用於治療糖尿病的模式的組合的製作方法

2023-07-23 12:13:36 1

用於治療糖尿病的模式的組合的製作方法
【專利摘要】一種治療、預防或延遲1型糖尿病進展的方法，所述方法是通過施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原來實現，所述融合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。所述方法包括例如施用細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4(CTLA4)分子和1型糖尿病自身抗原。本發明還提供藥物組合物。
【專利說明】用於治療糖尿病的模式的組合 發明領域
[0001] 本發明總體上涉及自身免疫疾病領域，並且尤其涉及使用CTLA4融合蛋白和1型 糖尿病自身抗原的組合來治療、預防或延遲1型糖尿病進展。

【背景技術】
[0002] 最常見形式的1型糖尿病（T1DM)是免疫介導的疾病，其中胰島素分泌0細胞遭 自身免疫應答破壞。存在與疾病發作相關聯的許多遺傳和環境因素，所述疾病涉及含有特 異性靶向胰島素分泌0細胞的免疫細胞的胰島的逐漸炎性浸潤。這種病變在未確定的一 段時間（數月至數年）內發展。雖然胰島素的發現允許治療T1DM，但是當前沒有治癒方法。 最常見形式的1型糖尿病是免疫介導的，其中胰島素產生0細胞遭破壞。然而，在診斷時， 大多數患者仍然具有可觀量的胰島素產生。殘留0細胞功能的保存是非常需要的，因為它 可減少疾病的短期和長期併發症。
[0003] 已經進行了數次臨床試驗來試圖用免疫調節劑或基於抗原的治療阻止1型糖尿 病的自身免疫性。最值得注意的是，抗CD3、抗CD20和GAD-65抗原疫苗的試驗已在保存3 細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。T細胞在與1型糖尿病相關聯的 自身免疫性方面發揮核心作用。
[0004] 不完全弗氏佐劑（IFA)中如胰島素B鏈的自身抗原的再引入也已預期可治療或 延遲1型糖尿病的進展。這已經在糖尿病的動物模型（N0D小鼠）中有所研究（Muir等人 (1995)JClinInvest95:628-634 ;0rban等人（1999)Diabetes48 增刊 1:A216-A217; Ramiya等人（1996)JAutoimmun9:349-356);美國專利公布 2006/0183670 和美國專利 公布2009/0142308,並且在人中有所研究。Orban等人，JAutoimmun. (2010年6月）； 34(4) : 408-15。
[0005] 然而，需要1型糖尿病的另外的新療法，它們能夠停止或減慢自身免疫P細胞破 壞，因而預防患上1型糖尿病，或至少延長疾病發作達儘可能長的一段時間。


【發明內容】

[0006] 根據本發明的某些實施方案涉及治療受試者的糖尿病的方法，所述方法包括向受 試者施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原，所述融合蛋白組合物 包含：T細胞共刺激拮抗劑，例如CTLA4的細胞外結構域、細胞外結構域的有效片段或細胞 外結構域的免疫活性變體；和免疫球蛋白分子的一部分，所述1型糖尿病自身抗原例如前 胰島素原、GAD65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經節苷脂或其免疫活性片 段或其變體。在一些實施方案中，前胰島素原片段是胰島素B鏈或其免疫活性片段或其變 體，如SEQIDNO: 1的胺基酸33-47 (即，B鏈29 - 23)
[0007] 在一些實施方案中，受試者患有殘留有0細胞功能的1型糖尿病。在一些實施方 案中，T細胞共刺激拮抗劑結合B細胞和/或抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7(CD80/86)抗 原。在其它實施方案中，B7抗原在B細胞和APC上表達。
[0008] 在一些實施方案中，所述方法有效預防糖尿病的發作。在其它實施方案中，所述方 法有效延遲糖尿病的發作至少例如3個月、6個月、9個月、1年、1. 5年、2年、3年或更長。 在一些實施方案中，所述方法進一步包括確定隨著時間推移在從受試者獲取的血液樣品中 C肽的水平，所述水平是作為治療有效性的指示物。
[0009] 在本發明的其它實施方案中，提供藥物組合物，其包含：(a)細胞毒性T淋巴細胞 相關聯抗原4 (CTLA4)融合蛋白，（b)選自由以下組成的組的自身抗原：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經節苷脂或其免疫活性片段或其變體，以 及（c)藥學上可接受的載體。
[0010] 在一些實施方案中，藥物組合物在油基載體提供，如在IFA或MontnideISA中提 供。在一些實施方案中，藥物組合物包含約250mg至約2000mg的融合蛋白和約0. 5mg至約 l〇mg的1型糖尿病自身抗原。
[0011] 本發明闡明並描述了如將會顯而易知的實施方案的這些和其它特徵。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下文參考例如後附的附圖來提供各種實施方案的詳述。本領域的技術人員將理解 的是，以下所描述的附圖僅是出於說明的目的。附圖不意圖以任何方式限制 申請人:教導的 範圍。
[0013] 圖1是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-hAUC平均值的群體平均值。估計 值來自針對年齡、性別、c肽的基線值和治療分配來調整的ANC0VA模型。Y軸是在log(y+l) 標度上。誤差條展示95%Cl。AUC=曲線下面積。
[0014] 圖2是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-hAUC平均值的預測群體平均值。 估計值來自混合效果模型的分析，所述模型針對年齡、性別、C肽的基線值和治療分配來調 整，並且包括在l〇g(y+l)標度上作為直線的時間的固定效果。AUC=曲線下面積。
[0015] 圖3是每個治療組的隨著時間推移的2-h峰C肽保持等於或高於0 ? 2nmol/L的 參與者的比例。
[0016] 圖4A和圖4B是每個治療組的隨著時間推移的（A)HbAlc和⑶胰島素使用的群 體平均值。估計值來自針對年齡、性別、HbAlc的基線值和治療分配來調整的ANC0VA模型。 胰島素使用是按3個月時間間隔以每kg體重來使用。誤差條展示95%Cl。HbAlc是糖基 化血紅蛋白Ale。
[0017] 圖5是在預先指定的基線因子類別內對於2年刺激C肽AUC平均值的治療效果的 比率（阿巴西普相比於安慰劑）。估計值來自針對年齡、性別、C肽的基線值、所指示的分類 因子、治療分配和治療相互作用項來調整的C肽的ANC0VA建模對數。治療效果的同質性測 試對於DR3等位基因狀態（p= 0 *025)和種族（p= 0 *0003)是顯著的。AUC=曲線下面 積。HbAlc=糖基化血紅蛋白Ale。
[0018] 應了解，附圖只是示例性的並且對附圖的所有參考只出於說明目的，並且不希望 以任何方式限制以下本文描述的實施方案的範圍。

【具體實施方式】
[0019] 已經發現在IFA中CTLA4分子和胰島素B鏈的組合可用於治療、預防或延遲受試 者的1型糖尿病的進展。
[0020] 殘留3細胞功能（如通過峰C肽彡0*2nmol/L所測量）的保存是非常需要的， 因為它可減少疾病的短期和長期併發症。已經進行了數次臨床試驗來試圖用免疫調節劑或 基於抗原的治療阻止1型糖尿病中的自身免疫性。最顯著地，抗⑶3、抗⑶20和GAD-65抗 原疫苗的試驗已在保存0細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。C肽 是在體內與胰島素一起產生的蛋白質。在健康胰腺中，前胰島素原與A鏈、C肽、B鏈和信號 序列一起分泌。將信號序列截止，留下胰島素原。然後C肽被切斷，留下A鏈和B鏈以形成 胰島素。由於C肽和胰島素以等摩爾量存在，因此它是胰島素產生和胰腺0細胞健康的非 常可靠標記物。
[0021] T細胞在與1型糖尿病相關聯的自身免疫性中發揮核心作用。為了變得完全活化 並且具有自身攻擊性，據信T細胞需要至少兩個關鍵信號。（Marelli-BergFM，0kkenhaug K，MirendaV.ATrendsImmunol2007;28:267-73。）第一信號是抗原呈遞細胞上的MHC分 子的凹槽中的抗原與T細胞受體（TCR)之間的相互作用。最重要的第二信號是抗原呈遞細 胞（APC)上的⑶80和⑶86與T細胞上的⑶28之間的相互作用。這種共刺激第二信號是細 胞的完全活化所需要的，並且沒有它T細胞不會變得具有功能性。因此，已提出將共刺激阻 斷作為自身免疫性和移植的治療手段。（BluestoneJA，StClairEW，TurkaLA.Immunity 2006;24:233-38。）
[0022] 細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4 (CTLA4)，也稱為⑶152,是涉及免疫系統的調控 的蛋白質。天然存在的CTLA4描述於美國專利號5, 434, 131、5, 844, 095和5, 851，795中。 天然CTLA4蛋白質由CTLA4基因編碼。CTLA4是細胞表面蛋白，其具有N端細胞外結構域、 跨膜結構域和C端胞質結構域。細胞外結構域結合至且/或幹擾靶抗原，如CD80和CD86， 充當性質T細胞刺激的天然破壞。在一些實施方案中，CTLA4分子的細胞外結構域開始於 位置+1處的甲硫氨酸並且結束於位置+124處的天冬氨酸；在其它實施方案中，細胞外結構 域開始於位置-1處的丙氨酸並且結束於位置+124處的天冬氨酸。
[0023]CTLA4分子是包括細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4(CTLA4)細胞外結構域的分 子。在一些實施方案中，CTLA4的細胞外結構域包括CTLA4蛋白質的一部分，所述部分識別 並結合至至少一種B7(⑶80/86)抗原，如B細胞和抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7抗原。 B細胞和APC可被活化。細胞外結構域還可包括CTLA4的結合B7抗原的片段或衍生物。 CTLA4細胞外結構域還可識別並結合⑶80和/或⑶86。細胞外結構域還可包括CTLA4的 結合CD80和/或CD86的片段或衍生物。
[0024]CTLA4分子可為融合蛋白，其中融合蛋白定義為使用本領域中熟知的方法連接在 一起的一個或多個胺基酸序列。連接的胺基酸序列從而形成一種融合蛋白。在一些實施方 案中，CTLA4分子含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的Fc部分。在一些實施方 案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0025] 在一些實施方案中，CTLA4分子是含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的 Fc部分的蛋白質。在一些實施方案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0026] 在一些優選實施方案中，CTLA4分子是阿巴西普。阿巴西普是可溶性融合蛋白，其 由連接至人免疫球蛋白G1 (IgGl)的修飾Fc(鉸鏈、CH2和CH3結構域）部分的人CTLA-4的 細胞外結構域組成。阿巴西普通過重組DNA技術在哺乳動物細胞表達系統中產生。阿巴西 普的表觀分子量是92千道爾頓。
[0027] 阿巴西普被開發用於成人類風溼性關節炎和幼年特發性關節炎，並且被指出可用 於減少病徵和症狀、誘導主要臨床反應、抑制結構破壞的進展，並且改善患有中度至重度活 動性類風溼性關節炎的成人患者的身體功能。
[0028] 阿巴西普由Bristol-MyersSquibb開發並且公開於例如美國專利5, 851，795、美 國專利7, 455, 835和美國專利公布20011/311529中。阿巴西普的商品名為Orencia，它可用 作單一療法，或與不同於腫瘤壞死因子（TNF)拮抗劑的疾病緩解抗風溼性藥物（DMARD)同 時使用。阿巴西普還被指示可用於減少患有中度至重度活動性多關節幼年特發性關節炎的 6歲和年齡更大的兒科患者的病徵和症狀。阿巴西普可用作單一療法或與甲氨蝶呤（MTX) 同時使用。由於阿巴西普是選擇性共刺激調節劑並且抑制T細胞的共刺激，它不應與TNF 拮抗劑同時施用。
[0029] 阿巴西普選擇性結合至⑶80和⑶86,從而阻斷與⑶28的相互作用並且幹擾T細 胞活化。它抑制初始T細胞活化，因而具有選擇性抑制特定抗原的T細胞應答的潛力而非 廣泛免疫抑制。效應記憶T細胞應答較少取決於CD28共刺激並且據推測較少通過共刺激 阻斷來抑制。（LoDJ,WeaverTA，StemporaL,等人AmJTransplant2011 ;11:22_ 33。）
[0030] 動物和人類中的研究已經展示共刺激第二信號的幹擾有利地影響自身免疫性。使 用阿巴西普的共刺激阻斷已被證明在牛皮癬（AbramsJR,LebwohlMG,GuzzoCA,等人J ClinInvest1999;103:1243 - 52)和牛皮癬性關節炎（MeaseP,GenoveseMC,Gladstein G,等人ArthritisRheum2011;63:939 - 48)中具有臨床有效性，並且被批准用於治療包 括幼年類風溼性關節炎的類風溼性關節炎，GenantHK，PeterfyCG，WesthovensR,等人 AnnRheumDis2008;67:1084 - 89)。（RupertoN,LovellDJ，QuartierP,等人Lancet 2008;372:383 - 91。）另外，共刺激阻斷可有效控制同種異體移植物排斥。（Vincenti F，LarsenC，Dur;rbachA.NEnglJMed2〇〇5;353:77〇_ 81。）此外，Lenschow和同事 (LenschowDJ，HoSC，SattarH,等人JExpMed1995;181:1145_55)證明使用抗137-2單 克隆抗體和CTLA4 -免疫球蛋白融合蛋白兩者的共刺激阻斷可在10周齡之前施用時預防 N0D小鼠模型的糖尿病。
[0031] 現在已經展示使用如CTLA-4組合物並且尤其阿巴西普的T細胞共刺激拮抗劑 的共刺激調節可通過阻斷自身攻擊性T細胞的產生來在新近診斷患有1型糖尿病的患者 中阻止或減緩自身免疫性0細胞破壞，導致保持C肽分泌（Orban等人，Lancet2011 ; 378(9789):412-9。）
[0032] 存在許多被認為在人1型糖尿病中是至關重要的自身抗原。一些數據表明胰 島素是在疾病的發病機理中起作用的主要抗原（Muir等人（1993)DiabetesMetab.Rev 9:279-287)。胰島素是一種0細胞特異性主要蛋白質，它在單獨使用時適度地具有免疫 原性，並且在先導人試驗中展示具有延遲糖尿病發展的效應（Keller等人（1993)Lancet 341:927-928)。然而，它必須長時間地每日注射以誘導所需效應。當胰島素在人中使用時， 總是存在關於低血糖和它的後果的主要問題。
[0033] 缺乏低血糖效應的胰島素或前胰島素原的免疫原性片段或變體是對人使用的安 全選擇。舉例來說，胰島素B鏈（或其沒有代謝作用的免疫原性片段和變體）可在人的1 型糖尿病臨床發作之後，用作預防或延遲功能性、殘留0細胞團塊進一步損失的免疫調節 齊U，而沒有低血糖作用。在人受試者中再引入自身抗原，例如，胰島素B鏈可起作用以改變 至觸發保護性免疫響應的自身免疫過程。Thl/Th2平衡可變化以利於保護性Th2類型細胞 反應，並產生調控性免疫細胞Tregs。
[0034] 針對胰島素、穀氨酸脫羧酶（GAD)和其它胰島細胞自身抗原，例如，ICA512/1-2 蛋白質酪氨酸磷酸酶ICA12、ICA69的自身抗體常常發現於新診斷糖尿病患者中。因此，適 用於本發明方法的1型糖尿病自身抗原包含，例如，前胰島素原或其免疫活性片段（例如， 前胰島素原片段、胰島素B鏈、A鏈、C肽或其免疫活性片段），和其它胰島細胞自身抗原 (ICA)，例如，GAD65、胰島酪氨酸磷酸酶ICA512/IA-2、ICA12、ICA69或其免疫活性片段。其 它1型糖尿病自身抗原包括HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、神經節苷脂（例如，GM1-2、GM3)或 其免疫活性片段。本文描述的任何1型糖尿病自身抗原，或其免疫活性片段、類似物或衍生 物適用於本發明方法和組合物。
[0035] 胰島素mRN被翻譯為稱為前胰島素原的110胺基酸單鏈前體，並且在插入內質網 期間移除它的信號肽產生胰島素原。胰島素原由三個結構域組成：氨基末端B鏈、羧基末端 A鏈和在中間被稱為C肽的連接肽。在內質網中，胰島素原暴露多個特定內肽酶，其切除C 肽，從而產生由A鏈和B鏈組成的成熟形式的胰島素。胰島素和自由C肽在高爾基體中包 裝成在細胞質中積聚的分泌顆粒。前胰島素原肽序列發現於SEQIDN0 :1中。
[0036] 胰島素鏈包含SEQIDNO: 1的胺基酸90-110。B鏈包含SEQIDNO: 1的胺基酸 25-54。連接序列（SEQIDN0 :1的胺基酸55-89)包含任一末端的一對鹼性胺基酸。在這 些雙鹼基序列處的胰島素原的蛋白裂解釋放胰島素分子和游離C肽，其包括SEQIDN0:1 的胺基酸57-87。人前胰島素原或其免疫活性片段，例如，B鏈或免疫原性片段其，例如，SEQ IDNO: 1的胺基酸33-47 (對應於B鏈的殘基9-23)或信號肽序列或前胰島素原的其它序列 在本文所述的方法和組合物中適用作自身抗原。
[0037]Gd65是涉及導致胰島素依賴性糖尿病的自身免疫響應的主要3細胞抗原 (Christgau等人（1991)JBiol.Chem. 266 (31): 21257-64)。GAD65 的自身抗體的存在被用 作1型糖尿病的診斷法。Gad65是SEQIDN0:2的585胺基酸蛋白質。反映施用效果的自 體抗體滴度和GAD65AB同種型的變化可用於表徵糖尿病或糖尿病前期患者的自身免疫過 程的消退。另外，與自身抗原施用的效果關聯的刺激細胞因子特徵（有利於Th2-細胞）存 在變化，其稍後可用作1型糖尿病的自身免疫性消退的體液標記物。
[0038]IA-2/ICA512,蛋白質酪氨酸磷酸酶家族的成員，是1型糖尿病的另一個主要自 身抗原（Lan等人DNACellBiol13:505-514,1994)。70%糖尿病患者具有IA-2的自 身抗體，其在患上臨床疾病之前數年出現。IA-2分子（SEQIDN0:3,如下）是979個 胺基酸長度並且由細胞內結構域、跨膜結構域和細胞外結構域組成（Rabin等人（1994) J.Immunol. 152(6)，3183-3188)。自身抗體通常針對細胞內結構域，例如，SEQIDN0:3的氨 基酸 600-979 及其片段（Zhang等人（1997)Diabetes46:40-43;Xie等人（1997)JImmunol 159:3662-3667)。IA-2 的胺基酸序列展示於SEQIDNO:3。
[0039]ICA12(Kasimiotis等人（2000)Diabetes49(4):555-61;Genbank登陸號 AAD16237;SEQIDN0:4)是與糖尿病相關聯的許多胰島細胞自身抗原之一。ICA12的序列 提供為SEQIDN0 :4。
[0040]ICA69是與1型糖尿病相關聯的另一個自身抗原（Pietropaolo等人JClinInvest 1993 ;92:359-371)。ICA69 的胺基酸序列提供為SEQIDNO:5。
[0041]Glim38是38kDa胰島細胞膜自身抗原，其尤其與來自糖尿病前期個體和新診斷1 型糖尿病患者的子集的血清一起免疫沉澱。Glim38是兩親性膜糖蛋白，尤其表達於胰島 和神經元細胞系中，因而共有GAD65和IA2的神經內分泌表達模式（Aanstoot等人JClin Invest.June15, 1996 ;97 (12):2772-2783)。
[0042]HSP60,例如，HSP60的免疫活性片段，例如，p277(參見Elias等人，EurJImmunol 199525(10) :2851-7)，也可在本文所述的方法和組合物中用作自身抗原。HSP60的其它適 用表位描述於例如美國專利號6, 110, 746中。
[0043] 羧肽酶H例如在前1型糖尿病患者中被識別為自身抗原（Castano等人（1991) JClinEndocrinolMetab. 73 (6) : 1197-201;Alcalde等人JAutoimmun. 1996 年 8 月； 9 (4) : 525-8.)。因此，羧肽酶H或其免疫反應性片段（例如，在Castano同上文中描述的羧 肽酶-H的136胺基酸片段）可用於本文所述的方法和組合物中。
[0044] 外周蛋白是在nod小鼠中識別的58KDa糖尿病自身抗原（Boitard等人（1992) ProcNatl.Acad.Sci.USA89(1): 172-6。人外周蛋白序列展示為SEQIDN0:6。
[0045] 神經節苷脂也可為本文所述的方法和組合物中的適用自身抗原。神經節苷脂是含 有唾液酸的糖脂，其由疏水性部分、神經醯胺和親水性部分，即寡糖鏈形成。神經節苷脂尤 其表達於胰島的分泌顆粒的細胞溶質膜中。神經節苷脂的自身抗體描述於1型糖尿病中， 例如，GM1-2神經節苷脂是糖尿病自身免疫性中的胰島自身抗原並且由人原生0細胞表 達（Dotta等人Diabetes.S印tember1996 ;45 (9) : 1193-6)。神經節苷脂GT3、⑶3 和GM-1 也是與自身免疫糖尿病相關聯的自身抗體的祀標（綜述於Dionisi等人Ann1stSuper Sanita1997;33(3):433-5)。神經節苷脂GM3參與胰島素抵抗的病理狀態（Tagami等人J BiolChemNov. 13, 2001 ;在印刷前在線發布）。
[0046] 胰島素B鏈是優選糖尿病自身抗原。人疫苗使用的人胰島素B鏈可通過標準固相 肽合成來製成。本文描述有效溶解胰島素0鏈的程序。在一些實施方案中，自身抗原是人 胰島素B鏈（SEQIDNO: 1的胺基酸25-54)或其免疫活性片段或其變體。在一些實施方案 中，B鏈或其片段未重組。舉例來說，B鏈或其免疫原性片段或其變體是合成肽，例如，B鏈通 過固相合成製成。在一些優選實施方案中，B鏈溶解於尿素中。在一些實施方案中，人胰島 素B鏈變性，例如，溶解於尿素和DTT中。在一個優選實施方案中，人胰島素B鏈在30-70 % 之間，優選地40-60 %之間，更優選地45-55 %重量比例（w/w)之間。
[0047] 因此，本文提供通過施用CTLA4和1型糖尿病自身抗原來治療、預防或延緩糖尿病 進展的方法。兩個組分可同時、順序地或以單獨時程施用（例如，一個在早晨和另一個在傍 晚或以相對於彼此的其它不同時程）。
[0048]T1DM的發作可通過如本文描述的方法來延遲，以使得受試者不需要胰島素歷時更 長時間。替代地或另外地，本發明方法可在已患糖尿病受試者中延長"蜜月期"。蜜月期是 其中胰島素由胰腺分泌，從而引起高血糖水平減退，並且由於胰島素注射和治療的反應而 產生正常或接近正常葡萄糖水平的時期。
[0049] 可在受試者中通過首先選擇易患糖尿病的受試者並施用如本文描述的CTLA4分 子和1型糖尿病自身抗原來預防T1DM。易患糖尿病的受試者可通過GAD65自身抗體（GAA)、 ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的一個或多個的表達來選 擇。這些自身抗體中的每一種與進展至自身免疫性1型糖尿病的風險相關聯。GAD65自 身抗體（GAA)、ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的兩個或更多 個的表達與進展至自身免疫性1型糖尿病的高風險相關聯。（LipingYu等人，Diabetes August2001vol. 50no. 8 1735-1740;VergeCF等人，Diabetes45:926 - 933, 199;Verge CF.等人，Diabetes47:1857 - 1866, 1998;和BingleyPJ,等人，Diabetes43:1304 -1310, 1994)。
[0050] T1DM也可通過如本文所述的方法來治療。治療可針對具有殘留0細胞功能的受 試者以及不再具有任何3細胞功能的受試者。治療還被可建議來用於經由移植或注射或 其它0細胞替換手段（如胚胎或其它幹細胞療法或其它替換手段）提供外源性0細胞的 受試者。
[0051]CTLA4分子和如本文描述的T1DM自身抗原的組合可作為一種或多種藥物組合物 的一部分來施用。本發明方法可預防糖尿病，或預防或延遲殘留0細胞團塊的損失，提供 減少短期併發症的更長緩解期並且在生命後期延緩糖尿病相關併發症的發作。
[0052]CTLA4分子和T1DM自身抗原可組合成單一藥物組合物。或者，CTLA4分子在一個 藥物組合物中提供並且T1DM自身抗原在單獨藥物組合物中提供。在這個替代方案中，兩個 藥物組合物可具有相同或不同施用模式和施用時程。
[0053] 如本發明提供的藥物組合物可包括藥學上可接受的載體。術語"藥學上可 接受的載體"根據所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒介物、分 散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。 Remington'sPharmaceutical-Sciences,第 16 版,E.ff.Martin(MackPublishing Co. ,Easton,Pa. , 1980)公開用於配製藥物組合物的各種載體和其已知製備技術。除了如通 過產生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互作 用而與物質或其衍生物不相容的任何常規載體介質以外，所述載體的使用被涵蓋在本發明 的範圍內。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例是糖諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱 粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸 纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油，如花生油、棉籽 油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙 酯；瓊脂；緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙 醇，和磷酸鹽緩衝溶液，以及其它無毒相容潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色 齊U、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根據配方配製人員的 判斷而存在於組合物中。
[0054] 包括藥學上可接受的載體的本文描述的化合物可使用多種途徑或施用模式來遞 送至患者。適合施用途徑包括但不限於吸入、經皮、口服、直腸、經黏膜、腸道和腸胃外施用， 包括肌肉內、皮下和靜脈內注射。
[0055] 如本文描述的組合物可與佐劑一起施用。術語"佐劑"可為單獨施用時缺乏顯著 活性但是可增強另一種治療劑的活性的化合物。在一些實施方案中，佐劑選自由以下組成 的組：緩衝劑、抗微生物防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑、滋養調節劑、抗菌劑、增稠劑和粘度 改良劑。在一些實施方案中，佐劑是IFA，或其它油基佐劑以30-70%之間，優選地40-60% 之間，更優選地45-55%之間的重量比例（w/w)存在。在一些實施方案中，人胰島素B鏈和 IFA或其它油基佐劑以約50/50重量比率存在。在一些實施方案中，藥物組合物不含汙染 物，例如，熱原。
[0056] 在一些實施方案中，將自身抗原凍幹。在另一方面，本發明提供含有通過以下方法 製成的T1DM自身抗原的藥物組合物：將T1DM自身抗原與油基載體，例如，油基佐劑，例如， IFA，或其它油基佐劑，例如，MontanideISA(例如，MontanideISA51)組合，並且將胰島素 B鏈和油基佐劑乳化。在一些實施方案中，T1DM自身抗原是人胰島素B鏈或前胰島素原或 其免疫活性片段或其變體，其與油基載體組合，其中將胰島素B鏈和油基佐劑乳化。在一個 優選實施方案中，人胰島素0鏈和油基佐劑以30/70至70/30之間的重量比率（w/w)組合， 優選地40/60至60/40之間，優選地45/55至55/45之間，更優選地約50/50w/w比率。在 一個優選實施方案中，乳化用高壓力注射器執行。在優選實施方案中，油基載體或佐劑和優 選地組合物不包括細菌組分，例如，分枝桿菌組分。
[0057] 在一些實施方案中，T1DM自身抗原是B鏈或前胰島素原或其免疫原性活性片段或 其變體，並且溶解於約3M至8M尿素，優選地約3. 5M至7M尿素，或約4M至6M尿素。在一 個優選實施方案中，B鏈或其免疫原性活性片段或其變體溶解於約3M至5M尿素，優選地約 3. 5M至4. 5M尿素，最優選地約4M尿素。在一個優選實施方案中，0鏈或其免疫原性活性 片段或其變體溶解於5-8M尿素，優選地約6M至7M尿素。優選地，B鏈在還原劑存在下溶 解，例如，DTT或等效還原劑，例如，在溶解步驟期間添加lmg至5mgDTT。
[0058] 在一些實施方案中，包含1型糖尿病自身抗原和/或CTLA4分子的組合物也包括 油基載體。
[0059] 油基載體是包括至少10重量％的適合於結合治療劑來施用至人的天然或合成油 的組合物，這是一個優選實施方案。在優選實施方案中，載體包括至少20、30、50、70、80、90、 95、98或99重量％的油。在一些實施方案中，油基載體可包括小於70、60、50、40、30或20 重量％的油。在優選實施方案中，油在10重量％至95重量％範圍內，優選地20重量％至 90重量％或30重量％至70重量％的油。油應被選擇來使得在施用至受試者時，它提供分 散於其中的物質的持續釋放。適合油包括礦物油（例如，Drakeol6VR輕質礦物油）、植物 油、角S烯或液體石錯。在一些實施方案中，油基載體可含有一種以上類型油。在一些實施 方案中，油基載體可包括免疫刺激劑，例如，免疫刺激葡聚糖，但是優選得多的是油基載體 不包括免疫刺激劑，例如，免疫刺激葡聚糖、細菌組分，例如，分枝桿菌組分。在一個優選實 施方案中，油基載體不包括明礬組分。
[0060] 雖然不希望受理論約束，據信油基載體通過觸發與炎症和保護性免疫應答能力相 關的免疫活性細胞來起作用。油基載體也可充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝 置。當注入受試者時，油基載體和抗原組合物可在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原 降解。抗原可從此積存物釋放緩慢至系統，並且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表 面面積並吸引炎性細胞。巨噬細胞可消化大多數併入的材料並且在其表面上呈遞經過加工 的抗原。抗原可從此積存物釋放緩慢至系統中並且提供長效的抗原供應來充當共刺激調節 劑。
[0061] 油基載體任選地包括乳化劑或表面活性劑組分。乳化劑或表面活性劑（和乳化劑 或表面活性劑的量）經過選擇以使得它促進物質（例如，抗原製劑）與油的混合或分散。油 基載體可包括0. 1重量％至50重量％，優選地1重量％至30重量％，更優選地5重量％至 20重量％的表面活性劑或乳化劑。乳化劑或表面活性劑的實例包括ArlacelA、二縮甘露 醇油酸酯（例如，Montamide80-二縮甘露醇單油酸酯）、無水甘露糖醇/油酸酯、聚氧乙烯 或聚氧丙烯。
[0062] 不完全弗氏佐劑（IFA)是人中的自身抗原的優選遞送媒介物。本發明方法可預防 糖尿病，或預防或延遲殘留3細胞團塊的損失，提供更長緩解期並且在生命後期延緩糖尿 病相關、通常漸進性併發症的發作。
[0063] 油基載體或佐劑通常由與水混合的兩種組分：（1)油和（2)乳化劑或表面活性劑 所組成。適合油和乳化劑在本領域中為已知的。舉例來說，油可為礦物油、植物油、角鯊烯 或液體石蠟。乳化劑或表面活性劑可為，例如，ArlacelA、二縮甘露醇油酸酯、無水甘露糖 醇/油酸酯、聚氧乙烯或聚氧丙烯。示例性油基佐劑包括常規IFA、MontamideISA佐劑或 亨特氏TiterMax佐劑。在優選實施方案中，佐劑包括20重量％至95重量％，優選地30 重量％至90重量％，更優選地40重量％至70重量％的油相，和0. 1重量％至50重量％, 優選地1重量％至30重量％，更優選地5重量％至20重量％的表面活性劑或乳化劑。各 種類型的油基佐劑描述於例如美國專利號5, 814, 321、美國專利號6, 299, 884、美國專利號 6, 235, 282和美國專利號5, 976, 538中。
[0064]IFA通常是非代謝油（例如，礦物油）、水和表面活性劑（例如，ArlacelA)的 混合物。不同於完全弗氏佐劑（CFA)，IFA不含有細菌組分，例如，分枝桿菌。在人中使 用IFA的第一次大規模接種疫苗發生於美國軍事人員（Davenport(1968)AnnAllergy 26:288-292;Beebe等人，（1972)AmJEpidemiol95:337-346;Salk&Salk(1977)Science 195:834-847)。關於惡性腫瘤、過敏疾病和膠原病的結果基本上是陰性的，但是有證據表明 一些人在接種位點具有囊胞樣反應。後期研究確認這些副作用是歸因於不正確的施用，即 它被錯誤地進行皮下而非肌肉內給藥。根據這些實驗，IFA被一些人視為不適合於人使用， 但是它仍然廣泛用於動物研究。最近幾年中，新形式的IFA證明對於HIV免疫療法或治療接 種疫苗的人的使用是安全的（Turner等人（1994)AIDS8:1429-1435 ;Trauger等人（1995) JAcquirImmuneDeficSyndrHumRetrovirol10Supp2:S74-82;Trauger等人（1994)J InfectDis169:1256-1264)。
[0065]MontanideISA佐劑（Seppic,Paris,France)是一組基於油/表面活性劑的佐劑， 其中不同表面活性劑與非代謝礦物油、代謝油或兩者的混合物組合。這些佐劑被製備來用 作與Ag水溶液的乳液。MontanideISA50(ISA=不完全S印pic佐劑）的表面活性劑是二 縮甘露醇油酸酯，即弗氏佐劑中的表面活性劑的主要部分。Montanide組的表面活性劑經 歷嚴格的質量控制以防止可導致過度炎症的任何物質的汙染，如已在用於弗氏佐劑中的一 些ArlacelA批料中發現所述汙染。各種MontanideISA組的佐劑用作油包水乳液、水包 油乳液或水包油包水乳液。由於表面活性劑和油組合的變化，不同佐劑適應不同水相/油 相比率。
[0066] 亨特氏TiterMax(CytRxCorp.，Norcross,Ga.)是以類似於用於常規弗氏佐劑 的方式製備為油包水乳液的基於油/表面活性劑的佐劑。然而，它使用代謝油（角鯊烯） 和具有良好蛋白質抗原結合能力以及輔助活性的非離子表面活性劑。輔助活性可部分地 涉及表面活性劑的活化補體並且結合補體組分的能力，因為此有助於將Ag靶向輸送至脾 和淋巴節中的濾泡樹突狀細胞。用於可購得佐劑中的表面活性劑是由Hunter(Hunter等 人，1991Vaccine 9:250-256)開發的聚氧乙烯與聚氧丙烯的許多合成非離子嵌段共聚物 中的一種。利用共聚物包衣的微粒來使乳液穩定允許形成具有小於20%油的穩定乳液，這 是最小化所注射的總佐劑的重要因素。
[0067]佐劑可與抗原一起使用以引出細胞介導免疫力和產生抗體保護性同種型（在小 鼠中為IgG2a並且在靈長類中為IgGl)。不同類型的佐劑共有類似副作用，如注射位點的反 應和致熱性。明礬是一種用於人疫苗的常用佐劑，它也在注射位點產生可觀的肉芽腫反應 (Allison&Byars(1991)MolImmunol28:279-284)。不完全弗氏佐劑的作用模式可涉及 非特異性以及特異性免疫應答。IFA似乎通過觸發與炎症以及保護能力相關的免疫活性細 胞來起作用。IFA也充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝置。將IFA和抗原化合 物注入患者，它在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原降解。抗原從此積存物釋放緩慢 至系統，並且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表面面積並吸引炎性細胞。巨噬細胞 消化大多數併入的材料並且在其表面上呈遞經過加工的抗原。
[0068] 已發現IFA對於抗原免疫原性的特異性增強效果產生增加的體液免疫（優選保護 性抗體產生；在人中為IgGl並且在小鼠中為IgG2a)並且引起特異性細胞介導免疫（優選 Th2類型和Tregs)。具體來說，作為一個實例，IFA中的人重組胰島素B鏈在N0D小鼠胰島 中產生Th2細胞因子模式（Ramiya等人（1996)JAutoimmun9:349-356)。IFA在動物模型 中對經過糖尿病預防試驗的佐劑是獨特的。Ramiya和同事（同上文）得出的結論是：明礬 和DPT兩者作為佐劑具有與所使用的抗原不相關的"非特異性"保護效果，而IFA是具有用 於動物中糖尿病預防的抗原特異性保護效果的唯一佐劑。
[0069]IFA，優選被批准用於人的IFA，例如，Montanide(例如，MontanideISA51,Seppic Inc. ,France)或等效組合物，是用於本文描述的方法和疫苗的優選佐劑。MontanideISA51 在我們的動物研究和我們的人研究中沒有展示全身或顯著局部副作用。
[0070]對於口服施用，化合物可容易通過將活性化合物與本領域中熟知的藥學上可接受 的載體組合來配製。這類載體使得本發明的化合物可配製為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液 體、凝膠、糖漿、漿液、混懸液等，以供所治療的患者口服攝入。用於口服的藥物製劑可通過 以下獲得：添加固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，並且（如果需要的話）在添加適合的 助劑之後，加工顆粒混合物以獲得片劑或糖錠劑核心。適合的賦形劑尤其是填充劑，如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑，例如像玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯 澱粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯 烷酮（PVP)。如果需要，可以添加崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如 海藻酸鈉。
[0071]化合物可被配製用於通過注射進行腸胃外施用，例如，通過彈丸式注射或持續輸 注施用。注射（靜脈內或皮下）是施用本發明組合物的優選方法。用於注射的製劑可與添 加的防腐劑一起以單位劑型提供例如在安瓿中或在多劑量容器中。組合物可採用油性或水 性媒介物中的混懸液、溶液或乳液的這類形式，並且可含有配製劑，如可添加混懸、穩定和/ 或分散劑，如交聯聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
[0072]在一些實施方案中，如本文描述的組合可通過皮下或肌肉內注射來腸胃外施用。 在一些實施方案中，優選施用模式是肌肉內。舉例來說，如本文描述的1型糖尿病自身抗原 可以肌肉內注射形式給與，優選地深肌肉內注射，以較小體積，例如，lml來給予。自身抗原 可施用一次，或一次以上。它可例如在1型糖尿病發作之前或之後給予。
[0073] 劑量還可取決於施用途徑並且根據宿主大小而變化。舉例來說，2mg人胰島素B鏈 溶液可施用至成人。根據本發明的免疫原性組合物中的活性成分蛋白質的濃度通常約1至 95%。
[0074] 疫苗也可含有佐劑，例如，油基佐劑，例如，IFA。優選地，疫苗含有適合於並且批准 用於人的IFA，例如，MontanideISA51或等效組合物。
[0075] 疫苗在適合於人施用的條件下製備。優選地，疫苗注射在施用之前立即在無菌條 件下製備為乳液，通過使用高壓力無菌注射器製備為胰島素B鏈/IFA的50/50 (w/w)乳液。
[0076] 本文描述的方法和疫苗可用於預防自身免疫疾病，例如，糖尿病的發作。所述方法 和疫苗也可用於阻止組織，例如，胰腺0細胞的自身免疫破壞。所述方法和疫苗甚至適用 於在晚期階段阻止自身免疫破壞。舉例來說，在1型糖尿病臨床發作時，顯著數目的胰島素 產生0細胞遭破壞，但是約15%大概多達40%仍然能夠產生胰島素。如果自身免疫過程 可甚至在此晚期階段得到抑制，這些細胞可得以保留。0細胞具有一些有限複製能力並且 前體可形成新的0細胞。
[0077] 用於腸胃外施用的藥物製劑包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活 性化合物的混懸液可以製備為適當的油性注射混懸液。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪 油（如芝麻油）或合成脂肪酸酯（如油酸乙酯或三酸甘油酯）或脂質體。水性注射混懸液 可含有增加混懸液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述混懸 液也可以含有適合的穩定劑，或增加化合物溶解度以允許製備高濃度溶液的試劑。對注射 來說，本發明的藥物組合物可在水溶液，優選生理相容緩衝液（諸如漢克斯溶液、林格氏溶 液或生理緩衝鹽水）中配製。或者，活性成分可呈粉末形式，以用於在使用前利用適合的媒 介物（例如，無菌無熱原水）構建。
[0078] 提供至受試者的CTLA4分子和胰島素0鏈的組合的量取決於受試者體型和體重 以及疾病進展。對於本文描述的化合物，治療有效量可最初在體外測定中確定。由於本發 明化合物可具有低吸收和低生物利用率，因此治療有效量可根據例如化合物或其代謝物的 糞便濃度或來自血液的生物標記物來確定。如本領域中熟知的，用於人的治療有效量也可 根據動物模型來確定。治療有效劑量也可從已知展現類似藥理學活性的化合物的人數據來 確定。施加劑量可基於與已知化合物比較施用化合物的相對效力來調節。
[0079] 腸胃外施用本文描述的化合物的患者劑量通常在約lmg/天至約10,OOOmg/天範 圍內，更通常約l〇mg/天至約1，OOOmg/天或約250mg/天至約2,OOOmg/天，並且最通常約 50mg/天至約500mg/天或約0? 5mg/天至約10mg/天。就患者體重而言，典型劑量在約0? 01 至約150mg/kg/天範圍內，更通常約0? 1至約15mg/kg/天，並且最通常約1至約10mg/kg/ 天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
[0080]CTLA4分子和胰島素B鏈可以單一劑量施用或其可單獨地施用，其中單獨施用 涵蓋在接近相同時間施用或在不同時間施用，如一個在早晨並且另一個在傍晚，或一個每 天兩次並且另一個每天一次。兩個藥物可同時或以不同順序給與，即在不同時間點，首先 CTLA4-Ig，隨後IFA中的胰島素B鏈或胰島素B鏈然後CTLA4-Ig。
[0081]CTLA4分子可以單一每日劑量施用或它可每天多次施用。或者，它可每天小於一次 施用。給藥可在一段時間內，如每月或每28天一次。在一些實施方案中，可在開始治療時 給與其它劑量（例如，彈丸式給藥）。在一些實施方案中，劑量含有大約1、3、5、10、20、30、 50、100mg/kg的融合蛋白。在一些實施方案中，劑量含有大約1、3、5、10、20、30、40、50、100、 500mg/kg的糖尿病自身抗原。
[0082]本文使用的術語的定義意圖併入在化學和藥物領域中關於每個術語公認的當前 技術現狀定義。在適當情況下，提供例證。定義適用於在整個本說明書中使用的術語，除非 在具體情況中單獨地或作為較大組的一部分另外加以限制。
[0083]如本文使用，術語"施用"意圖包括直接和間接地將化合物遞送至它的預期作用位 點的所有手段。
[0084]如本文使用，"自身抗原"是儘管是正常細胞或組織成分，但是可為受試者的體液 或細胞介導免疫響應的靶蛋白。舉例來說，糖尿病1型自身抗原通常是胰腺細胞的正常蛋 白質成分。本文描述的自身抗原的"免疫活性片段"是如下自身抗原，其中一個或多個氨基 酸殘基已經缺失，並且片段保留與免疫細胞或與自身抗原抗體反應或刺激針對自身抗原的 抗體產生的能力。舉例來說，免疫活性片段可為自身抗原多肽，其中殘基已經從氨基和/或 羧基末端連續地缺失，同時基本上保留免疫原性活性。舉例來說，胰島素B鏈（SEQIDNO: 1 的胺基酸25-54)是前胰島素原的免疫活性片段；包括SEQIDNO:1的胺基酸33-47的多 肽是B鏈的免疫活性片段；包括SEQIDN0:3的約600至979胺基酸的多肽包括IA-2的免 疫活性片段。在一個優選實施方案中，免疫活性片段是SEQIDN0:1-6中任何一個的片段。 優選片段沒有原生自身抗原的一種或多種生物活性，但是保留與自身抗原抗體和免疫細胞 反應的能力。例如，優選胰島素片段或變體缺少低血糖效應。優選地，本文描述的自身抗原 的免疫活性片段具有4與400個之間的胺基酸殘基長度，更優選地10與300個之間的氨基 酸殘基長度，更優選地30與200個之間的胺基酸殘基長度。
[0085]如本文在延遲糖尿病進展的情形中使用的短語"延遲進展"意指在1型糖尿病的 臨床發作之後功能性殘留0細胞團塊的損失被延遲。T1DM的延遲進展可例如通過測量C 肽產生來測量。
[0086] 本文描述的自身抗原的"免疫活性變體"是如下自身抗原，其通過添加、修飾或取 代天然發生的自身抗原中的一個或多個胺基酸殘基來修飾並且保留與自身抗原抗體反應 或刺激針對自身抗原的抗體產生的能力。本文描述的變體包括等位基因和多形變體，以及 保持結合自身抗原抗體或產生針對人體內的自身抗原的免疫響應的能力的突變蛋白和融 合蛋白。舉例來說，自身抗原的多達20%，優選地多達10%的胺基酸殘基可置換為替代氨 基酸，只要變體保留結合自身抗原或產生針對例如人體內的自身抗原的免疫響應的能力。 變體也可包括本文描述的自身抗原或其片段，其中已經插入或添加一個或多個胺基酸，例 如，偶合或融合至載體肽的自身抗原。還包含含有修飾的變體，如併入非天然胺基酸殘基， 或磷酸化、磺化或生物素化胺基酸殘基。胺基酸殘基的修飾還可包括羧基末端或含有羧基 側鏈的殘基的脂族酯或醯胺、含有羥基的殘基的〇-醯基衍生物，和氨基末端胺基酸或含有 氨基的殘基例如賴氨酸或精氨酸的N-醯基衍生物。其它修飾包括添加其它部分，尤其可增 加自身抗原的免疫原性的部分。優選變體沒有原生自身抗原的一種或多種生物活性，但是 保留與自身抗原抗體或免疫細胞反應的能力。例如，優選胰島素變體沒有低血糖效應。 [0087]短語"藥學上可接受的"是指在施用至如哺乳動物（例如，人）的動物時生理上 可耐受並且通常不產生過敏或類似不利反應（如胃不適、眩暈等）的添加劑或組合物。術 語"藥學上可接受的載體"根據所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒 介物、分散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑 等。Remington's,TheScienceandPracticeofPharmacy, (Gennaro,A.R.編，第 19 版，1995,MackPub.Co.)公開用於配製藥物組合物的各種載體和其已知製備技術。除了如 通過產生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互 作用而與物質或其衍生物不相容的任何常規載體介質以外，所述載體的使用被涵蓋在本發 明的範圍內。可充當藥學上可接受的載體的材料的一些實例包括但不限於糖如乳糖、葡萄 糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基 纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；膠質；滑石粉。賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油，如 花生油，棉籽油；紅花油，芝麻油；橄欖油；玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙 酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林 格氏溶液；乙醇，和磷酸鹽緩衝溶液，以及其它非毒性相容的潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬 脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根 據配製人員的判斷而存在於組合物中。
[0088] 術語"藥物組合物"是指具有如載體和/或賦形劑的其它試劑的本文描述的組合 物或其藥學上可接受的鹽。優選地，藥物組合物具有以至少95 %純度，或98 %純度，或99% 純度，或更大純度存在的活性劑。
[0089]如本文使用，術語"受試者"是患有糖尿病、前糖尿病或易患糖尿病體質的人或其 它動物。因此，在一些實施方案中，受試者需要如本文提供的治療性治療。優選患者是哺乳 動物。患者的實例包括但不限於人、馬、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、豬、山羊和綿羊。在一 些實施方案中，"受試者"通常是患有糖尿病的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是在 最近200、100或50天內被診斷患有T1DM的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是最近 被診斷患有糖尿病但是仍然具有殘留0細胞功能的人患者。在一些此類實施方案中，殘留 3細胞功能是可檢測的，或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多的3細胞處於完 全運作胰腺中。
[0090] 術語"治療有效量"是指在劑量下和在所需時間周期在細胞培養物、組織系統、動 物或人中有效實現所需生物或醫藥反應（例如，所需治療結果）的量。組合物的有效量可 以根據多種因素而不同，如個體的疾病病況、年齡、性別以及體重和CTLA4分子和/或糖尿 病自身抗原在個體體內引出所需反應的能力。治療有效量也是其中治療有利效果超過組合 物的任何毒性或有害影響的量。在一些實施方案中，反應包括減輕和/或延遲所治療的疾 病、病狀或病症的一個或多個症狀的發作。
[0091] 如本文使用的術語"治療"定義為將治療劑應用或施用至受試者，或將治療劑應用 或施用至患有糖尿病、疾病症狀或易患病體質的受試者的分離組織或細胞系。治療意圖包 括預防發作、減緩進展、逆轉或另外改善、改善或影響疾病、疾病症狀或易患病體質。舉例來 說，用本文描述的組合物治療受試者，例如，人受試者可在1型糖尿病的臨床發作之前、期 間或之後減慢、改善或停止受試者的正在進行的自身免疫性，例如，針對胰腺0細胞的反 應。
[0092] 術語"約"或"大致"意指如本領域普通技術人員所確定的特定值在可接受的誤差 範圍內，所述誤差範圍部分取決於所述值如何測量或測定--例如測量系統的限制或特定 用途所需要的精確度。舉例來說，如根據在本領域中的實踐，"約"可意指1個或2個標準偏 差。或者，"約"可意指給定值的最多20%、優選地最多10%並且更優選地最多5%的範圍。 當在本申請和權利要求書中描述特定值時，除非另外規定，否則應假定術語"約"意指在特 定值的可接受誤差範圍內。
[0093] 除非上下文另有明確說明，否則本文中和所附權利要求中所使用的單數形式"一 (個/種）"和"所述"包括複數的提及物。因此，例如，對"一個分子"的提及包括這類分子 中的一個或多個，"一種樹脂"包括這類不同樹脂中的一種或多種，並且對"一種方法"的提 及包括提及本領域普通技術人員已知的可被修改或取代本文描述的方法的等效步驟和方 法。
[0094] 雖然以上描述提供各種實施方案的實例和特定細節，但是應認識到，所描述實施 方案的一些特徵和/或功能允許修改而不脫離所描述實施方案的範圍。以上描述意圖說明 本發明，但其範圍只通過所附權利要求的用語來限制。
[0095]實施例
[0096]根據下列實施例可以進一步理解 申請人:教導的各方面，所述實施例不應當被解釋 為以任何方式限制 申請人:教導的範圍。
[0097]實施例1-阿巴西普的施用
[0098]針對本研究對過去100天內被診斷患有1型糖尿病的患者（6-45歲）進行平行篩 選。如果患者具有至少一個糖尿病相關自身抗體（微量測定胰島素抗體[如果胰島素療法 的持續時間小於7天];穀氨酸脫羧酶-65[GAD-65]抗體；胰島細胞抗原-512[ICA-512]抗 體；或胰島細胞自身抗體），並且具有在診斷糖尿病之後至少21天並在37天隨機化期內完 成的混合餐耐量試驗（MMTT)期間被測量到0 ? 2nmol/L或更高的刺激C肽濃度，那麼患者 適合參與研究。
[0099]對於B型肝炎表面抗原、C型肝炎或HIV的血清抗體來說，血液樣品被篩選為陽 性的人被排除參與研究。也測試樣品的埃-巴二氏病毒（Epstein-Barrvirus，EBV)。在篩 選時具有活性EBV感染跡象的個體不合格。隨機化之後展示活性EBV感染跡象的參與者不 接受另外的研究藥物直到消退。
[0100] 患者以2:1比率隨機分配，按照參與地點來分級，接受使用雙盲方案的阿巴西普 或安慰劑實驗治療。表1提供參與者的基線人口統計和實驗室特徵
[0101] 表 1
[0102]

【權利要求】
1. 一種治療受試者的糖尿病的方法，其特徵在於所述方法包括： 向所述受試者施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原，所述融 合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述受試者患有殘留有P細胞功能的1型糖 尿病。
3. 如權利要求1或權利要求2所述的方法，其特徵在於所述T細胞共刺激拮抗劑包含 CTLA4的細胞外結構域、所述細胞外結構域的有效片段或所述細胞外結構域的免疫活性變 體。
4. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述T細胞共刺激拮抗劑結合B 細胞和/或抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7(CD80/86)抗原。
5. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述融合蛋白組合物是阿巴西 普。
6. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述自身抗原選自由以下組成的 組：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經節苷脂或其免疫 活性片段或其變體。
7. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述自身抗原是前胰島素原組合物或其免疫 活性片段或其變體。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述前胰島素原片段是胰島素 B鏈或其免疫 活性片段或其變體。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述胰島素 B鏈片段包含SEQ ID NO: 1的氨 基酸33-47。
10. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述融合蛋白組合物和所述1 型糖尿病自身抗原一起作為藥物組合物來施用。
11. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述藥物組合物還包含油基載體。
12. 如權利要求11所述的方法，其特徵在於所述油基載體是IFA或Montanide ISA。
13. 如權利要求10或權利要求11所述的方法，其特徵在於所述組合物通過靜脈內輸注 來肌肉內或皮下施用。
14. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於所述組合物以在約5mg/kg至約20mg/kg範 圍變化的所述融合蛋白組合物和在約1. 〇mg/ml至約4. Omg/ml範圍變化的所述1型糖尿病 自身抗原的劑量來施用。
15. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於所述組合物以在約250mg至約2000mg範圍 變化的所述融合蛋白和在約〇. 5mg至約10mg範圍變化的所述1型糖尿病自身抗原的劑量 來施用。
16. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述方法還包括確定隨著時間 推移在從所述受試者獲取的血液樣品中C肽的水平，所述水平是作為治療有效性的指示 物。
17. 如權利要求1至9中任一項所述的方法，其特徵在於所述融合蛋白和所述自身抗原 順序地施用。
18. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述治療受試者的糖尿病包括 預防糖尿病的發作。
19. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於所述治療受試者的糖尿病包括 延遲所述糖尿病發作至少六個月。
20. -種藥物組合物，其特徵在於包含： 細胞毒性T淋巴細胞相關聯抗原4 (CTLA4)融合蛋白； 選自由以下組成的組的自身抗原：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶 H、外周蛋白和神經節苷脂或其免疫活性片段或其變體；以及 藥學上可接受的載體。
21. 如權利要求20所述的藥物組合物，其特徵在於所述CTLA4融合蛋白是阿巴西普。
22. 如權利要求20或權利要求21所述的藥物組合物，其特徵在於所述自身抗原是前胰 島素原或其免疫活性片段或其變體。
23. 如權利要求22所述的藥物組合物，其特徵在於所述前胰島素原片段是胰島素 B鏈 或其免疫活性片段或其變體。
24. 如權利要求23所述的藥物組合物，其特徵在於所述胰島素 B鏈片段包含SEQ ID NO: 1的胺基酸33-47。
25. 如權利要求20至24中任一項所述的藥物組合物，其特徵在於所述藥學上可接受的 載體是油基載體。
26. 如權利要求25所述的藥物組合物，其特徵在於所述油基載體是IFA或Montanide ISA。
27. 如權利要求20至26中任一項所述的藥物組合物，其特徵在於包含約250mg至約 2000mg的所述融合蛋白和約0. 5mg至約10mg的所述1型糖尿病自身抗原。
【文檔編號】A61K38/19GK104507490SQ201380034880
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年6月27日 優先權日:2012年6月27日
【發明者】泰漢摩·歐爾本 申請人:歐爾本生物科技有限責任公司