一種快速檢測B型肝炎病毒耐藥基因變異的方法
2023-07-30 10:44:31 1
專利名稱：一種快速檢測B型肝炎病毒耐藥基因變異的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種檢測B型肝炎病毒相關基因變異的方法，具體涉及一種檢測B型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關基因變異的方法及其快速診斷試劑盒。
背景技術：
在歷年法定甲乙類傳染病發病情況報告中，B型肝炎一直高居首位，嚴重威脅人類的健康，估計全球有20億人感染。據國家衛生部2003年8月最新公布的數字，截至2002年底，全國B肝病毒攜帶者達到1.3億人，慢性B型肝炎患者有2000餘萬例，佔人口總數的1.57％。其中50％～75％有活躍的病毒複製和肝臟炎症改變，部分慢性肝炎可進展為肝硬化、肝衰竭或原發性肝癌。
B肝治療的周期長，醫藥費用昂貴，給國家和個人帶來了嚴重的經濟負擔。目前臨床使用的抗病毒藥物主要有α-幹擾素(IFN-α)和拉米夫定(Lamivudine，3-TC)。α-幹擾素(IFN-α)是目前B型肝炎治療中抗病毒的首選藥物，其對B型肝炎的治療效果(HBV DNA消失、HBeAg轉陰)報導不一，一般在20-40％之間(Mauracher E，Gut，3499-10，1993；Korenman J et al，Ann Intern Med，114629-634，1991)，除治療應答率低下、價格昂貴外，長期使用幹擾素具有較大的副作用。拉米夫定(Lamivudine，3-TC)原為抗HIV感染的核苷類藥物，近年發現短期內對B型肝炎病毒的複製有較好的抑制作用(Hadziyannis SJ et al，Hepatology，32847-851，2000)。然而它的主要缺點為易產生耐藥，一旦出現耐藥，藥物對病毒複製無抑制作用，血清HBV DNA的水平回升，對病毒的感染無根除作用。停藥後病毒可高度複製而導致肝炎的爆發或加劇(Yuen MF et al，Hepatology，34785-791，2002)。
病毒變異不斷地在自然界中發生，或在藥物壓力下產生，是病毒遺傳進化的基本因素。有報導，B型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HBV)基因的P區、前S/S區、前C/C區、X等區都會發生基因變異。P基因區佔整個病毒基因組的75％，分為5個區(A，B，C，D和E)，主要編碼DNA多聚酶。這些區域可與核苷酸或模板結合，具有催化活性，負責病毒基因的複製。近年來，核苷類藥物，如拉米夫定已經成為B型肝炎治療的主要藥物之一，而在用核苷類藥物治療患者中，最大的問題是P區基因相關位點發生突變，導致病毒對核苷類藥物發生耐藥。拉米夫定能顯著降低HBV DNA水平，並可使ALT正常化和肝組織學改善。但若長期治療，則在編碼DNA多聚酶的YMDD基序會發生變異，這種耐藥突變主要是YMDD基序上第552位的蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代(M552I或M552V)，M552V突變常常與L528M的變異聯合發生。一般認為YMDD突變後HBV DNA常常反跳引起活動性肝炎。YMDD變異株在轉染細胞系中的複製活性低於野毒株，然而對拉米夫定敏感性降低1000-10000倍。臨床上，隨著血清YMDD突變株的出現，HBV DNA可重新回升，部分病人出現肝炎急性發作，甚至肝功能失代償。因此，檢測HBV P區基因的變異可以及時了解患者治療療效，隨時調整治療方案，對B型肝炎臨床核苷類似物藥物治療具有重要的指導意義。
目前檢測HBV基因變異的方法除了基因測序外，還有線性探針法(Line ProbeAssay，LiPA)、雜交雙探針螢光檢測技術、寡核苷酸基因晶片，限制性內切酶多態性分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、高效液相色譜(DHPLC)和實時螢光定量多聚酶鏈式反應(Real-time PCR)技術等。目前，應用實時螢光定量PCR技術進行基因突變分析的方法是基於比較野生型和突變型基因擴增產物的熔解曲線和Tm值，比較二者之間的差異來判斷樣品中病毒基因是否存在變異。由於B型肝炎患者的體內病毒滴度不同，經拉米夫定治療後存在的變異常為混合變異，即YMDD、YIDD、和YVDD三者間的共生，加上它們之間的比例不一，高拷貝的毒株會競爭性的掩蓋低拷貝的變異毒株，通過比較熔解曲線和Tm值的差異判斷基因變異的方法難以檢測出HBV基因確切的變異情況，對混合突變的檢測也無能為力。傳統的測序技術雖然準確，但由於耗時、實驗繁瑣、對序列進行專業比對等缺點限制了其廣泛應用。
發明內容
本發明的目的是為了克服傳統檢測方法的缺陷，提供一種簡便、快速、準確率高的檢測B型肝炎病毒耐藥基因變異的方法，具體涉及一種用螢光定量聚合酶鏈式法檢測B型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關基因變異的方法。
本發明的進一步目的是提供用於該方法的快速診斷試劑盒。
本方法利用實時螢光定量PCR MGB(minor groove binder)Taqman探針技術，依據HBV拉米夫定耐藥主要突變區YMDD核酸序列，設計引物及探針檢測HBV YMDD區域的基因變異。
本方法利用Taq酶的5』→3』外切酶活性，在PCR反應系統中加入不同螢光(FAM，HEX)標記的兩條探針，分別和同一基因的兩種突變基因序列相對應，兩個探針的5』端標以螢光發射基團FAM或HEX標記，靠近3』端標以螢光淬滅基團(quencher)，同時3』端結合上M6B，即DNA小溝結合物，是源於某些抗菌素分子的化學基團，其能嵌入DNA雙螺旋結構中的小溝形成非共價結合，有效提高探針的退火溫度，探針的3』端被磷酸化以防止探針在PCR擴增過程中被延伸。反應體系中的兩種探針其中一條可與引物包含序列內的DNA模板發生特異性雜交，另外一條探針由於有一個鹼基序列不同，雜交溫度大為降低，不能雜交到DNA模板上。當探針保持完整時，淬滅基團抑制發射基團的螢光發射。發射基團一旦與淬滅基團發生分離，抑制作用被解除，檢測波長處光密度增加而被螢光探測系統檢測到。復性期探針與模板DNA發生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當移動到探針結合處切斷探針，淬滅作用被解除，螢光信號釋放出來。模板每複製一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個螢光信號的釋放，結果中被檢測到的螢光信號所標記的探針，對應於檢測區域的突變基因。
本發明方法包括下述步驟a、根據B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的靶基因序列設計、合成一對引物，靶基因片段長度最優為50-200個鹼基；b、根據靶基因序列在引物之間設計、合成多個螢光探針，分別針對不同的變異基因；c、使用步驟a中的引物和步驟b中的螢光探針及其它聚合酶鏈式反應成份組成螢光聚合酶鏈式反應體系，其中鎂離子濃度為5mM，Taq酶的用量為0.25單位/反應；d、從待測血清標本中採用Chelex100抽提B型肝炎病毒DNA，加入步驟c中的螢光聚合酶鏈式反應體系，在螢光定量PCR儀，或普通PCR儀上進行擴增實驗；e、進行30-50個循環的聚合酶鏈式反應，循環中或循環結束後移至可讀終點螢光的儀器上讀取螢光值，將擴增產物的螢光信號與域值進行比較，判定與探針對應的突變情況；f、對於存在混合突變的樣品，根據各探針反應時擴增曲線的Ct值比較估算出混合突變病毒毒株的大致比例。
步驟a中所述的兩個引物之間相距50-200鹼基，擴增的靶基因片段長度為92bps。
步驟b中所述的螢光探針為MGB-Taqman探針，長度為15-30鹼基，5′端以FAM或HEX標記，3′端以MGB-quencher標記。
步驟a中所述的B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的特異性基因序列為1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC步驟a中所述的引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′步驟b中所述的螢光探針的序列為探針15′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探針25′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探針35′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′Taq酶是指具有3′→5′DNA聚合酶活性，5′→3′外切酶活性的耐高溫聚合酶，最好是95℃半衰期大於40分鐘的高溫聚合酶。
陰性對照模板為陰性獻血員血清，經B肝兩對半免疫測定和HBV核酸保守區PCR檢測，各項指標均為陰性。
螢光激發光FAM和HEX螢光基團的激發波長分別為490nm和530nm，二者檢測波長分別為520nm和555nm。
本發明採用PCR反應混合液A、PCR反應混合液B、Taq酶、HBV DNA抽提試劑、陰性質控品、ddH2O組成PCR試劑盒。
本發明對上述試劑進行優化改進位備試劑盒，經過改進的試劑配方具有更高的擴增效率，能快速準確檢測出特定位點基因突變情況，並能對混合突變的病毒基因比例進行相對定量。此外本試劑盒不僅可以在實時螢光定量PCR儀上進行檢測，也可在普通PCR儀上擴增後將產物移至常規螢光檢測儀上讀取螢光值，判斷與相應探針對應的基因突變類型，因此不受醫療機構儀器設備的條件限制，易於普及。
選取經克隆測序確認的臨床B肝患者拉米夫定治療前及治療不同階段的血清標本共68例，用B型肝炎病毒拉米夫定耐藥基因突變檢測試劑盒進行檢測，檢出率為98.53％，對於YMDD、YIDD、YVDD共生的標本也能檢出，準確率為100％(表1)。對35份YMDD(5份)、YIDD(5份)、YVDD(5份)、YMDD/YIDD(5份)、YMDD/YVDD(5份)、YIDD/YVDD(5份)、陰性血清(5份)標本重複實驗三次，結果重複性達100％，表明試劑盒的重複性和穩定性較好。表1是試劑盒檢測與測序比對表。
表1
本試劑盒與目前市場上檢測突變的試劑盒相比具有以下優點1)準確常規測序方法往往難以將共生的病毒毒株全部挑出，通常只能測到其中的一種病毒毒株；通過螢光定量PCR、比較熔解曲線和Tm值差異的方法也只能檢測出佔優勢的病毒毒株，會漏檢所佔比例較少的病毒毒株，因此不能代表患者體內病毒的真實變異情況。2)可以對共生的病毒毒株的相對比例進行估算，了解患者用藥治療後體內病毒發生變異的變化情況，隨時掌握治療的療效，有利於監控療效、調整治療方案。3)快速從抽提HBV DNA到出報告整個過程只需2-3小時，比測序等其他檢測突變的方法省時、簡便。
圖1為螢光探針PCR反應檢測YMDD、YIDD、YVDD原理圖。
其中，R螢光報告基團 Q螢光淬滅基團圖2為採用螢光探針技術檢測B肝拉米夫定耐藥基因突變型擴增曲線其中，A圖是判定為YMDD的螢光擴增曲線，即用PCR反應液A擴增，於FAM-490nm檢測出高於設定域值的螢光信號，判定標本中的HBV DNA為YMDD野生型。
B圖是判定為YIDD的螢光擴增曲線，即用PCR反應液B擴增，於FAM-490nm檢測出高於設定域值的螢光信號，判定標本中的HBV DNA為YIDD突變型。
C圖是判定為YVDD的螢光擴增曲線，即用PCR反應液B擴增，於HEX-530nm檢測出高於設定域值的螢光信號，判定標本中的HBV DNA為YVDD野生型。
D圖是判定為YIDD/YVDD共生的螢光擴增曲線，即用PCR反應液B擴增，於490nm和530nm均檢測出高於設定域值的螢光信號，判定標本中的HBV DNA為YIDD和YVDD共生突變型。二者擴增曲線與基線交匯處的Ct值分別為23和25，ΔCt為2，推算YIDD和YVDD病毒變異毒株的相對比例約為22∶1，即4∶1。
具體實施例方式
實施例1 製備試劑盒試劑盒主要成份有PCR反應混合液A(其中還含引物1、2和螢光探針M)，PCR反應混合液B(其中還含引物1、2和螢光探針I和V)，Taq酶，HBV DNA抽提試劑，陰性質控品和ddH2O。
所述的引物和螢光探針設計在B型肝炎病毒P基因區編碼第552位胺基酸附近，只對B型肝炎病毒特異，和其它物種沒有交叉反應。在EMBL的HBV編碼聚合酶的DNA序列的YMDD區域附近設計引物，全長92bps，為單拷貝基因序列。螢光探針設計位點位於兩個引物之間。
引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps針對YMDD、YIDD、YVDD的螢光探針序列分別為探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps
探針I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′17bps探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′17bps所述PCR反應混合液A每人份組份為10×PCR緩衝液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl螢光探針M(20pmol/μl) 0.2μlTaq酶(5單位/μl)0.5μlddH2O 28.3μl總量 50μl所述PCR反應混合液B每人份組份為10×PCR緩衝液 5μlMgcl2(25mM) 10μldNTPs(各10mM) 各1μl引物1、2(20pmol/μl)各1μl螢光探針I、V(20pmol/μl)各0.2μlTaq酶(5單位/μl)0.5μlddH2O 28.1μl總量 50μl所述HBV DNA抽提試劑組份為I液8％ 聚乙二醇 8000、1M NaCl；II液10％Chelex-100所述陰性質控品為陰性獻血員血清，經B肝兩對半免疫測定和HBV核酸保守區PCR檢測，各項指標均為陰性。
實施例2 使用B型肝炎病毒基因耐藥突變檢測試劑盒進行突變檢測取待測血清樣本50μl，加入50μl HBV DNA抽提I液，振蕩混勻15秒，12000rpm離心10min，棄上清。加入HBV DNA抽提II液50μl振蕩混勻，100℃水浴10min。12000rpm離心2min，取上清供PCR擴增用，或-20℃儲存備用。
陰性質控品同上處理。
PCR擴增2μl經上述方法抽提的含HBV DNA的上清加入PCR反應混合液A和B中，混勻後放入實時螢光定量PCR儀(Bio-Rad，iCycler)，按下列循環進行擴增反應94℃預變性5分鐘→(94℃變性20秒→60℃退火40秒)×40循環，每次循環後在60℃採集螢光。
分析擴增曲線，做如下結果判定1.PCR反應混合液A管在FAM-490nm波長處有高於域值的螢光信號，表明標本中HBV DNA 552位為YMDD野生型(圖2A)；2.PCR反應混合液B管在FAM-490nm波長處有高於域值的螢光信號，表明標本中HBV DNA 552位為YIDD突變型(圖2B)；3.PCR反應混合液B管在HEX-530nm波長處有高於域值的螢光信號，表明標本中HBV DNA 552位為YVDD突變型(圖2C)；4.若出現以上三種中任兩種或兩種以上高於域值的螢光信號，表明標本中B型肝炎病毒為共生突變(圖2D)；5.對於共生突變的毒株相對比例可按下列方法進行估算從擴增曲線上分別讀取共生毒株的Ct值，以2ΔCt進行估算兩者的拷貝數差異(圖2D)。
實施例3同實施例1配置PCR反應液，將PCR管放入可讀取螢光的螢光檢測儀上讀取數值，記下螢光值A0，將PCR管轉入普通PCR儀上，按下列循環進行擴增反應94℃預變性5分鐘→(94℃變性20秒→60℃退火40秒→72℃延伸30秒)×40循環→72℃延伸2分鐘，再將PCR產物移至螢光檢測儀上讀取螢光值Ax。
分析終點螢光值，可做如下結果判定1.PCR反應混合液A管(Ax-A0)數值高於陰性對照10倍標準差以上認為該標本中HBV DNA 552位為野生型YMDD；2.PCR反應混合液B管在FAM-490nm波長處有螢光信號，並且(Ax-A0)數值高於陰性對照10倍標準差以上，表明標本中HBV DNA 552位為突變型YIDD；3.PCR反應混合液B管在HEX-530nm波長處有螢光信號，並且(Ax-A0)數值高於陰性對照10倍標準差以上表明標本中HBV DNA 552位為突變型YVDD；4.若出現以上三種中任兩種或兩種以上情況，表明標本中B型肝炎病毒相應突變毒株共生。
權利要求
1.一種快速檢測B型肝炎病毒耐藥基因變異的方法，其特徵是利用實時螢光定量PCR MGB Taqman探針技術，依據B型肝炎病毒拉米夫定耐藥突變區YMDD核酸序列，設計引物及探針檢測HBV YMDD區域的基因變異，包括下述步驟，a、根據B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的靶基因序列設計、合成引物和螢光探針，所述的靶基因片段長度為50-200個鹼基；b、上述引物和螢光探針與聚合酶鏈式反應成份組成螢光聚合酶鏈式反應體系，其中鎂離子濃度為5mM，Taq酶的用量為0.25單位/反應；c、採用Chelex100抽提B型肝炎病毒DNA，加入上述反應體系循環擴增；d、讀取螢光值，判定基因變異情況，估算混合突變病毒毒株比例。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的靶基因序列位於兩個引物之間，引物相距50-200鹼基。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的靶基因長度為92鹼基。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的螢光探針為MGB-Taqman探針，其5′端以FAM或HEX標記，3′端以MGB-quencher標記。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的引物長度各為15-25鹼基。
6.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的螢光探針長度為15-30鹼基。
7.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟c中所述的聚合酶鏈式反應循環為30-50個。
8.按照權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟c中所述的聚合酶鏈式反應循環為40個。
9.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的B型肝炎病毒拉米夫定耐藥性相關突變位點的特異性基因序列為1 GTAGGGCTTT CCCCCACTGT TTGGCTTTCA GCTATATGGA TGATGTGGTA51 TTGGGGGCCA AGTCTGTACA ACATCTTGAG TCCCTTTTTA CC。
10.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的引物序列為引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′。
11.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟a中所述的螢光探針的序列為探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′探針I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′。
12.一種檢測權利要求1的B型肝炎病毒耐藥相關基因變異的診斷試劑盒，其特徵是由PCR反應混合液A，PCR反應混合液B，Taq酶，HBV DNA抽提試劑，陰性質控品和ddH2O組成，其中所述的反應混合液A中還含引物1、2和螢光探針M，反應混合液B中還含引物1、2和螢光探針I和V。
13.按權利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的引物序列為，引物15′GTA GGG CTT TCC CCC ACT G 3′ 19bps引物25′GGT AAA AAG GGA YTC AMG ATG 3′21bps。
14.按權利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的螢光探針序列為，探針M5′ATC ATC CAT ATA ACT GAA A 3′19bps探針I5′CAC ATC ATC AAT ATA AC 3′ 17bps探針V5′ATC ATC CAC ATA ACT GA 3′ 17bps。
15.按權利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的PCR反應混合液A每人份組份為5μl 10×PCR緩衝液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl20pmol/μl引物1和2，0.2μl 20pmol/μl螢光探針M，0.5μl 5單位/μl Taq酶，28.3μl ddH2O；其中所述的PCR反應混合液B每人份組份為5μl 10×PCR緩衝液，10μl 25mM Mgcl2，各1μl 10mM dNTPs，各1μl 20pmol/μl引物1和2，各0.2μl 20pmol/μl螢光探針I和V，0.5μl 5單位/μl Taq酶，28.1μlddH2O。
16.按權利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述的HBV DNA抽提試劑組份為，I液8％聚乙二醇8000、lM NaCl；II液10％Chelex-100。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種檢測B型肝炎病毒拉米夫定耐藥相關基因變異的方法。本發明利用實時螢光定量PCR MGB Taqman探針技術，依據B肝病毒拉米夫定耐藥突變區YMDD核酸序列，設計引物及探針檢測HBV YMDD區域的基因變異。採用PCR反應混合液A，B、Taq酶、HBV DNA抽提試劑、陰性質控品、ddH
文檔編號C12Q1/68GK1737164SQ20051006544
公開日2006年2月22日 申請日期2005年4月6日 優先權日2004年8月27日
發明者袁正宏, 王 華, 耿海峰, 華兵, 邵醇 申請人:上海復旦悅達生物技術有限公司, 復旦大學