一種納米基因疫苗及其製備方法和應用的製作方法

2023-07-30 19:34:56

一種納米基因疫苗及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種納米基因疫苗及其製備方法和應用，屬於生物【技術領域】。為解決重組蛋白存在製備耗時長、步驟繁瑣、成本高的缺點，提供一種納米基因疫苗。該納米基因疫苗基於基因工程技術，引入真核細胞表達所需的信號肽序列、2個相同的NKG2D胞外序列、細胞因子IL-15的序列，構建融合蛋白表達載體，並將該融合蛋白表達載體用生物相容性殼聚糖材料製備成納米基因疫苗。由於納米基因疫苗攜帶正電荷，可被腫瘤細胞或肌肉細胞主動吞噬，在真核細胞內表達出具有在腫瘤細胞和淋巴細胞之間聯繫的dsNKG2D-IL-15蛋白。不僅激活體內自然殺傷細胞(NK)或細胞毒性T細胞(CTL)，並能夠增強體內的特異性免疫應答，成為抗腫瘤藥物。
【專利說明】一種納米基因疫苗及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種新型具有抗腫瘤及免疫增強活性納米基因疫苗及其製備方法，屬 於生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 腫瘤細胞降低HLA I類分子及共刺激分子的表達，逃逸機體內T淋巴細胞的監視， 卻激活了 NK細胞的活性。如果NK細胞表面活化性受體傳遞的活化性信號強於抑制性受體 傳遞的抑制性信號，NK細胞將被活化，分泌細胞因子及直接殺傷腫瘤細胞，被譽為是機體抗 腫瘤的第一道防線。另一方面，腫瘤逃逸NK細胞監視功能的事實以及大量實驗依據證明， 腫瘤組織內NK細胞的數目及功能均低於正常組織。因此，如何在體內或體外促進NK細胞 增殖、並提高NK細胞的生物學活性，決定了 NK細胞為基礎的腫瘤免疫治療的效果。
[0003] NK細胞主要通過下面四條識別途徑而活化：1)非己識別，表現為通過模式識別受 體識別一些病原相關的分子模式而被活化。2)應激誘導的識別，即識別腫瘤細胞或病毒感 染細胞表面的應激分子，如MICA或ULBP蛋白等，與活化性受體NKg2D結合而激活NK細胞。 3)缺失自我的識別，表現為腫瘤細胞或病毒感染的細胞丟失或下調了經典HLAI類分子的 表達，引起抑制性信號減弱而使NK細胞活化。4)細胞因子介導的活化，也是NK細胞活化的 最有效刺激劑，例如DC細胞來源的IL-15是促進NK細胞增殖、活化及發揮細胞毒效應的關 鍵細胞因子。
[0004] IL-15被譽為是NK細胞的生長因子，也是NK細胞發育分化過程中的關鍵細胞因 子。IL-15與IL-2空間結構相似，含有4個α螺旋，分子量14?15KD。IL-15除其特異性 〇受體外，與11^-2共有0受體，與11^-2、11^-4、11^-7、11^-9和11^-21共有￥受體。與11^-2 相比，IL-15可有效延長NK細胞生命周期，促進記憶性⑶8+Τ細胞在體內的長期存活，維持 免疫記憶。雖然IL-2已被FDA批准用於轉移性腎癌和惡性黑色素瘤的治療，但IL-2誘導 腫瘤抗原限制性T細胞凋亡的特點會降低其抗腫瘤效應。另外IL-2具有抑制記憶性T細 胞存活、維持CD4+CD25+調節性T細胞的特點，提示用IL-15代替IL-2用於腫瘤治療，將產 生更好的效果。
[0005] IL-15及IL-15Rci基因敲除小鼠實驗證明IL-15主要被細胞反式遞呈而發揮效 應，S卩IL-15被樹突狀細胞或其他基質細胞分泌後，立即與這些細胞表面的受體α結合（Ka =10-11)，再激活表達β與Y受體的鄰近細胞（如NK細胞，⑶8+Τ細胞）。而且Lucas 等製備可誘導性清除體內CDllchigh DC的小鼠模型，發現淋巴結或脾臟內的DC細胞反 式遞呈IL-15,是引起NK細胞致敏（細胞漿內儲備顆粒酶和幹擾素）的必要因素。另外， Kobayashi等將IL-15Ra轉染小鼠高轉移性結腸腺癌細胞株MC38,移植普通小鼠可抑制腫 瘤轉移，而移植IL-15基因敲除鼠，短時間內腫瘤轉移到肺組織導致小鼠死亡。這些現象提 示若建立腫瘤細胞反式遞呈IL-15的作用方式，NK細胞不僅高效擴增與活化，還具備靶向 抗腫瘤的特點。
[0006] 若要腫瘤細胞反式遞呈IL-15,首要方法是給腫瘤細胞轉染IL-15R a，但如何讓 體內腫瘤細胞特異性攝取外源性的基因載體，目前的技術手段仍然困難。另一種較為簡便 的策略是製備某種融合蛋白，既使其氨基端與腫瘤細胞特異性結合，又在羧基端攜帶IL-15 分子，從而具備激活NK細胞的效應。因此，選擇合適的在腫瘤細胞與IL-15之間"搭橋"的 分子非常關鍵，既可製備某一腫瘤抗原的單克隆抗體，也可以選取該抗原分子的受體。
[0007] MHC I 類相關分子 A (MHC class I chain-related antigen A, MICA)是機體受到 應激反應後表達在細胞表面的一種糖蛋白，在大多數上皮性腫瘤細胞和病毒感染的細胞表 面廣泛表達，而僅於正常腸道上皮組織中微量表達，成為腫瘤治療很好的候選靶點。NKg2D 為MICA分子的受體，屬於C-型凝集素家族成員，1個MICA分子可與兩個同源性的NKg2D 分子結合，二者之間的親和力相對較高（Kd為8X10-7?4X10 - 9M)。因此體外製備的 NKG2D分子在理論上具備體內靶向識別腫瘤的活性。
[0008] 本課題組獲得的上一個授權專利（一種增強淋巴細胞靶向殺傷腫瘤的活性因子 及其製備方法，ZL201010533669. 9)，基於原核表達技術製備了重組dsNKG2D-IL-15蛋白， 該蛋白具有識別腫瘤表面MICA抗原以及激活NK細胞的活性，並具有抑制小鼠結腸癌生長 的功能。然而該重組蛋白從誘導表達、體外純化及復性等過程存在耗時很長、步驟繁瑣、成 本較高的缺點，不利於臨床廣泛使用。而基因疫苗體內應用時，往往存在代謝快、細胞主動 攝取效率低下的缺點。
[0009] 納米藥物因具有良好穩定性、對胃腸刺激性小、毒副作用小、生物利用度高、良好 靶向性和緩釋功能等特點，成為現代藥物研究發展的一個重要方向。"納米凝膠"(Nanogel) 是能夠在水溶液中分散並具有納米尺寸的水凝膠顆粒，可通過離子鍵、氫鍵及疏水相互作 用等將生物活性分子嵌合到交聯的網絡結構中。聚電解質納米凝膠還可結合帶有相反電荷 的小分子藥物、核酸類藥物及蛋白質，用來運送相應藥物用於疾病的治療。關於殼聚糖修飾 後的材料用於運載質粒DNA、SiRNA來製備基因疫苗，國內外已有大量報導。
[0010] 因此，本發明主要首先將殼聚糖修飾為水溶性羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖，在 pH7. 0條件下可攜帶正電荷的特點，從而吸附帶負電荷的DNA，用來製備運送具有抗腫瘤活 性的重組基因載體的納米凝膠，有望成為腫瘤治療的疫苗之一。


【發明內容】

[0011] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種納米基因疫苗及其製備方法，該納 米基因疫苗具有免疫增強及抗腫瘤活性。
[0012] 本發明的方法能在體外大量製備負載pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-15融合蛋白表 達載體的納米基因疫苗，且該納米基因疫苗可被真核細胞攝取而表達dsNKg2D-IL-15蛋 白，並激活NK和CD8+T細胞的功能。體內應用時，該納米基因疫苗能夠上調淋巴細胞的功 能，具有明顯抑制腫瘤生長的活性。
[0013] 本發明的方案是在上一發明專利的基礎上（ZL201010533669.9)，於融合基 因 dsNKG2D-IL-l5基因的上遊引入鼠 β -2微球蛋白的信號肽序列，製備出融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-15,其序列如SEQ ID Νο:1所示，其編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。
[0014] 本發明所說融合基因 dsNKG2D-IL-15,可在真核細胞表達。是雙可溶性NK細胞活 化性受體NKG2D與細胞因子IL-15融合蛋白dsNKG2D-IL-15,該融合基因的序列如SEQ ID NO:3所示。
[0015] 融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-15 插入 pcDNA3. I (-)載體內多克隆位點 BamH I 和 Hind III 之間，命名為 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15。
[0016] 得到的pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體經測序，其基因序列如 SEQ ID N0:2所示；其中核苷酸殘基位置10-69為鼠 β 2-微球蛋白前導肽基因的序列，核 苷酸殘基位置70-486為第一個NKG2D胞外區的基因序列；553-969為第二個NKG2D胞外區 的基因序列；核苷酸殘基1036-1380為IL-15的基因序列；核苷酸殘基487-552、970-1035 為柔性片段的基因序列。
[0017] -種納米基因疫苗，由殼聚糖包封融合蛋白表達載體 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15 構成。
[0018] 上述納米基因疫苗，所述殼聚糖為羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖。
[0019] 該納米基因疫苗由殼聚糖運送表達生物活性因子dsNKG2D-IL_15。利用殼聚糖自 身帶有大量正電荷的特點，製備成納米基因疫苗，負載大量帶負電荷的融合蛋白表達載體， 該納米基因疫苗經真核細胞吞噬、融合基因表達後，可分泌出可溶性dsNKG2D-IL-15蛋白。 達到既識別腫瘤細胞，又反式遞呈IL-15,有效抑制腫瘤的目的。
[0020] 本發明還提供納米基因疫苗的製備方法，其步驟如下：
[0021] l)pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體的構建：以原核表達載體 pQE31-dsNKG2D-IL-15為骨架，利用PCR分別擴增鼠 β 2-微球蛋白的信號肽及人NKG2D受 體的第一個胞外區的融合片段SEQ ID NO: 4,和NKG2D的第2個胞外區及IL-15的融合片段 SEQ ID N0:5將這兩個片段先後插入pcDNA3. 1(_)載體，得到融合蛋白表達載體。
[0022] 2)納米基因疫苗的製備：利用大提質粒試劑盒，大量提取無內毒素 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體。利用殼聚糖體外溶脹法製備成納 米基因疫苗，確定其包封率、粒徑大小及Zeta電位後，直接用於轉染細胞，可分泌出 dsNKG2D-IL-15 蛋白。
[0023] 上述納米基因疫苗的製備方法，殼聚糖：融合蛋白表達載體質量比1 :2?2:1。
[0024] 上述納米基因疫苗的製備方法，使用的大提質粒試劑盒為Qiagen公司大提質粒 試劑盒（No. 12362)。
[0025] 上述納米基因疫苗的製備方法，所述殼聚糖為羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖。
[0026] 上述納米基因疫苗的製備方法，殼聚糖體外溶脹法製備納米基因疫苗，還包括如 下步驟：
[0027] 1)將融合蛋白表達載體溶液滴加入殼聚糖中，300rpm，室溫振蕩30分鐘，混合均 勻；
[0028] 2) 4°C離心機離心20-25分鐘，徹底分離游離DNA和納米基因疫苗。
[0029] 本發明還公開了納米基因疫苗在製備增強免疫或抑制腫瘤的藥物中的應用。
[0030] 上述PCDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體，經脂質體介導轉染結腸 癌細胞CT-26後，流式細胞儀及組織免疫螢光法證實其表達NKG2D及IL-15。殼聚糖材料 對pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體的包封率可超過90%，其粒徑分布於 200?400nm之間，且大小均一，Zeta電位範圍在53. 8±6. 56之間。
[0031] 負載融合蛋白表達載體的納米基因疫苗體外與腫瘤細胞共孵育後，細胞培養上清 中dsNKG2D-IL-15的濃度可明顯提高。而納米基因疫苗對腫瘤細胞的生物毒性沒有明顯變 化。將納米基因疫苗體內注射正常小鼠後，具有激活NK和CD8+T細胞活化的能力。小鼠體 內荷瘤實驗證實，納米基因疫苗肌肉注射後可明顯抑制腫瘤的生長，且延長腫瘤患者的生 存期。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1.納米基因疫苗顆粒不意圖。
[0033] 圖2. ATG-sig-dsNKG2D-IL-15融合基因片段的構建策略圖。
[0034] 圖3. pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體經雙酶切鑑定，產物電泳 圖（l.DNA ladder，2.pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-15,3.pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-15用 BamH Ι/Κρη I 酶切，4.pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-15 用 BamH I/Hind III 酶切，5.pcDNA3. l-dsNKG2D-IL-15 用 Hind III/Kpn I 酶切）。
[0035] 圖4. pcDNA 3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體經脂質體包裹，轉染結腸 癌細胞株CT-26後，標記NKG2D抗體後的流式圖。
[0036] 圖5. CT-26細胞經脂質體包裹的表達載體轉染後，免疫螢光法檢測胞內IL-15對 比圖，a圖表達載體為pcDNA3. I ;b圖表達載體為pcDNA3. l-sig-dsNKG2D-IL-15。
[0037] 圖6.殼聚糖對融合蛋白表達載體包封率的檢測，經殼聚糖包封融合蛋白表達載 體後取上清的電泳結果圖（1.殼聚糖：融合蛋白表達載體為1:2,2.殼聚糖：融合蛋白表達 載體為1:1，3.殼聚糖：融合蛋白表達載體為2:1，4. marker)。
[0038] 圖7.電鏡檢測納米基因疫苗顆粒的大小
[0039] 圖8.納米基因疫苗的Zeta電位檢測結果圖。
[0040] 圖9.用負載PCDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體的納米基因疫苗直 接與腫瘤細胞孵育，收集細胞培養上清，ELISA檢測上清中dsNKG2D-IL-15的濃度結果圖，a 圖為腫瘤細胞B16BL6, b圖為腫瘤細胞RAW264. 7。
[0041] 圖10.納米基因疫苗的體外腫瘤細胞生物毒性檢測（MTS/PMS法檢測）結果圖，a 圖為腫瘤細胞B16BL6, b圖為腫瘤細胞RAW264. 7。
[0042] 圖11.經納米基因疫苗體內注射正常小鼠激活NK和⑶8+T細胞檢測結果圖，a圖 為CD69+NK細胞，b圖為NKG2D+CD8+T細胞。
[0043] 圖12.納米基因疫苗體內使用後對荷瘤小鼠腫瘤生長及生存期影響的曲線圖，a 圖為體內腫瘤的生長曲線，b圖為荷瘤小鼠的生存曲線。
[0044] 圖13.使用納米基因疫苗後，荷瘤小鼠脾臟內NK和CD8+T細胞的頻率及其活化情 況：a圖為空載殼聚糖組NK細胞頻率及其活化情況；b圖為納米基因疫苗肌肉注射組NK細 胞表面NKG2D頻率及其活化情況；c圖為空載殼聚糖組CD8+T細胞頻率及其活化情況；d圖 為納米基因疫苗肌肉注射組CD8+NKG2D+T細胞頻率及其活化情況；e圖為納米基因疫苗肌 肉注射組⑶8+⑶44+T細胞頻率及其活化情況。

【具體實施方式】
[0045] I. pQE31-dsNKG2D-IL-15原核表達載體的構建
[0046] I. I PCR擴增的引物序列：利用生物信息學的手段，分別設計相應的引物，以人外 周血單個核細胞的cDNA為模板（見表1)擴增出sNKG2D (a)、sNKG2D (b)的基因片段；以pORF hIL-15載體（來自Invivogen公司）為模板，擴增出IL-15的基因片段。在sNKG2D(a)和 sNKG2D(b)的下遊引物序列上分別加上（Gly4Ser)4的反向互補序列（表1中方框內顯示）。
[0047] 表I. sNKG2D(a)、sNKG2D(b)及IL-15基因擴增的引物序列

【權利要求】
1. 一種融合基因，其特徵在於，由融合基因 dSNKG2D-IL-15基因的上遊引入鼠 β -2微 球蛋白的信號肽序列，得到的融合基因 ATG-sig-dsNKG2D-IL-15,其序列如SEQ ID Ν0:1所 /_J、1 ο
2. -種融合蛋白表達載體pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15,其特徵在於，其基因序列如 SEQ ID N0:2 所示。
3. -種納米基因疫苗，其特徵在於，由殼聚糖包封pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合 蛋白表達載體構成。
4. 如權利要求3所述納米基因疫苗，其特徵在於，所述殼聚糖為羥丙基三甲基氯化銨 殼聚糖。
5. -種製備權利要求3所述的納米基因疫苗的方法，其特徵在於，步驟如下： 1. pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體的構建：以原核表達載體 pQE31-dsNKG2D-IL-15為骨架，利用PCR分別擴增鼠 β 2-微球蛋白的信號肽及人NKG2D受 體的第一個胞外區的融合片段SEQ ID Ν0:4,和NKG2D的第2個胞外區及IL-15的融合片段 SEQIDN0:5，將這兩個片段先後插入pCDNA3.1(-)載體，得到融合蛋白表達載體 ； 2) 納米基因疫苗的製備：利用大提質粒試劑盒，大量提取無內毒素 pcDNA3. l-sig-dsNKg2D-IL-15融合蛋白表達載體，利用殼聚糖體外溶脹法製備成納米基因 疫苗。
6. 如權利要求5所述納米基因疫苗的製備方法，其特徵在於，所述殼聚糖為羥丙基三 甲基氯化銨殼聚糖。
7. 如權利要求5所述的納米基因疫苗的製備方法，其特徵在於，殼聚糖體外溶脹法制 備納米基因疫苗，包括如下步驟： 1) 將融合蛋白表達載體溶液滴加入殼聚糖中，300rpm，室溫振蕩30分鐘，混合均勻； 2) 4°C離心機離心20-25分鐘，徹底分離游離DNA和納米基因疫苗。
8. 權利要求3所述的納米基因疫苗在製備增強免疫或抑制腫瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104293815SQ201410479635
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】龔衛娟, 邵小青, 陳豔, 奚菊群, 肖煒明 申請人:揚州大學