCCTTTGGCT TGAGTTTTGT ACGGTTTCAT AGCCCCCCAG ACAAAGATGA 50
GGCAGAGGCC CCGTCCCAGG TAAGCTGTAC CTGTCACTCC CCATGGCCTT 100
CTCCCTGCCT CTCCACCCCC ACCTGCCAGC AGCCCACCTA TAATACTGAC 150
CTTGCGGGAC CTTAGAAGGT GACAGTGACC AAGCTTGGCC AGTTCCGTGT 200
17
GAAGGAGGAG GATGAGAGCG CCAACTCTCT GAGGCCGGGG 240
GCTCTCTTCT TCAGC255
C/T SNP
GGATCAACAA GACATCCCCA GGTGAGCTCG GACAACGTGG GTCCTGAGTG 305
AGTAGGGTTG AGACCTAGAC TCGTGGGTCT GAGGGTAGAG GGGGCTGGGG 355
CTCAGATTCC TGGGTCTGAG GGAGGAGGGT AGTGGAGTCC TGGACTCCTG 405
GGTCTCAGGG TGGAGGAAGG TGGGCCTGGC CTCTTGTGTC CTGAGGGTTG 455
AGAGGTCTGG AGGCTGGGAC TCCTGGATCA CTGGTGGGTT TTGGCAACAA 505
TATTC
3.XRCC1 Arg399Gln SEQ ID NO3rs25487
ACCTCTTTTT GTTTCTCCCA CCTCAATCTC ATGATCTGTC TGTCTGTCTG 50
TCTCTCTCTC TCTCTGTCTG TCTCCCCTGT CTCATTCCCC TTTGCCCCTC 100
AGATCACACC TAACTGGCAT CTTCACTTCT GCCCCCCACC AGCTGTGCCT 150
TTGCCAACAC CCCCAAGTAC AGCCAGGTCC TAGGCCTGGG AGGCCGCATC 200
GTGCGTAAGG AGTGGGTGCT GGACTGTCAC CGCATGCGTC GGCGGCTGCC 250
CTCCC 255
G/A SNP
GAGGTAAGGC CTCACACGCC AACCCTGCTC CTTATCCTGT GCTGGGCAAT 305
GCCAGGAATC TGGAGGGGAG TCAGACTGGG GCCTGCCAGC GGAGAACACA 355
GGTGGTCCCA GCCCAGAGCC AGCAGACTAC TGAGAGGAGC GGGGCAGGGG 405
CTGGGGTACT CCAGATGAGG GAAGGAGGAC CTGCCTGGGA GGTCACAGAG 455
GGCTCTGTGA AGCCTGCTTA TCAGAAAAGG CTGGAGGAGC AGTTTGTGCA 505
AAAAC 510
4.ERCC2 Lys751Gln SEQ ID NO4rs13181
GGATGGGCTG GTGGGGTGAG AGGGGGTCTA TCATCTCCTG GCCCCCCCTT 50
GCCTCTGGGT ACCTGGTGGA TAGCTGCCTT CTCCTGCGAT TAAAGGCTGT 100
GGACGTGACA GTGAGAAATG TCACCTGACT TCATAAGACC TTCTAGCACC 150
ACCGCCGCTG GGAACCAGGG CCAGGCAAGA CTCAGGAGTC ACCAGGAACC 200
GTTTATGGCC CCACCCGCCC CACTCAGAGC TGCTGAGCAA 240
TCTGCTCTAT CCTCT255
G/T SNP
CAGCGTCTCC TCTGATTCTA GCTGCTCCAG GCTGAGCAGG GACAGGCCCA 305
GCTGATCCTC CTGCAGAGAA CAGAGGAAAG GGAGAGGGGG GCACTGTTGG 355
GCAGGGGCCC AGGCAGCTGC TGCACTTCCC CAACCACCCC CCCGAATGGC 405
CAGTAGGGAC AGGATGTTTG AATGAATTTG GAGATGTCCG TATAATCCAG 455
AGCGGGCCAT CCCTGTCAAC ATAAGATGGG GCTGAGGGAG GAGCCAGCTA 505
GGGAG 510
5.ERCC2 Asp312Asn SEQ ID NO5rs1799793
ACCTCACCCG CCGGACCCTT GACCGGTGCC AGGGCAACCT GGAGACCCTG 50
CAGAAGACGG TGCTCAGGTG GGGCCGGGGA CGTCTGGCGG TGGTGCCCGC 100
CCTGCCCCTG GGACCCTGGC CCCTGTCTGA CTTGTCCCCA GGGTTGCCAG 150
CCCCCTCCCA GCCCCAGCTC ATCTCTCCGC AGGATCAAAG AGACAGACGA 200
GCAGCGCCTG CGGGACGAGT ACCGGCGTCT GGTGGAGGGG CTGCGGGAGG 250
CCAGCGCCGC CCGGGAGACG GACGCCCACC TGGCCAACCC CGTGCTGCCC 300
A/G SNP
ACGAAGTGCT GCAGGGTGAG CCCCGACCCC CCGCTGCCCC CCAGTCCCTT 350
TCCCGCCTCC CCGTCGCCGC TGATAGCGTC TCCTCGCAGA GGCAGTGCCT 400
GGCTCCATCC GCACGGCCGA GCATTTCCTG GGCTTCCTGA GGCGGCTGCT 450
GGAGTACGTG AAGTGGCGGC TGCGTGTGCA GCATGTGGTG CAGGAGAGCC 500
CGCCCGCCTT CCTGAGCGGC CTGGCCCAGC GCGTGTGCAT CCAGCGCAAG 550
CCCCTCAGGT GCGGCCCCAG ACAGCGCGCG GGGTGGGGGC CCGGCAGGTC 600
權利要求
1.一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法，其特徵在於，其方法為
步驟1.檢測的樣品類型與採樣方法
用採樣拭在20-30被測者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮40次以上，以保證採集到足量的細胞樣本；
步驟2.基因組DNA的抽提方法
採用矽膠吸附法抽提每一個口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時-2.5小時，共抽提20-30個被測者樣本，經電泳檢測後，用肉眼可見清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進入下一步檢測；
步驟3螢光定量PCR反應
將每一個被測者樣本分別放入5個反應孔，同時檢測5個位點，即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys751Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp；20-30個被測者樣本就有100-150個反應孔，另外根據實驗需要增設不含DNA模版的NTC空白對照孔；
每一個反應孔的基因分型可以根據下表的引物和探針設計，採用TaqMan
-MGB技術，進行檢測試劑合成；
在每一個反應孔中加入試劑為螢光定量PCR反應體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X螢光定量PCR反應緩衝液ABI Taqman
MGB、0.1μl 25mM d NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl 25mM MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、去離子水4.98μl、5個位點分別採用不同的正向引物(20μM，0.225μl)、反向引物(20μM，0.225μl)、VIC螢光探針(10μM，0.25μl)和FAM螢光探針(10μM，0.25μl)工具進行檢測(詳見下表)；
將101-151個反應孔在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然後再進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘、反應結束後取出後再放入ABI7900型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量，並自動將20-30個被測者樣本檢測5個點位的數據對號入座到5個圖中，同時生成5張圖，即多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQID NO1圖；Val762Ala、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQID NO2圖；Arg194Trp、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3圖；Arg399Gln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4圖；Lys7516ln、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5步驟4SNP基因型分析
將ABI7900型螢光定量PCR儀上顯示的最終樣本螢光信號的5個表和一個NTC空白對照進行比較，每個位點理論上存在三種不同的信號，純VIC螢光信號、VIC和FAM雜合螢光信號以及純FAM螢光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；
(1)、多聚ADP核糖轉移酶(PARP1)SEQ ID NO1Val762Ala
在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.4-0.5、Y坐標軸0.2-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.2-0.4、Y坐標軸1.0-1.3區域為TT基因型、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸0.7-1.0區域為TC基因型、X坐標軸0.8-0.9、Y坐標軸0.3-0.4區域為CC基因型，其中，CC為風險基因型，攜帶風險基因型時酶的活性降低，導致多種癌症的發生風險增加；
(2)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO2Arg194Trp
在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.9-1.1區域為CC基因型、X坐標軸0.3-0.5、Y坐標軸0.75-0.95區域為TC基因型、X坐標軸0.5-0.6、Y坐標軸0.5-0.6區域為TT基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時XRCC1活性降低，導致個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加；
(3)、人類X射線交錯互補修復基因1(XRCC1)SEQ ID NO3Arg399Gln
在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.3-0.4區域為空白對照、X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸2.1-2.2區域為TT基因型、X坐標軸0.4-0.6、Y坐標軸1.1-1.7區域為TC基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為CC基因型，其中，TT為風險基因型，攜帶風險基因型時個體的DNA修復能力下降，癌症的發生風險增加；
(4)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO4Lys7516ln
在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸0.2-0.3區域為空白對照、X坐標軸0.05-0.15Y坐標軸1.5-2.0區域為AA基因型、X坐標軸0.7-0.9、Y坐標軸1.4-1.6區域為AG基因型、X坐標軸0.7-1.2、Y坐標軸0.3-0.5區域為GG基因型，其中，AA和AG為風險基因型，攜帶風險基因型時基本轉錄因子複合物不能正確識別DNA損傷位點，DNA上致癌損傷積累，癌症的發生風險增加；
(5)、切除修復複合物2(ERCC2)SEQ ID NO5Asn312Asp
在檢測結果圖中，共有21-31個點，每個點代表一個被測者樣本的檢測結果，X坐標軸0.1-0.2、Y坐標軸0.4-0.5區域為空白對照、X坐標軸0.0-0.1、Y坐標軸2.3-2.8區域為TT基因型、X坐標軸0.8-0.1、Y坐標軸2.2-2.5區域為GT基因型、X坐標軸0.8-1.0、Y坐標軸0.4-0.5區域為GG基因型，其中，GT和GG為風險基因型，攜帶風險基因型時ERCC2參與構成的轉錄因子複合物性能弱化，癌症的發生風險增加；
每一個被測者的5個點落在5個表上哪個區域，即可知道被測者DNA損傷修復能力的遺傳風險；
步驟5，根據檢測結果給予個性化指導建議，主要有以下幾點
一、避免過多、過強的紫外線照射陽光中適量的紫外線照射對人體有益，但過多、過強的紫外線，尤其是紫外線燈等的照射，會引起胸腺嘧啶二聚體的形成，還可以引起DNA之間的交聯，DNA與蛋白質的交聯，甚至DNA鏈的斷裂。紫外線對人的傷害主要限於皮膚；
二、避免電離輻射引起的基因損傷電離輻射可導致DNA分子的多種變化，如鹼基變化、脫氧核糖變化、DNA鍵斷裂、DNA鏈交聯等。這些輻射可能會引起癌症的發生。電離輻射廣泛存在於人們的生活環境中，包括天然輻射和人造輻射。在日常生活中，應注意儘量避免接觸含有放射性物質的東西，如夜光手錶等；
三、注意防止烷化劑引起的DNA損傷烷化劑種類很多，如芥子氣、硫酸二乙酯等。很多烷化劑都是致癌物。現在工業中大量使用烷化劑，應儘量避免接觸。烷化劑引起的損傷有鹼基烷基化、鹼基脫落、DNA斷鏈、DNA鏈交聯等；
四、戒菸酒並注意營養補充吸菸和飲酒會抑制DNA的修復，缺乏葉酸會增加DNA雙鏈打開的可能性，而這不容易修復，往往造成DNA永久的損傷。在日常生活中，應注意多補充富含各種營養元素的新鮮水果蔬菜及菜花、酵母等富含葉酸的食物。
全文摘要
本發明公開了一種DNA損傷修復能力遺傳風險評估的方法，其特徵在於，通過同時檢測分析個體的PARP1基因、XRCC1基因、ERCC2基因SNPs位點基因攜帶型為所有的受檢者提供DNA損傷修復能力的遺傳風險評估、相關疾病風險規避的個性化健康指導。本發明的優點是可在基因損傷發生前就採取幹預措施，從而避免基因損傷，從而降低與基因損傷相關的如腫瘤疾病的發病率和死亡率；從分子機理上進行腫瘤發病機理的分析，可用於腫瘤分子流行病學調查和腫瘤防治措施的制定。
文檔編號G01N21/64GK101302562SQ20081004031
公開日2008年11月12日 申請日期2008年7月8日 優先權日2008年7月8日
發明者傅詠南, 校 王, 毛丹丹 申請人:上海中優醫藥高科技有限公司