蛋白質穩定製劑的製作方法

2023-07-30 02:48:46 2

專利名稱：：蛋白質穩定製劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於穩定骨形態發生蛋白(BMP's)的製劑和方法，和涉及處理、存儲和重構期間的密切相關的生長和分化因子(GDFs)。更特別的，本發明涉及由海藻糖和在凍幹、儲存和重構期間保護rhGDF-5的其它賦形劑組成的製劑，包括用作賦形劑以遞送rhGDF-5的各種底物。此外，本發明包括製備和使用這些製劑以治療各種肌骨骼缺陷和疾病的方法。
背景技術：
：生物分子具有三維結構或構型，並且其生物學活性和性質依賴於這種結構。這些生物分子的實例包括脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白質。這些生物分子對生命必不可少，並且代表了各種醫學疾病和病症的治療中的治療劑和靶體。蛋白質代表了較寬種類的生物分子。不同種類的蛋白質例如酶、生長因子、受體、抗體和信號分子的生物學活性取決於其構型結構。其它種類的蛋白主要為結構性的，例如膠原和軟骨，其本身不具有生物學活性。使生物分子暴露於各種環境中，例如pH、溫度、溶劑、滲透度等的變化可能不可逆改變或變性生物分子的構型狀態，使其生物學無活性。這些生物分子失活中涉及的某些機制包括聚集、氧化、各種類型的鍵裂解包括水解和脫醯胺，以及各種類型的鍵形成，包括交聯和其它共價鍵合，例如二硫鍵的重排。骨形態發生蛋白和密切相關的生長分化因子(單體和二聚形式)屬於TGF-P超家族蛋白質。這類蛋白質包括骨形態發生蛋白系中的成員，通過其誘導異位軟骨內骨形成的能力而初始確認(參見Cheng等人，"Osteogenicactivityofthefourteentypesofhumanbonemorphogenicproteins"J.BoneJointSurg.Am.85A:1544-52(2003))。部分這些蛋白質具有其它命名(參見Lories等人，CytokineGrowthFactorRev16:287-98(2005))。這類中的所有成員具有共同的結構特徵，包括羧基末端的活性區域，以及成熟長度為約97-106個胺基酸。所有成員具有半胱氨酸殘基的高保守模式，其產生3個分子內二硫鍵和一個分子間二硫鍵。活性形式可為單個家族成員的二硫鍵連的同二聚體，或為兩種不同家族成員的雜二聚體。(參見MassagueAnnu.Rev.CellBiol.6:957(1990);Sampath等人。J.Biol.Chem.265:13198(1990);Ozkaynak等人。EMBOJ.9:2085-93(1990);Wharton等人，PNAS88:9214-18(1991);Celeste等人，PNAS87:9843-47(1990);Lyons等人，PNAS86:4554-58(1989)，美國專利US5,011,691和美國專利US5,266,683)。已經證實多種糖能夠在溶液中穩定生物分子並且對分離細胞和生物分子產生保護。這些化合物在多種物種中作為冷凍保護劑和滲透壓調節劑沿用已久。(參見YanceyJ.Exper.Biol.208:2819-30(2005))。在凍幹藥物蛋白質的發展過程中，糖(糖類和多元醇)通常加入到製劑中以改善蛋白質的穩定性並延長存儲期限。關於糖穩定作用的機理，存在兩種主要理論1)糖賦形劑用於稀釋固態的蛋白，由此降低蛋白質相互作用並防止分子降解，例如聚合，和2)糖賦形劑提供玻璃狀基質，由此使得蛋白質流動性和反應性最小化。在這兩個機理中，關鍵的是糖保持在無定形、與蛋白質接觸的狀態。各種環境因素例如增加的溫度和溼度可能誘導糖的結晶。因此，重要的是使得使用的條件和材料最優化以適於考慮使用的具體生物分子和體系。凍幹為通常用於保存生物分子的方法。通常認為凍幹比冷凍-融化或很大程度上取決於不同的生物分子和不同的條件，並且各方面研究人員已經研究了不同的體系。水溶液的冷凍導致溶液濃度初始增加，並且對不穩定的化合物來說比冷凍本身更具破壞力。可以加入例如糖、蛋白質、聚合物、緩衝劑和表面活性劑的賦形劑以穩定生物分子的活性，然而取決於體系，具有有限和不同程度的成功。Crowe等人描述了通過糖穩定乾燥磷脂雙層和蛋白質(Biochem.J.242:1-10(1987)),並且在"Thetrehalosemythrevisited:Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate",Cryobiology43,89-105(2001)中公開了海藻糖穩定細胞機制的最新理解。為了維持有活力和有用的凍幹的蛋白質，目前認為存在兩種單獨和不同的需要1)蛋白質在冷凍過程中必須保護，和2)蛋白質必須在隨後的乾燥和重構期間保護。這些是不同的需要，沒有必要通過任何一種賦形劑或條件的設定來滿足。不同研究人員已經報導了使用各種賦形劑來保護各種生物分子，例如Gloger等人(Intl.J.Pharm.260:59-68(2003))公開了使用低分子量右旋糖苷穩定蛋白質對aviscumine的凍幹保護，並且表明緩衝體系和聚山梨醇酯80單獨適於在冷凍期間保護蛋白質，然而在乾燥期間需要右旋糖來保護蛋白質；Goodnough等人(Appl.Env.Biol.58(10:3426-28(1992))研究了使用血清蛋白作為穩定劑和各種其它賦形劑在凍千期間A型肉毒毒素的穩定性，並且報導沒有賦形劑具有任何有益的作用，然而通過從凍幹混合物中除去NaCl並且控制pH，活性毒素的復原顯著提高；Costantmo等人(J.Pharm.Sci.87(11):1412-20(1998))描述了各種糖對凍幹的重組人生長激素穩定性和結構的影響，並且表明全部測試的賦形劑顯著改善了蛋白質的穩定性；Ramos等人(Appl.Envir.Microbiol.63(10):4020-25(1997))表明2-0-卩-甘露糖基甘油酸酯在保護多種從各種來源分離的脫氫酶中有效，並且對於全部研究的酶，2-0-P-甘露糖基甘油酸酯賦予的保護與海藻糖相似或者優於海藻糖，然而在保護由P.furiosis分離的穀氨酸脫氫酶時並不有效；Brus等人(J.Control.Rel.95:119-31(2004))研究了寡聚核苷酸-聚乙烯亞胺(PEI)絡合物進行凍幹的穩定性，並且報導了這些絡合物沒有受益於例如蔗糖或海藻糖的糖類的加入，但質體-PEI絡合物則的確受益於這些糖類的加入。根據不同方法在各種生物分子上的測定，這些研究人員報導了不同程度的成功。沒有研究人員曾經報導對BMP的保護。因此，對於什麼是賦形劑的最佳組合以對生物分子的凍幹提供保護存在不一致的證據。沒有任何一種賦形劑的組合對全部生物分子都是最佳的，相反需要進行有效程度的實驗以得到所研究的生物分子的希望的結果。仍然需要藥學上可接受的賦形劑的組合以在凍幹、儲存和使用期間保護BMP。圖1表示實施例6所述的rhGDF-5的海藻糖製劑的DSC曲線。所述製劑為凍幹海藻糖+GDF-5，其中實施例6-rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，賦形劑濃度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中凍幹製劑使用水重構。最終濃度為0.33毫克/毫升蛋白質+3.3%海藻糖。圖2表示實施例7所述的rhGDF-5的甘露醇製劑的DSC曲線。所迷製劑為凍幹甘露醇糖+rhGDF-5，其中實施例7-rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，甘露醇濃度50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。其中凍幹製劑使用水重構。最終濃度為0.33毫克/毫升蛋白質+3,3%甘露醇。圖3表示rhGDF-5天然蛋白質的DSC曲線。其中0.01%TFA中GDF-5濃度1.04毫克/毫升，沒有賦形劑，相對於0.01%TFA滲析。其中10mM鹽酸中3.8毫克/毫升原料GDF-5相對於0.01%TFA滲析。最終蛋白質濃度為1.04毫克/毫升。圖4表示實施例6所述的rhGDF-5的海藻糖製劑的偏振光顯微圖，其表明海藻糖的所需無定形狀態。其為凍幹製劑實施例6,rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，海藻糖50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。圖5表示實施例7所述的rhGDF-5的甘露醇製劑的偏振光顯微圖，其表明甘露醇的非所需結晶狀態。其為凍幹製劑實施例7，rhGDF-5濃度0.5毫克/瓶，甘露醇50毫克/0.5毫克rhGDF-5，pH2.9。圖6表示如實施例12所述在40°C/75%RH下6個月後rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸製劑的rpHPLC曲線。圖7表示如實施例12所迷在4(TC/75%RH下6個月後rhGDF-5/海藻糖/HCl製劑的rpHPLC曲線。圖8、9和10表示如實施例12所述在5°C、25。C和40。C在不同時間點儲存時各種測試緩沖液的蛋白質回收百分率。其中圖8表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍幹的rhGDF-5在5r的穩定性；圖9表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍幹的rhGDF-5在25。C儲存後的穩定性；圖IO表示使用pH為3的不同緩沖液體系凍幹的rhGDF-5在4(TC儲存後的穩定性。圖11表示如實施例14所迷在pH3的甘氨酸緩沖液中使用5%或10%海藻糖在選定溫度凍千的不同濃度rhGDF-5的穩定性。
發明內容本發明一般涉及在各種製劑和組合物中穩定BMP，由此保持生物活性的至少60%並且改善儲藏條件要求，例如溫度和溼度。本發明包括主要含有海藻糖作為賦形劑的、用於含有BMP的凍幹組合物的製劑以及其隨後的儲存和重構，並且另外含有包括緩沖劑和表面活性劑的其它賦形劑。本發明人已經令人吃驚地發現，海藻糖在凍幹期間和凍幹之後足以保存BMP的生物學活性並且優於其它賦形劑。在多種其它生物分子的穩定中，若非BMP存在較大差異，對於得到保護的量，在各種糖之間存在很少的差異。這種發現提供了在患者中治療各種肌骨骼缺陷的組合物，而沒有加入賦形劑的不良反應。本發明人還令人吃驚地發現，例如抗壞血酸和穀胱甘肽的抗氧化劑的加入並沒有提高使用海藻糖凍幹的BMP的穩定性，而是降低了通過海藻糖得到的穩定性。本發明的一個目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的海藻糖，由此BMP在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，所述再水化的液體產物易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩沖劑、表面活性劑以及其混合物，由此BMP在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，所述再水化的液體產物易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和粉碎的(morselized)膠原纖維以提供組合物，以及製備含有BMP的凍幹的生物相容的可流動材料的方法，該材料穩定並且在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，由此所述再水化的產品易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP和生物相容的基質以提供組合物，以及製備含有BMP的凍千的生物相容的基質的方法，該基質穩定並且在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，由此所述再水化的產品易於被外科醫生處理。示例性的生物相容的基質包括膠原、礦物化膠原、磷酸鈣的鹽、含有鈣的陶瓷、各種來源的骨骼包括自生、外源和異體的骨骼，以及聚合物，包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、PLA-PGA共聚物、聚碳酸酯、聚己酸內酯以及其混合物。本發明另一目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的海藻糖、至少一種BMP、生物相容的基質和其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩衝劑、表面活性劑以及其混合物，以提供組合物和製備含有BMP的凍幹的生物相容的基質的方法，該基質穩定並且在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，由此所述再水化的產品易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用足以穩定凍幹的BMP的量的一種或多種凍幹保護劑和至少一種BMP以提供組合物和製備凍幹的BMP的方法，其中凍幹保護劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，由此BMP在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，所述再水化的產品易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用一種或多種凍千保護劑、至少一種BMP和膠原以提供組合物和製備含有BMP的凍千的生物相容的膠原基質的方法，其中凍幹保護劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，該基質穩定並且在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，由此所述再水化有展延性的產品易於被外科醫生處理。本發明另一目的是使用一種或多種凍千保護劑、至少一種BMP和粉碎化膠原纖維以提供組合物和製備含有BMP的凍幹的生物相容的可流動材料的方法，其中凍幹保護劑選自海藻糖、低分子量右旋糖、環糊精、聚乙二醇、聚乙二醇酯以及其混合物，該材料穩定並且在再水化作用時保持至少60%的生物學活性，由此所述再水化的產品易於被外科醫生處理。本發明的還一目的在於使用由至少一種凍幹保護劑和至少一種BMP的凍幹混合物組成的組合物治療患者的方法。通過直接將重構的BMP溶液施加到患者的解剖學區域，例如施加到骨折、骨縫、骨空隙、推間盤、軟骨缺陷、腱、韌帶等區域，或者將重構的BMP溶液施加到要植入患者的裝置，例如人造連接骨(bone-contacting)植入物，如人造髖、膝、肩、推間盤等等，腱錨(tendonanchor)、韋刃帶錨(ligamentanchor)、縫合線、卡釘(staple)等等，骨置換罩(bonereplacementcage)、自體骨碎片、同種異體骨碎片、異種骨碎片、去礦質骨碎片等等，這些組合物用於治療各種肌骨骼缺陷，以促進癒合過程。水溶液或乾燥固體形式的BMP不穩定，需要冷藏到-2(TC以下以保持蛋白質的生物活性。由於BMP易於聚集、二硫鍵重排、脫醯胺和氧化，需要一種製劑來保存和保護凍幹的BMP的生物學活性。凍幹的BMP產品需要具有改善的穩定性和儲存。仍然需要用於使用水溶液重構的凍千的BMP產品，用於注射到例如推間盤、非關節和關節軟骨的軟組織中以促進這些組織的再生。仍然需要凍千的BMP產品，其以醫師使用的合適的BMP濃度提供在可植入生物相容的支架上，由此最小化或消除多種與處置有關的危險，包括汙染、不合適的劑量以及洩漏，包括廢料，以及引入到不希望的手術位置。需要凍幹的BMP產品，其可以在易於施加到手術位置的生物相容的可流動材料中重構。由於BMP的發現，一直在進行大量的研究活動以發現用於治療各種肌骨骼缺陷和病症的治療應用中合適的組合物。當前存在含有BMP的以凍幹的固體出售的產品，其必須重構為液體並且在使用時由醫師施加到要被植入的支架或者外科治療位置。當前rhBMP-2製劑使用蔗糖NF、甘氨酸USP、L-穀氨酸FCC、氯化鈉USP和聚山梨醇酯80NF作為賦形劑，並且可在室溫下(15-25°C)儲存。當前OP-l製劑單獨使用牛膠原，並且必須在2-8。C儲存。關於重構BMP穩定性的賦形劑的效力，還沒有公開的報導。他人已經試圖通過使用甘露醇、蔗糖以及其混合物，通過將BMP包埋在例如PLGA的聚合母體中，通過加入例如蛋氨酸的抗氧化劑，通過加入例如組氨酸、精氨酸、環糊精和牛血清白蛋白的其它賦形劑，和加入例如吐溫80的表面活性劑，或者其組合，在凍幹期間增強BMP的穩定性。這些努力已經實現了不同程度的有限度的成功。美國專利US5,318,898和5,516,654公開了使用硫酸葡聚糖在培養基中製備BMP的改進方法，然而沒有闡述產生益處的機制並且沒有公開穩定蛋白質的任何其它有用的賦形劑。Yim等人在美國專利US5,385,887中^Hf了凍幹組合物和用於遞送BMP的製劑，所述組合物包括BMP、糖、甘氨酸和穀氨酸。雖然Yim等人/>開了通過W-20石威性磷酸酶測試證明的凍幹製劑保持了生物學活性，然而其沒有公開任一製劑與其它製劑相比顯示任何定量益處的對比數據。這些發明人沒有討論或確認海藻糖在BMP的凍幹中相對於蔗糖的優越性。本發明提供了組合物以及製備和使用BMP穩定製劑的方法，其可用於凍幹、儲存和用水溶液重構以由其治療患者。本發明根據以下說明性實施方案描述如下，並且使用rhGDF-5作為示範性BMP。本領域熟練技術人員將能夠理解，本發明可以在多種不同應用和實施方案中實現，'本發明二^面提供了一種組合物，和製備^後用於骨和軟骨缺陷的外科治療中穩定的凍幹的BMP的方法。正如此處所預想的那樣，這種組合物包括至少一種BMP和足以穩定BMP量的海藻糖。通過將重構的BMP溶液直接施加到患者的解剖區域，例如施加到骨折、骨縫、骨空隙、推間盤、外科用於融合的稚間盤間隙、軟骨缺陷、腱、韌帶等區域，或者施加到要植入到患者與骨或軟骨接觸的材料中，例如人造髖、人造膝、人造肩、人造推間盤、腱錨、韌帶錨、縫合線、卡釘(staple)、骨罩、自體骨碎片、同種異體骨碎片、異種骨碎片、去礦質骨碎片等等，這些組合物用於治療各種肌骨骼缺陷。此處使用的術語"形態發生"、"骨骼形態發生"、"骨骼形態發生蛋白質"、"BMP"、"成骨蛋白質"、"成骨因子"、"生長&分化因子"和"GDF"包括rhGDF-5代表的一類蛋白。然而本領域熟練技術人員將能夠理解，rhGDF-5僅僅作為能夠用作BMP的實際組織形態發生素的典型TGF-p系亞組，並且並不意圖限制說明。術語"冷凍保護劑"用來表示能夠在冷凍期間穩定生物分子的分子，並且在當前上下文中等同於術語"凍幹保護劑"，其指的是能夠在凍幹期間穩定生物分子的分子。此處使用的術語"粉碎化(morselized)"指的是通過切割、砍碎、切斷、研磨、粉碎或者其它降低例如膠原的生物相容基質的量的尺寸、由此單個顆粒或纖維的總尺寸降低的方法得到產品，並且"粉碎化(morselization)"指的是上述方法。此處使用的術語"賦形劑"指的是添加到至少一種BMP中的至少一種其它化合物，其中所述其它化合物選自胺基酸、蛋白質、緩衝劑、表面活性劑以及其混合物。已知rhGDF-5在pH4.5至pH10.5範圍的中性pH內具有較差的溶解度。因此難以在此pH範圍內配製和製備rhGDF-5產品。因此本發明人設計一種研究以評價rhGDF-5在pH3和pH4緩衝液中的溶解度，選擇形成蛋白質製劑的合適的pH範圍是關鍵的。研究結果如實施例11所述。rhGDF-5的溶解度不僅取決於緩衝液的pH,還取決於緩衝溶液的離子強度。在pH為4時，約10毫克/毫升的rhGDF-5溶液在5和10mM石克酸鈉緩衝液中混濁，然而在50和100mM石克酸鈉緩沖液中rhGDF-5形成更大的顆粒並且最終沉澱出來。在另一研究中(數據沒有顯示)，當rhGDF-5以3.5毫克/毫升的濃度在pH為3.5和pH為4的5mM硫酸鹽緩衝液中配製時，溶液仍然混濁。蛋白質的溶解度通常在過度飽和/沉澱的溶液離心後測量蛋白質濃度確定。然而某些混濁的蛋白質溶液難以離心或過濾。即便是在混濁溶液進行離心或過濾(0.22微米)以除去不溶性顆粒後，由於顆粒如此細小濾液仍然看起來混濁，這通常不成功，並且有時蛋白質常常粘在過濾器表面，因而濾液損失了大部分蛋白質。因此當rhGDF-5以3.5毫克/毫升或10毫克/毫升濃度在pH為3.5或pH為4的緩衝液中配製時難以得到透明溶液。當rhGDF-5以10毫克/毫升濃度在5mM、10mM和25mM磷酸鈉溶液中在pH為3.0配製時，蛋白質溶液透明；然而當rhGDF-5以10毫克/毫升在更高離子強度的溶液例如50mM和100mM磷酸鈉中配製時，rhGDF-5溶液混濁。因此在一個優選實施方案中，rhGDF-5應當在低離子強度緩衝液中在約3.0的pH配製。在根據本發明的一個實施方案中，組合物可通過凍幹至少一種BMP和足以穩定BMP量的海藻糖的混合物製備，對於含有產品的生物相容的基質，海藻糖與BMP的乾重比例為每1毫克BMP約1毫克至約500毫克海藻糖，更優選每1毫克BMP約5毫克至約200毫克海藻糖。海藻糖的加入為凍幹製劑中的蛋白質提供改善的溶解度和穩定性。凍幹根據本領域通常已知的方法進行。在另一實施方案中，根據本發明的組合物可通過凍幹至少一種BMP、足以穩定BMP量的海藻糖和緩衝液的含水混合物製備。緩衝劑的加入為凍幹製劑中的蛋白質提供改善的溶解度和穩定性。本領域已知的生物相容的緩衝劑包括甘氨酸；乙酸鈉、鉀或鈣鹽；檸檬酸鈉、鉀或鈣鹽；乳酸鈉、鉀或鈣鹽；磷酸鈉或鉀鹽，包括磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽、磷酸鹽以及其混合物。緩衝劑另外可以具有加入到組合物中起填充劑作用的甘氨酸。甘氨酸將以每1毫克BMP約0.04毫克至約200毫克甘氨酸的比例加入，更優選以每0.04毫克BMP約1亳克至約80毫克甘氨酸的比例加入。與單獨具有海藻糖的組合物相比，緩衝劑和填充劑的加入為蛋白質提供稍微更優越的穩定性，pH控制在約2.0至約5.0pH單位，更優選約2.5至約4.5pH單位。在可供選擇的實施方案中，根據本發明的組合物和方法可通過凍幹至少一種BMP、足以穩定BMP量的海藻糖、緩衝劑和選自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20以及其混合物的表面活性劑的含水混合物製備。表面活性劑將以每1毫克BMP約0.001毫克至約0.2毫克的濃度加入。通過改變溶解度和凍幹特性，表面活性劑的加入為蛋白質另外提供穩定性。凍千根據本領域通常已知的方法進行。在本發明另一實施方案中，穩定的凍幹BMP的組合物和方法包括至少一種BMP、足以穩定至少一種BMP的量的凍千的海藻糖，以及至少一種其它賦形劑，所述其它賦形劑選自緩衝劑和表面活性劑。與具有海藻糖作為單獨的賦形劑的組合物相比，這種緩衝劑和表面活性劑的加入為凍幹的BMP提供增加的改善的穩定性。在另一實施方案中，根據本發明的組合物和方法可通過在凍幹BMP/膠原混合物之前將至少一種BMP和至少一種賦形劑的溶液沉積在凍幹膠原上製備。膠原可任選被交聯或礦物化，或者既交聯又礦物化，例如通過已爭為Healos的材料提供並且公開在美國專利US5,972,385、5,866,165、5,776,193、5,455,231和5,231,169中。該實施方案中提供的組合物特別可用於治療整形外科領域的醫學病症，並且提供柔性可延伸的材料,醫師可容易地將其置於手術位置以生成骨、軟骨或腱。BMP/膠原混合物可使用水溶液重構，包括無菌水、鹽水和骨髓吸出物，並且直接施加在患者的缺陷部位，例如骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術為脊柱融合術準備的推間盤間隙。此外，BMP/膠原混合物可用於填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術期間放入推間盤間隙中的植入物中，放入具有損傷或失去的軟骨的區域中，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關節軟骨中的軟骨缺陷，以及關節軟骨中的亞軟骨缺陷。在另一實施方案中，片艮據本發明的組合物和方法可如下應用通過製備至少一種BMP和至少一種賦形劑的凍幹混合物、使用水、鹽水或骨髓吸出物重構該凍幹BMP混合物，並且在手術移植BMP/膠原混合物之前將該重構的BMP溶液置於凍幹膠原之上。"交原可任選糹皮交聯或礦物化，或者既交聯又礦物化，例如通過已知為Healos⑧的材闢十提供。該實施方案中提供的組合物和方法特別可用於治療整形外科領域的醫學病症，並且提供柔性可延伸的材料，醫師可容易地將其置於手術位置以生成骨、軟骨或腱。BMP/膠原混合物可直接施加到患者的缺陷部位，例如骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術為脊柱融合術準備的推間盤間隙、填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術期間放入推間盤間隙中的植入物中，放入具有損傷或失去的軟骨的區域中，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關節軟骨中的軟骨缺陷，以及關節軟骨中的亞軟骨缺陷。由於具有BMP作為分離組分和來自膠原材料的容器，該實施方案中提供的組合物和方法由於易於儲存和製備也特別有用。在另一實施方案中，根據本發明的組合物和方法可通過在凍幹BMP/粉碎化膠原混合物之前將至少一種BMP和至少一種賦形劑的溶液沉積在凍幹的粉碎化膠原上製備。粉碎化膠原可任選被交聯或礦物化，或者既交聯又礦物化。這種粉碎化提供直徑約25微米長約110微米的較小膠原纖維，其得到適於注射到手術位置的可流動組合物。這種組合物的重構可使用例如無菌水、鹽水或骨髓吸出物的水溶液和膠原凝膠的混合物進行，膠原凝膠控制重構產品的粘度。膠原凝膠含有約0.1%至約30%重量/重量的膠原，更優選約0.3%至約3.0%重量/重量的膠原，膠原凝膠的粘度優選為約10釐泊(cp)至約400釐泊，並且更優選約70釐泊至約100釐泊。膠原凝膠的pH優選約4.0pH單位至約8.0pH單位。這種組合物用於治療各種肌骨骼疾病，包括但不限於骨折、骨縫隙、骨空隙和通過手術為脊柱融合術準備的推間盤間隙、填充骨碎片之間的空隙以及在脊柱融合術期間;改入稚間盤間隙中的才直入物中，具有損傷或失去的軟骨的區域，例如斷裂或損傷的腱、斷裂或損傷的韌帶、關節軟骨中的軟骨缺陷，以及關節軟骨中的亞軟骨缺陷。在另一實施方案中，根據本發明的組合物和方法可如下使用，通過製備至少一種BMP和至少一種賦形劑的凍幹混合物、使用水或鹽水重構該凍幹BMP混合物，並將該重構的BMP溶液注入到推間盤。該實施方案中提供的組合物和方法特別用於治療稚間盤。具體實施方式實施例在以下實施例中，4吏用以下實-驗方法為了進行RP-HPLC純度研究，使用10mM鹽酸將重構rhGDF-5試樣稀釋到0.1毫克/毫升的濃度，並且在5(TC和0.3毫升/分鐘的流速在Vydac218TP52柱上進行反相HPLC。rhGDF-5使用0.15%三氟乙酸中的乙腈的梯度洗脫，使用UV在214納米檢測。對於圓二色光譜(CD)研究，圓二色光語在AVIVModel60DS圓二色光譜旋光分光計上進行。使用相應賦形劑的基線空白對照劑的掃描從樣品掃描中減去。該掃描使用平均殘基分子量(值為l5)歸一化並將其插入到方程式中=/[濃度(毫克/毫升)x光程]的值在每個波長計算以得到平均殘基橢圓率。最終，次級結構的估算使用程序PROSECv.2.1確定(1987年AVIVAssociates取得版;k)。差示掃描量熱(DSC)在MicroCalVP-DSC儀上進行。掃描速率為6(TC/小時。溫度範圍為5-10(TC。儀器基線掃描(空白對照組數據)從試樣熱掃描中減去。蛋白質濃度為0.33毫克/毫升。偏振光顯微術(PLM)用於結晶度評價。痕量固體試樣從處於相對溼度為1%的幹空氣包中的小瓶中取出。將固體試樣分布在玻璃載片上並將一滴二氧化矽油滴加在固體試樣上。然後載片使用裝有索尼CCD-IRIS/RGB彩色攝像機和偏振光附件的蔡司(zeiss)光學顯微鏡研究。FlashBusFBG軟體用於捕捉圖像。原料rhGDF-5在-80。C以10mM鹽酸中3.8毫克/毫升的濃度從Bi叩harm得到。在用於製劑之前，冷凍的原料蛋白質在2-8。C解凍整夜。實施例h具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/條)和海藻糖50毫克/毫升的Healos⑧條(非無菌)。每個條具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖。海藻糖溶液的製備25.48克二水合海藻糖仔細稱重並轉移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入350毫升純淨水並緩慢攪拌直到得到透明溶液。向該透明溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調節為3.9，然後使用純淨水調節體積以得到400毫升最終體積。測量pH並且發現pH為4.2。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並直接使用以稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將22.39毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯〗統中，小心向其中加入海藻糖溶液以將體積調節至150毫升；測量pH並且發現pH為2.5。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多海藻糖溶液以在170毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為2.7;UV讀數指示0.499毫克/毫升的蛋白質含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接施加到Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點上，每個條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條插入在2釐米x2釐米小PETG託盤中，並且將小託盤插入到大PETG託盤中並凍幹。每個大託盤容納24個條。表la:每個條具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的穩定性(實施例1)tableseeoriginaldocumentpage15表lb:每個條具有海藻糖(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩、定性(實施例1)tableseeoriginaldocumentpage15實施例2:具有rhGDF-5(0:5毫克/毫升,5毫升/條)和甘露醇50毫克/毫升的Healos⑧條(非無菌)。每個條具有2.5毫克rhGDF-5和毫克甘露醇。甘露醇溶液的製備23.03克甘露醇仔細稱重並轉移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入350毫升純淨水並緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量pH並且發現pH為7.2;逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調解為3.8;然後使用純淨水調節體積以得到400毫升最終體積。測量pH並且發現pH為3.9。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並直接使用以稀釋蛋白質溶液。使用甘露醇溶液稀釋rhGDF-5溶液將22.37毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯並瓦中，小心向其中加入甘露醇溶液以將體積調節至150毫升。測量pH並且發現pH為2.7。將溶液在室溫下攪拌l5分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多甘露醇溶液以在170毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為2.8;UV讀數指示0,493毫克/毫升的蛋白質含量。rhGDF-5/甘露醇溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接施加到Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液等同施加在條的兩點上，每個條上總共有5毫升rhGDF-5/甘露醇溶液。這些條插入在2釐米x5釐米小PETG託盤中，並且將小託盤插入到大PETG託盤中並凍幹。每個大託盤容納24個條。表2a:每個條具有甘露醇(250毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在25。C的穩定性(實施例2)tableseeoriginaldocumentpage16表2b:每個條具有甘露醇("0毫克)和rhGDF-5(2.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩定性(實施例2)tableseeoriginaldocumentpage17實施例3:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，5毫升/條)和海藻糖100毫克/毫升的Healos⑧條(無菌)。每個條具有2.5毫克rhGDF-5和500毫克海藻糖。海藻糖溶液的製備25.49克二水合海藻糖仔細稱重並轉移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入190毫升純淨水並緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量透明海藻糖溶液的pH並發現pH為6.2。沒有向溶液中加入鹽酸以調節pH。使用純淨水調節體積以得到200毫升最終體積。測量pH並且發現pH為6.3。將溶液直接用於稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將23.03毫升rhGDF國5溶液小心轉入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖溶液以將體積調節至170毫升；測量pH並且發現pH為3.0。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多海藻糖溶液以在175毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為3.0;UV讀數指示0.518毫克/毫升的蛋白質含量。rhGDF-5/海藻糖溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點上，每個條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條置於鋼託盤中，並且將其小心包裝在無菌雙重袋中，並在無菌條件下進行凍幹。表3a:每個條具有海藻糖(500毫克)/rhGDF_5(2.5毫克)的Healos在2-8。C的穩定性(實施例3)__tableseeoriginaldocumentpage17實施例4:具有低劑量rhGDF-5(5毫升/條，0.5毫克/毫升)、海藻糖40毫克/毫升和甘氨酸10毫克/毫升的Healos⑧條(無菌)。每個條具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖和50毫克甘氨酸。海藻糖/甘氨酸溶液的製備17.84克二水合海藻糖和4.03克甘氨酸仔細稱重並轉移到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入300毫升純淨水並緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量pH並發現pH為5.5。沒有加入鹽酸，使用純淨水將體積調節至350毫升。測量pH並且發現pH為5.5。使用海藻糖/甘氨酸溶液稀釋rhGDF-5溶液將39.47毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸溶液以將體積調節至295毫升；測量pH並且發現pH為4.1。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多海藻糖溶液以在300毫升溶液得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為4.1;UV讀數指示0.507毫克/毫升的蛋白質含量。溶液通過0.22微米過濾器過濾，並且溶液直接用於施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液等同施加在條的兩點上，每個條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。這些條置於鋼託盤中，並且將其小心包裝在無菌雙重袋中，並在無菌條件下進行凍幹。表4a:每個條具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩定性(實施例4)tableseeoriginaldocumentpage18表4b:每個條具有海藻糖(200毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)的Healos⑧在25°C的穩定性(實施例4)tableseeoriginaldocumentpage18實施例5:具有rhGDF-5(0.5毫克/毫升，2.5毫克/條)、海藻糖40毫克/毫升、甘氨酸10毫克/毫升和聚山梨醇酯0.1毫克/毫升的Healos條(無菌)。每個條具有2.5毫克rhGDF-5、220毫克海藻糖、50毫克甘氨酸和0.5毫克聚山梨醇酯80。聚山梨醇酯80溶液的製備23.03毫克聚山梨醇酯80稱重到50毫升無菌一次性試管中，向其中加入25毫升純淨水並旋轉2分鐘以得到均勻溶液。海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液的製備10.19克二水合海藻糖和2.303克甘氨酸仔細稱重並轉移到無菌聚丙烯並瓦中，向其中加入25毫升上面得到的聚山梨醇酯80溶液。將聚山梨醇酯試管用25毫升純淨水清洗2次，並將清洗液轉入到海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。向海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液中另外加入純淨水達到190毫升的總體積。將溶液攪拌2分鐘以得到透明溶液。測量溶液的pH並且發現pH為5.6;使用純淨水將體積調節至200毫升。測量pH並且發現pH為5.5。使用海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液稀釋rhGDF-5溶液將23.03毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯燒瓶中，小心向其中加入海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以將體積調節至170毫升；測量pH並且發現pH為4.1。將溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液以在175毫升溶液得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為4.1;UV讀數指示0.510毫克/毫升的蛋白質濃度。通過0.22微米過濾器過濾的溶液直接使用，在無菌條件下在層流罩中施加到無菌Healos⑧條上。使用無菌移液管將2.5毫升rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液等同施加在條的兩點上，每個條上總共有5毫升rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸/聚山梨醇酯溶液。這些條置於鋼託盤中，並且將其小心包裝在無菌雙重袋中，並在無菌條件下進行凍幹。表5a:每個條具有海藻糖U00毫克)/rhGDF-5(2.5毫克)/甘氨酸(50毫克)/聚山梨醇酯80(0.5毫克)的Healos⑧在2-8。C的穩定性(實施例5)tableseeoriginaldocumentpage20實施例6:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)的凍幹小瓶產品海藻糖溶液的製備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖並安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入190毫升純淨水。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。測量pH並且發現pH為6.5。向透明海藻糖溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調節至5.8。將溶液體積用純淨水調節至200毫升；測量pH並且發現pH為5.5。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並直接用於稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉燒瓶的同時向其中緩慢加入海藻糖溶液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉15分鐘；測量pH並且發現pH為3.0。根據UV讀數，加入更多海藻糖溶液以在110毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為3.1;UV讀數指示0.510毫克/毫升的蛋白質濃度。將溶液通過0.22孩i米過濾器過濾並且直接加入到小並瓦中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，並且每個小瓶在進入凍幹器前部分用塞子封閉。凍幹後將塞子壓緊並折邊。以白色至灰白色結塊(cake)得到產品。表6a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小並瓦在2-8匸的穩定性(實施侈6)tableseeoriginaldocumentpage21表6b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在25r的穩定性(實施例6)tableseeoriginaldocumentpage21實施例7:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)的凍幹小並瓦產品甘露醇溶液的製備無菌聚丙烯瓶加入11.52克甘露醇並安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入185毫升純淨水。將混合物在室溫下攪拌10分鐘直到甘露醇徹底溶解。測量pH並且發現pH為6.6。向透明溶液中逐滴加入0.1N鹽酸以將pH調節至5.5。將溶液體積用純淨水調節至200毫升；測量pH並且發現pH為5.7。將溶液通過0.22孩麼米過濾器過濾並直接用於稀釋蛋白質溶液。使用甘露醇溶液稀釋rhGDF-5溶液向聚丙烯燒〗f瓦中小心轉入14.48毫升rhGDF-5溶液；向其中小心加入甘露醇溶液至100毫升的體積。溶液在室溫下旋轉15分鐘；得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多甘露醇溶液以在110毫升溶液中得到所需蛋白質濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為3.1;UV讀數指示0.498毫克/毫升的蛋白質濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升甘露醇/rhGDF-5溶液手動加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，並且每個小瓶在進入凍幹器前部分用塞子封閉。凍幹後將塞子壓緊並折邊。以白色至灰白色結塊得到產品。表7a:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在2-纊C的穩定性(實施例7)formulaseeoriginaldocumentpage22表7b:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加甘露醇(50毫克/毫升)小瓶在25C的穩定性(實施例7)tableseeoriginaldocumentpage23實施例8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩衝液中的凍幹小瓶產品海藻糖溶液的製備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖並安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入200毫升pH為3.0的5mM甘氨酸-鹽酸緩衝液。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。海藻糖/甘氨酸溶液的pH為3.1。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並直接用於稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量為3000的截斷薄膜在2-8匸相對於5mM甘氨酸-鹽酸緩衝液滲析。滲析後溶液略微濃縮至3.8毫克/毫升。將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉燒瓶的同時向其中緩慢加入海藻糖-甘氨酸溶液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉15分鐘；測量pH並且發現pH為3.0。根據UV讀數，加入更多海藻糖-甘氨酸溶液以在U0毫升溶液中得到所需蛋白質濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為3.0;UV讀數指示0.507毫克/毫升的蛋白質濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，並且每個小瓶在進入凍幹器前部分用塞子封閉。凍幹後將塞子壓緊並折邊。以白色至灰白色結塊得到產品。表8:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩衝液中的穩定性(實施例8)tableseeoriginaldocumentpage24實施例9:rhGDF-5(0,5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)在pH為3.0的磷酸鹽緩衝液中的凍幹小瓶產品海藻糖溶液的製備無菌聚丙烯瓶加入12.16克二水合海藻糖並安裝磁力攪拌棒，在室溫下向其中加入200毫升pH為3.0的5mM磷酸鹽緩衝液。將溶液在室溫下攪拌直到海藻糖徹底溶解。海藻糖/磷酸鹽緩衝液溶液的pH為3.0。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並直接用於稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液原料rhGDF-5溶液使用分子量為3000的截斷薄膜在2-8°C相對於磷酸鹽緩衝液滲析。滲析後溶液略^f敖濃縮至3.8毫克/毫升。將14.47毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯燒瓶中，在旋轉燒瓶的同時向其中緩慢加入海藻糖/磷酸鹽緩衝液至100毫升的最終體積。溶液在室溫下偶爾旋轉15分鐘；測量pH並且發現pH為3.0。根據UV讀數，加入更多海藻糖/磷酸鹽緩衝液以在110毫升得到所需濃度0.5毫克/毫升；測量pH並且發現pH為3.0;UV讀數指示0.50毫克/毫升的蛋白質濃度。將溶液通過0.22微米過濾器過濾並且直接加入到小瓶中。填充小瓶1.1毫升rhGDF-5/海藻糖溶液手動加入到5毫升1型燧石玻璃瓶中，並且每個小瓶在進入凍幹器前部分用塞子封閉。凍幹後將塞子壓緊並折邊。以白色至灰白色結塊得到產品。表9:rhGDF-5(0.5毫克/毫升)加海藻糖(50毫克/毫升)小瓶在pH為3.0的磷酸鹽緩衝液中的穩定性(實施例9)tableseeoriginaldocumentpage26實施例10:具有2.5毫克rhGDF-5和250毫克海藻糖的粉碎化膠原圓柱體海藻糖溶液的製備9.56克二水合海藻糖仔細稱重並加入到無菌聚丙烯瓶中，在室溫下向其中加入145毫升純淨水並緩慢攪拌直到得到透明溶液。測量該透明溶液的pH並且發現其為5.3。使用純淨水調節體積以得到150毫升的最終體積。測量溶液的pH並且發現其為5.3。該溶液直接用於稀釋蛋白質溶液。使用海藻糖溶液稀釋rhGDF-5溶液將16.45毫升rhGDF-5溶液小心轉入到聚丙烯燒ife中，向其中小心加入海藻糖溶液以將體積調節至120毫升；測量pH並且發現pH為2.9。溶液在室溫下攪拌15分鐘。得到UV消光係數以精確計算蛋白質濃度。根據UV讀數，加入更多海藻糖溶液以在125毫升溶液中得到0.5毫克/毫升的所需蛋白質濃度；測量pH並且發現pH為2.9;UV讀數指示0.498毫克/毫升的蛋白質濃度。使用rhGDF-5/海藻糖溶液配製粉碎化膠原圓柱體溶液通過0.22微米過濾器過濾，並直接使用所得溶液分布在預先形成的壓緊在Teflon模具中的粉碎化膠原圓柱體上。在凍幹之前每個圓柱體配有5毫升rhGDF-5/海藻糖溶液。表10:每個圓柱體中具有rhGDF-5(2.5毫克)和海藻糖("0毫克)的粉碎化膠原圓柱體在2-8'C的穩定性(實施例10)tableseeoriginaldocumentpage27已經研發了製備具有賦形劑和可溶膠原凝膠的可流動粉碎化膠原/rhGDF-5的不同實例，並且對每個實例評價了其性能、穩定性和是否易於製備。粉碎化膠原實施例1-凍千為乾燥形式的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5-潤溼形式的膠原凝膠保持分離-兩者分別在2-8X:保持在分開的注射器中-兩者在注射前混合。4分碎化膠原實施例2-以溼潤形式混合在一起的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5&膠原凝膠(沒有凍幹)-全部以溼潤形式在2-8°C放在一個注射器中；即可使用粉碎化膠原實施例3-凍幹為乾燥形式的粉碎化膠原圓柱體&rhGDF-5&膠原凝膠-全部以千燥形式在2-8。C放在一個注射器中-在注射之前用水再水化。粉碎化膠原實施例4-粉碎化膠原圓柱體&膠原凝膠以糊狀物在一起-rhGDF-5以千燥形式單獨放置-兩者在2-8匸分別放在不同注射器中-兩者在注射之前混合。粉碎化膠原實施例5-粉碎化膠原圓柱體&膠原凝膠以千燥形式放在一起-rhGDF-5以乾燥形式單獨;改置-兩者在2-8。C分別放在不同注射器中-使用無菌水或骨髓吸出物重構rhGDF-5-在注射之前千燥的粉碎化膠原和膠原與重構的rhGDF-5溶液混合。在有例如甘露醇、蔗糖和海藻糖的幾種賦形劑並且存在或不存在緩衝劑和抗氧化劑的條件下，rhGDF-5的穩定性通過以下方法評價RP-HPLC、差示掃描量熱(DSC)、圓二色光譜(CD)、偏振光顯微術(PLM)以及生物測定。幾種含有蔗糖的rhGDF-5凍幹製劑在儲存期間顯示出不希望的黃色和玻璃狀結塊結構，因而是沒有希望的。凍幹rhGDF-5製劑的熔融性能使用DSC研究。DSC數據表明海藻糖和甘露醇基製劑顯著改善了原料rhGDF-5的熱穩定性。圖1、2和3表示rhGDF-5的海藻糖製劑和甘露醇製劑的DSC曲線與原料rhGDF-5的DSC曲線的比較。原料rhGDF-5表現兩個主要轉變一個接近4(TC並且另一個接近85°C。高溫轉變可能表示蛋白質的熱展開。值得注意的是，第一吸熱轉變的溶解溫度(Tm)在賦形劑的存在下增加7-14。C。單獨考慮時，該研究表明海藻糖和甘露醇可同樣有效地作為穩定劑。海藻糖/rhGDF-5製劑的PLM(偏振光顯微術)如圖4所示。樣品沒有顯示主要的雙折射現象。因此該體系為無定形，其對治療應用來說理想的。圖5表示儲存一段時間後甘露醇/rhGDF-5製劑的PLM。在樣品中觀察到許多晶體，表明甘露醇在儲存期間已經結晶。結果表明海藻糖為rhGDF-5更好的凍幹保護劑。遠UVCD光譜表明海藻糖基製劑具有與天然原料蛋白質可比的次級結構分布。具有各種賦形劑的凍幹rhGDF-5通過RP-HPLC的實時穩定性研究清楚地表明，以50毫克/毫升或100毫克/毫升濃度存在海藻糖的rhGDF-5,不管存在還是不存在緩衝劑並且有還是沒有聚山梨醇酯，在2-8匸和15-25。C的儲存條件下一致產生改善的穩定性，然而甘露醇在類似存儲條件下不能提供相同的穩定性水平。凍乾結塊製劑的實時穩定性研究清楚地表明，由在室溫和2-8。C儲存條件下，主峰顯著降低同時聚集物峰值增加可證明，甘露醇沒有穩定蛋白質。由於能夠產生免疫反應和副作用，聚集物為蛋白質製劑中最不希望的物質。相比之下，如實時穩定性研究中所證實，特別是在2-8匸的儲存條件下通過抑制聚集物的形成和保護主峰，海藻糖很好地穩定了蛋白質。因此在穩定製劑中的rhGDF-5時，海藻糖比甘露醇更好。實時穩定性數據還表明，具有磷酸鹽或甘氨酸作為緩衝液以控制pH的rhGDF-5/海藻糖製劑比沒有緩衝液的rhGDF-5/海藻糖製劑更好。實時穩定性數據表明，rhGDF-5海藻糖/甘氨酸製劑的理想儲存是在2-8°C,並且在25。C儲存也合適。除了海藻糖基rhGDF-5製劑有利的生化和生理數據外，這些製劑還在石鹹性-疇酸酶生物測定中顯示效力。物理化學分析方法、體外測試方法以及實時穩定性數據顯示海藻糖在凍幹獨立產品中，以及用於治療各種肌骨骼病症的膠原基組合產品中，在穩定rhGDF-5中作為優越賦形劑的前途o實施例11:rhGDF-5在不同離子強度溶液和兩種pH緩衝液(pH3和pH4)中的溶解度磷酸鈉緩衝劑的不同離子強度的溶液用於該研究。原料蛋白質溶液濃縮至約10毫克/毫升並且使用5、10、25、50和100mM磷酸鹽緩衝液在pH3或pH4滲析。滲析後，；險查樣品透明度並在UV-Vis分光光度計上分析蛋白質濃度。詳細步驟如下所述。緩衝液製備pH為3的100mM磷酸鹽緩衝液13.5毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3並轉入2000毫升量筒。加入水補充到2000毫升。然後倒回燒杯並充分混合。pH為3的50mM磷酸鹽緩衝液6.76毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3並轉入2000毫升量筒。加入水補充到2000毫升。然後倒回燒杯並充分混合。pH為3的25mM磷酸鹽緩衝液3.39毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3並轉入2000毫升量筒。加入水補充到2000毫升。然後倒回燒杯並充分混合。pH為3的10mM-粦酸鹽緩衝液1.35毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3並轉入2000毫升量筒。加入水補充到2000毫升。然後倒回燒杯並充分混合。pH為3的5mM磷酸鹽緩衝液0.676毫升濃磷酸(14.8M)溶液轉入到2000毫升燒杯，向其中加入去離子水以達到1900毫升刻度。將溶液使用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3並轉入2000毫升量筒。加入水補充到2000毫升。然後倒回燒杯並充分混合。樣品製備原料蛋白質rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解凍。原料蛋白質溶液(24毫升，3.8毫克/毫升)使用離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約6毫升的體積。約0.9毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉入到各個滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)並相對於磷酸鹽緩衝液在室溫下滲析整夜。濃縮的rhGDF-5溶液小心從滲析過濾片中移出並放入小玻璃管中以#全查溶液透明度。如分析方法部分所述，蛋白質濃度在UV-Vis分光光度計上確定。在pH為4的溶解度通過向pH為3的緩衝液中加入更多的氫氧化鈉溶液由pH為3的緩衝液製備pH為4.0的緩衝液。蛋白質溶液相對於pH為4的緩衝液在室溫下滲析整夜。分析樣品的溶液透明度和蛋白質濃度。分析方法對小玻璃管中的溶液樣品檢查透明度和顆粒。樣品小瓶使用垂直光線對著黑色背景檢查。試樣的透明度與作為對照的純淨水樣品比較。每個溶液樣品的pH直接使用校準pH計測量。結果10毫克/毫升rhGDF-5溶液溶解度研究的結果表明，在5、10和25mM較低離子強度的磷酸鈉緩衝液中得到透明溶液，顯示良好的溶解度，然而在50和100mM較高離子強度的磷酸鈉緩衝液中得到混濁溶液，顯示較差的溶解度。在pH為4時，5和10mM磷酸鈉緩衝液得到混濁溶液，顯示較差的溶解度。25、50和lOOmM的磷酸鈉緩衝液在離心後得到透明溶液，然而具有接近零的蛋白質回收率，表明蛋白質已經沉澱。因此，接近pH為3的低離子強度緩衝液將優於在較高pH的高離子強度緩衝液。實施例12:rhGDF-5在具有5%海藻糖的各種緩衝液中在不同溫度下的穩定性在此研究中，測試了各種緩沖液在保護5%海藻糖溶液中0.7毫克/毫升rhGDF-5在冷凍乾燥期間和在5X:儲存時的影響。測試的緩衝液為pH為3的5mM甘氨酸-鹽酸、pH為3的5mM;壽酸鈉、pH為3的5mM鬥寧檬酸鈉、pH為3的10mM乳酸鈉、水中的0.0"/。TFA、1mM鹽酸，以及不存在海藻糖的rhGDF-5在1mM鹽酸中的對照溶液。緩衝液如下製備pH為3的5mM甘氨酸緩衝液2000毫升燒杯中加入0.75克甘氨酸(分子量75.05克)和1900毫升去離子水；在攪拌下將該溶液使用鹽酸溶液滴定至pH為3。加入水補充至2000毫升並充分混合。pH為3的5mM檸檬酸緩衝液2000毫升燒杯中加入2.11克一水合檸檬酸(分子量210.14克)和1900毫升去離子水；將該溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補充至2000毫升並將溶液充分混合。pH為3的5mM磷酸鹽緩衝液將0.676毫升磷酸溶液(14.8M)轉入到含有1900毫升去離子水的2000毫升燒杯中；將該溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補充至2000毫升並將溶液充分混合。pH為3的10mM乳酸鹽緩衝液2000毫升燒杯中加入1.81克乳酸(分子量90.08)和1900毫升去離子水；將所得溶液用氫氧化鈉溶液滴定至pH為3。加入水補充至2000毫升並將溶液充分混合。1mM鹽酸溶液1毫升2N鹽酸溶液轉入到含有1900毫升去離子水的2000毫升燒杯中。通過加入更多去離子水將溶液的最終體積調節至2000毫升。0.01yjFA溶液0.2毫升TFA溶液轉入到含有1900亳升去離子水的2000毫升燒杯中。通過加入更多去離子水將溶液的最終體積調節至2000毫升並將溶液充分混合。製劑製備原料蛋白質rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8。C解凍。原料蛋白質溶液(55毫升，3.8毫克/毫升)使用離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約10毫升的體積。約1.4毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉入到各個滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380)過濾片相對於測試緩衝液在2-8。C滲析整夜。rhGDF-5溶液小心/人滲析過濾片中除去並轉入到小玻璃並瓦中。溶液的蛋白質濃度使用UV-VlS分光光度計測量。蛋白質以約0.7毫克/毫升和5%(重量/體積)的海藻糖配製在測試緩衝液中，並通過0.22微米過濾器過濾。溶液在凍千之前在2-8i:儲存。裝填和凍幹每個配製溶液以1毫升/瓶裝填進3毫升玻璃瓶中(WestPharmaceuticalServices,Cat#68000316)。3皮璃並瓦用塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#99150630)部分封閉並轉入凍幹器(FTSSystem,LyoStarII)中。熱電偶置於空白對照劑瓶中以監測凍幹過程。作為對照，還測試了沒有海藻糖的另一製劑。將200微升lmM鹽酸溶液中濃度為4.5毫克/毫升的rhGDF-5轉入到每個玻璃瓶並凍幹。分析方法凍乾結塊的完整性檢查凍幹樣品中凍乾結塊裂縫、收縮和崩解的每個時間點。重構時間1毫升去離子水加入到每個凍幹樣品中並輕輕混合。記錄重構時間。溶液透明度4見覺外觀對小玻璃並瓦中的溶液樣品檢查透明度和顆粒。樣品瓶/使用垂直光線對著黑暗背景檢查。將測試樣品的透明度與作為對照的純水樣品比較。.pH方法每個溶液樣品的pH直接使用校準pH計測量。UV光譜蛋白質濃度使用UV-Vis分光光度計確定。rhGDF-5的濃度使用在280納米的1.16毫升/毫克*釐米的消光係數計算。HPLC方法非還原(non-reduced)rpHPLC法(TM0051D)用於監測蛋白質的改進類型。測試樣品使用50mM乙酸稀釋到約0.1毫克rhGDF-5/毫升溶液。稀釋樣品(每個50毫升)注入到HPLC柱(Vydac218TP52,C18柱)。樣品使用水中0.15%(體積/體積)的TFA和乙腈中0.15%(體積/體積)的TFA作為流動相以0.3毫升/分鐘洗脫。在214納米檢測到洗脫峰。計算每個峰面積的百分比以監測主峰和較小峰(降解峰)的改變體積排阻色譜(SEC)蛋白質聚集物使用SEC法監測。通常30微升每種測試樣品直接注入到SEC柱(TOSOHBioscience,Cat#08540)並且使用水中0.1%(體積/體積)TFA和45%(體積/體積)乙腈以0.5毫升/分鐘的速率洗脫。在280納米監測到蛋白質峰，並且計算聚集物的百分比。凝膠電泳蛋白質聚集物和降解的小塊還使用凝膠電泳法監測。通常，約10微克蛋白質被乾燥並使用70微升具有或沒有10%P-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩衝液(Invitrogen,Cat#LC2676)重構。樣品在95°C培養5分鐘。約18微升每個樣品加載到凝膠(Invitrogen，Cat#NP0341Box)上。凝膠使用流動緩衝液(Invitrogen,Cat#NP0002)在200伏電壓流動約35分鐘。然後〗疑月史^f吏用Simplybluesolution(Invitrogen,Cat#LC6060)著色並使用去離子水脫色。掃描凝膠並收集圖像。生物活性測試僅僅分析6個月穩定的樣品(甘氨酸製劑和鹽酸製劑)的生物學活性。基於細胞的測試(TM0046)用於測量^5威性磷酸酶活性以確定樣品的穩定性。-含水量含水量測試使用卡爾.費歇爾滴定法(KarlFischerTitrationmethod)通過PDD進4亍。結果凍乾結塊的完整性從時間零點到9-月時間點所有儲存條件下的測試樣品結塊都顯示為固體和白色至灰白色。當例如海藻糖或蔗糖的糖類用作填充劑時，通常觀察到結塊的輕微收縮，或者結塊從玻璃瓶的玻璃壁略微分離。所有測試樣品沒有觀察到結塊的崩解。結塊崩解通常可以改變重構時間並引起蛋白質不穩定。在沒有海藻糖的製劑中得到白色、鬆軟和輕質的結塊。重構時間在測試時，向每個樣品瓶中加入1毫升水。將樣品輕輕混合併記錄重構時間。結塊完全溶解需要約30-40秒。溶液透明度重構的溶液樣品在垂直光線下對著黑色背景檢查，發現全部試樣溶液透明並且無色。.pH使用校準pH計測量重構溶液的pH。在整個研究過程中，全部製劑的pH都沒有發生顯著變化。含有海藻糖/緩衝劑的製劑樣品的pH約為3.0±0.2。沒有海藻糖的製劑的pH約為4.0。UV光譜蛋白質濃度在UV-VIS分光光度計上測量。在整個研究中，在含有甘氨酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液或o.oi%TFA的rhGDF-5/海藻糖製劑中，蛋白質濃度沒有顯著變化。當其在25。C/60。/。和40°C/60%RH儲存時，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸製劑中在280納米的吸光度增加。蛋白質的濃度在40。C儲存的製劑中似乎增加；由時間零點的0.7毫克/毫升的初始蛋白質濃度增加到6-月時間點的1毫克/毫升。這可以暗示海藻糖可能降解成糠醛化合物，其在280納米具有類似的吸光度。非還原rhHPLC結果非還原rhHPLC法用來監測rhGDF-5的降解物質，其通過蛋氨酸氧化、脫醯胺反應以及其它反應形成。除鹽酸製劑和沒有海藻糖的製劑外，對於在2-8。C和25t:儲存9個月的全部製劑，主峰的百分比沒有顯著變化。全部製劑在9-月時間點具有小於90%的主峰。然而當製劑在例如4CTC/75%RH的加速卩渚存條件下卩諸存時，^又僅一種製劑(即，rhGDF-5/海藻糖/甘氨酸)在6-月時間點時具有大於91%的主峰。其它製劑在加速儲存條件下不如rhGDF-W海藻糖/甘氨酸製劑穩定。特別地，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸製劑在6-月時間點僅僅具有66%的主峰。圖6和圖7表示在4CTC/75%RH儲存6個月時rhGDF-S/海藻糖/甘氨酸製劑和rhGDF-5/海藻糖/鹽酸製劑的HPLC色譜。圖8、9和10表示在5'C、25。C和4(TC儲存時各種測試緩衝劑的蛋白質回收百分率。rpHPLC分析結果表明海藻糖和甘氨酸緩沖劑的組合在儲存期間為凍幹rhGDF-5提供最好的穩定性。此外，由於強酸HC1可能對蛋白質和海藻糖具有一定的去穩定作用，rhGDF-5/海藻糖/鹽酸製劑不太穩定。實施例13:rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH為3的甘氨酸緩衝劑中在不同溫度下的穩定性在此研究中，rhGDF-5以約0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升與5%(重量/體積)海藻糖和pH為3的5mM甘氨酸-鹽酸緩衝液一起配製。配製的溶液用來以1毫升/並瓦添加到3毫升玻璃並瓦中並將玻璃瓶j凍幹。凍幹的樣品瓶在2-8°C、25°C/60%RH和40°C/75%RH儲存。在每個指定時間點分析樣品的產品穩定性。該研究中使用的方法包括結塊外觀、重構時間、溶液透明度、pH、rpHPLC(反相高效液相色譜)、UV(紫外光譜)、SEC(體積排阻色譜)和凝膠電泳。在三種儲存條件下存儲6個月後，在具有低至0.1毫克/毫升至高達9毫克/毫升的蛋白質濃度的製劑中沒有觀察到顯著變化。當蛋白質濃度太低時，例如0.01和0.03毫克/毫升，現有方法不足以檢測微小變化。該研究結果表明含有海藻糖和甘氨酸-鹽酸並具有不同蛋白質濃度的凍幹rhGDF-5製劑在2-8°C、25°C/60%RH至少穩定6個月。在4CTC/75%RH的加速儲存條件下在6-月時間點在儲存的產品中發現輕微的rpHPLC曲線改變。實施例14:不同濃度的rhGDF-5在具有5%海藻糖的pH為3的甘氨酸緩衝劑中在不同溫度下的穩定性在該研究中，rhGDF-5以0.01、0.03、0.1、2.5、4.5和9毫克/毫升的rhGDF-5濃度與5%(重量/體積)海藻糖和pH為3的5mM甘氨酸緩衝液一起配製。此外作為對比，4.5毫克/毫升rhGDF-S與10%(重量/體積)海藻糖和5mM甘氨酸緩沖液(pH為3)—起配製為製劑。然後配製的溶液以1毫升/瓶添加到3毫升玻璃並瓦中並凍幹。凍幹的樣品儲存在穩定的容器中。.PH為3的5mM甘氨酸-鹽酸緩衝液3x0.75克甘氨酸(分子量75.07克)稱重到3x2000毫升的燒杯中，並且向每個燒杯中加入約1900毫升去離子水。溶液使用鹽酸滴定至pH為3。向每個燒杯中加入額外的水以達到2000毫升的最終體積並充分混合。製劑製備原料蛋白質rhGDF-5(Lot#2142131)在2-8°。解凍。蛋白質溶液(96毫升，3.8毫克/毫升)使用4離心過濾裝置(PallLifeScience,Cat#OD010C37,10KMWCO)濃縮至約24毫升的總合併體積。約3x8毫升濃縮的rhGDF-5溶液轉入到3x滲析過濾片(cassette)中(Pierce,Cat#66380),並且過濾片相對於甘氨酸-鹽酸緩衝液在2-8X:滲析整夜。rhGDF-5溶液從滲析過濾片中轉移到小玻璃瓶中。蛋白質濃度使用UV-Vis分光光度計測量。蛋白質使用5%或10%(重量/體積)的海藻糖和如上所述5mM甘氨酸緩衝液以各種濃度配製。配製的溶液通過0.22微米過濾器過濾，並且在凍幹之前在2-8。C儲存。填充和凍幹每個配製的溶液以1毫升/並瓦添加到3毫升玻璃並瓦(WestPharmaceuticalServices,Cat#68000316)中。塞子(WestPharmaceuticalServices,Cat#99150630)部分》文置在玻璃弁瓦上。樣品並瓦轉入到凍幹器(FTSSystem,LyoStarII)中。熱電偶置於空白對照劑弁瓦中以監測凍幹過程的溫度曲線。使用的分析方法類似於如上所述實施例11和實施例12中的那些。結果凍乾結塊的完整性從時間零點到6-月時間點，所有儲存條件下的測試樣品結塊都顯示為固體和白色。在結塊周圍觀察到輕微的收縮，或者結塊從玻璃瓶的玻璃壁略微分離。當例如海藻糖或蔗糖的糖類用作填充劑時這相當普遍。所有測試樣品沒有觀察到崩解的結塊。-重構時間在測試時，向每個樣品瓶中加入1毫升水。玻璃瓶輕輕混合併記錄重構時間。結塊溶解需要約30-40秒。溶液透明度當蛋白質溶液使用垂直光線對著黑色背景檢查時，全部重構樣品透明並且無色。.pH重構溶液用於測量pH。在整個研究過程中，全部製劑的pH都沒有發生顯著變化。製劑的pH值為3.0-3.3。UV光譜蛋白質濃度使用UV光譜法測量。UV光譜還可提供蛋白質聚集的信息(基線光散射)。對於0.01-0.1毫克/毫升的蛋白質濃度，使用10毫米透明容器。對於2-9毫克/毫升的蛋白質濃度，使用l毫米透明小容器，沒有稀釋或沒有樣品破壞。在穩定性研究的整個過程中，在0.1-9毫克/毫升的樣品中沒有觀察到蛋白質濃度的顯著變化。對於0.01-0.03毫克/毫升的低濃度樣品，由於吸光度太低而沒有觀察到更多變化。對於未來研究的低濃度樣品，應當需要新樣品製備方法。非還原rhHPLC結果非還原rhHPLC法用來監測rhGDF-5的降解物質，例如蛋氨酸氧化和脫醯胺。在整個6個月儲存期間，在2-8。C、25。C和4(TC儲存的全部樣品中沒有觀察到主峰百分比的顯著變化。在6個月儲存的樣品的rhGDF-5的主峰仍然回復為^96%,並且其與從時間零點樣品得到的數據是可比的。0.01和0.03毫克/毫升的低濃度樣品難以通過HPLC法分析。未來研究應當需要新樣品製備。SECSEC用於監測蛋白質聚集。在整個6個月穩定性測試期間，全部樣品都沒有觀察到聚集的顯著變化。沒有分析0.01和0.03毫克/毫升的低濃度樣品。;疑力交電泳蛋白質聚集和分解的物質還使用凝膠電泳監測。在整個6個月穩定性測試期間，全部樣品都沒有發現顯著變化。存儲期間沒有在任何樣品中形成蛋白質的小片段，因為沒有在還原SDS-PAGE上發現。含水量樣品的含水量低至0.19至0.32%。在蛋白質濃度和含水量之間沒有觀察到相關性或趨勢。通過rpHPLC和SEC色譜證明，所得結果表明凍幹的rhGDF-5產品在海藻糖和甘氨酸緩衝劑的存在下在2-8°C、25。C/60。/。RH和40°C/75%RH穩定至少6個月。使用5%(重量/體積)海藻糖/5mM甘氨酸-鹽酸緩衝液(pH為3),蛋白質可以在0.1-9毫克/毫升的不同濃度範圍配製(凍幹之前)並且凍幹。當蛋白質以例如0.01毫克/毫升和0.03毫克/毫升的低濃度配製時，現有方法對測定變化具有某些限制。本發明已經根據說明性實施方案進行了說明。由於在不脫離本發明範圍的情況下可以對上述製劑作出改變，上述說明或附圖中所示的全部物質將作為說明性而非限制性解釋。例如本領域熟練技術人員將會認識到，本發明說明性實施方案中的製劑不限於使用BMP,並且可以使用任<可合適的生物體系中的其它生物分子。-還應當理解的是以下權利要求將覆蓋本發明此處所述的全部通用和特疋特徵，並且本發明範圍的全部聲明作為語言上的要素將落入其中。。權利要求1.包括至少一種BMP和足以穩定所述BMP的量的海藻糖的組合物。2.權利要求l的組合物，另外包括pH為從約2.5至約3.5的甘氨酸緩衝液。3.權利要求l的組合物，其中所述BMP為rhGDF-5。4.權利要求2的組合物，其中所述BMP為rhGDF-5。5.穩定BMP的方法，包括(a)提供含有至少一種BMP和足以穩定所述BMP的量的海藻糖的組合物，(b)凍幹該混合物。6.權利要求5的方法，另外包括加入pH為從約2.5至約3.5的甘氨酸緩衝液。7.權利要求5或權利要求6的方法，其中所述BMP為rhGDF-5。8.植入在哺乳動物中的裝置，所述裝置包括至少一種凍千BMP,其中BMP已經根據權利要求5的方法凍幹。9.權利要求8的裝置，另外包括可生物降解的膠原基質。10.權利要求8的裝置，其中所述BMP為rhGDF-5。11.植入在哺乳動物中的裝置，所述裝置包括至少一種凍千BMP,其中BMP已經根據權利要求6的方法凍幹。12.權利要求ll的裝置，另外包括可生物降解的膠原基質。13.權利要求ll的裝置，其中所述BMP為rhGDF-5。全文摘要本發明涉及在各種凍幹製劑和組合物中穩定骨形態發生蛋白(BMP′s)。本發明包括主要含有作為賦形劑的海藻糖並且任選含有其它賦形劑的製劑，海藻糖用於凍幹組合物以及其隨後的儲存和重構，其它賦形劑例如緩衝劑和表面活性劑。文檔編號A61P43/00GK101348524SQ20071019987公開日2009年1月21日申請日期2007年12月14日優先權日2006年12月14日發明者D·蘇,R·坎扎達,S·J·薩瓦穆拉,V·R·加裡加帕蒂申請人:強生更生醫療有限責任公司