二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物及其製備方法
2023-07-23 09:57:01
專利名稱：二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及肽化合物及其製備方法，尤其是二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物及其製備方法。
背景技術：
近年來國內外生命科學領域中研究的最新熱點「細胞調亡」現象，是由20年前美國生物學家克爾道發現的，他認為人體的細胞也橡樹葉、花草等其它植物一樣，具有新生和調謝的過程。人體細胞凋亡，是人體正常的生理現象。為了保證個體發育成熟，清除一些不需要的細胞，使其自行凋亡或自殺，從而為維護正常生存提供一條有效的途徑。如果沒有細胞凋亡的過程，人體就難以形成和存活，或出現畸形，或出現疾病。腫瘤的發生和細胞凋亡有關，腫瘤細胞之所以無休止地增殖就是因為細胞凋亡的過程受到了破壞，細胞凋亡的動能停止了。
目前治療腫瘤的方法主要有採用一些化學製劑、紫外線、γ-射線等誘導腫瘤細胞凋亡。隨著凋亡研究的逐步深入，人們發現臨床上應用的化療藥物大部分都有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，許多腫瘤內在地抵抗化療可能與其不能激活凋亡機制有關，人們已經認識到特異性地誘導腫瘤細胞凋亡可能是腫瘤治療中最具有廣闊前景的嘗試。
在現有技術中，尚未發現3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物。專利申請號為03100173.4公開了一種二異丙氧基磷醯化二肽甲酯化合物及其製備方法和以其為活性成分的藥物的應用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種具有多種抗腫瘤活性基團的3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物及其製備方法，這類化合物能夠被開發用於抗腫瘤活性藥物。
本發明所提供的3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物或其主體異構體的結構式為 其中AA1和AA2為相同或不相同的胺基酸殘基。
「主體異構體」是對某個分子所有異構體的通稱，它們之間的區別只是它們的原子在空間方向的不同。包括鏡像異構體(對映異構體)，幾何異構體(順/反異構體)，以及含有多於1個手性中心時它們互相不關鏡像關係的化合物(差向異構體)。
本發明提供的3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物的製備方法包括(1)二異丙氧基磷醯化二肽甲酯在甲醇存在下與氫氧化鈉作用製得並分離純化出二異丙氧基磷醯化二肽；(2)二異丙氧基磷醯化二肽在縮合劑作用下與3，4，5-三甲氧基苯胺反應製得並分離純化出二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物。
活性實驗證實本發明的3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物抗腫瘤活性高，具有廣泛的藥用前景。
具體實施例方式
本發明的3，4，5-三甲氧基-二異丙氧基磷醯化二肽苯醯胺化合物可簡寫為DIPP-AA1-AA2-R，其中DIPP代表二異丙氧基磷醯基，R代表3，4，5-三甲氧基苯胺基。
AA1和AA2為相同或不相同的胺基酸殘基，優選L-胺基酸殘基，尤其是纈氨酸殘基和苯丙氨酸殘基。
以下用實施例來描述本發明，但是實施例不構成對本發明的任何限制。實施例1DIPP-L-VAL-L-Phe-R，化合物的結構式為 該化合物的製備過程包括(1)DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3在甲醇存在下與氫氧化鈉作用製得並分離純化出DIPP-L-VAL-L-Phe；(2)DIPP-L-VAL-L-Phe在縮合劑作用下與3，4，5-三甲氧基苯胺反應製得並分離純化出DIPP-L-VAL-L-Phe-R。
所使用到的DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3根據中國專利申請03100173.4所公開的方法進行製備。製備過程為酸鹼中和法合成二異丙基亞磷酸酯(DIPPH)，再由DIPPH與纈氨酸合成DIPP-L-Val，最後由DIPP-L-Val與L-苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3。
第(1)步的具體過程為
將2mmol(0.88g)DIPP-L-VAL-L-Phe-OCH3溶於8ml甲醇中，冰水浴冷卻下加入2.5ml(2.5mmol)1N NaOH溶液，室溫攪拌反應5小時，旋轉蒸發除去甲醇，殘餘物中加入5ml H2O，冰水浴冷卻下，用1N HCl調節pH至3。過濾除去少量不溶物，濾液用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，用飽和NaCl溶液洗滌3次，無水Na2SO4乾燥。過濾，洗滌，合併濾液和洗液，旋蒸除去乙酸乙酯，殘餘物用乙酸乙酯～石油醚重結晶得到產品。
第(2)步的具體過程為在50ml燒瓶中加入4mmol(0.73g)R、4mmol(0.405g)NMM(N-甲基嗎啡啉)和10ml乾燥的四氫呋喃，攪拌下加入4.2mmol(1.80g)DIPP-L-VAL-L-Phe和4.2mmol(0.567g)HOBt(1-羥基-苯並-三氮唑)，冰水浴下滴加4.2mmol(0.866g)DCC(二環己基碳化二亞胺)與5ml乾燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應過夜後過濾，殘餘物用四氫呋喃洗滌三次，合併濾液和洗液，旋蒸除去溶劑，殘餘物加飽和NaHCO3溶液，充分攪拌後用氯仿萃取，合併萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌三次，無水Na2SO4乾燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，殘餘物用矽膠柱層析純化或用甲醇-乙醚重結晶，即可得到目的產物，產率為70.2％所得化合物用電噴霧質譜(ESI-MS)及核磁共振(NMR)檢測，得到波譜數據如下ESI-MS(pos)m/z607.3(M+H)+31P NMR(CCL3)7.16ppm1H NMR(CDCl3)δ0.71(d，6H，Valine CH3)，0.76(d，6H，Valine CH3)，1.03～1.26(m，12H，i-Propyl CH3×4)，1.81(m，1H，Valine β-CH)，2.88(m，H，Phenylalanine β-CH2，3.26(m，H，Phenylalanine β-CH2，5.51(d，H，Valine α-CH)，3.31(d×t，1H，Phenylalanine α-CH)，3.62(s，3H，OCH3)，3.72(s，6H，OCH3)，4.33(m，2H，OCH)，4.39(m，2H，OCH)，5.51(s，1H，Valine NH)，6.98(s，1H，Phenylalanine NH)，7.25～7.95(m，5H，Ph-H)，9.94(S，1H，aniline NH)ppm證明得到的化合物為DIPP-L-VAL-L-Phe-R。
對所製得的產物進行誘導細胞調亡的活性實驗，過程及結果如下細胞培養及藥物處理K562細胞為懸浮生長的細胞，HepG2細胞為貼壁生長的細胞，均購自上海細胞研究所，在37℃，5％CO2條件下培養於RPMI-1640培養液中(含10％滅活小牛血清)。取對數生長期的細胞，以2105個/mL的密度接種於培養板中，培養4h後，加入樣品溶液(使孔中甲醇終濃度為1％)，同時設陰性對照(僅含1％的甲醇)和陽性對照(50μg/mL的順鉑)。用四甲基偶氮唑鹽法(methylthiazolyl tetrazolium assay，MTT)比色實驗分析DIPP-L-VAL-L-Phe-R對人類慢性髓性白血病細胞K562和肝癌細胞HepG細胞增殖抑制率的影響；收集藥物作用24h後的K562細胞和HepG2細胞，加入MTT溶液(終濃度為5μg/mL)，培養4h後離心吸去上清，加入100μL的DMSO，37培養約10min，待結晶溶解完全後，用酶標儀於490nm處測量吸光度A值，計算IC50值。結果DIPP-L-VAL-L-Phe-R對人類慢性髓性白血病細胞K562和肝癌細胞HepG2的IC50值(24h)分別為15umol/L和10umol/L。
實施例2DIPP-L-Phe-L-Phe-R，該化合物的結構式為 該化合物的合成過程為使用實施例1相同的方法製備DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3。
將2mmol(0.88g)DIPP-L-Phe-L-Phe-OCH3溶於8ml甲醇中，冰水浴冷卻下加入2.5ml(2.5mmol)1N NaOH溶液，室溫攪拌反應3小時，旋轉蒸發除去甲醇，殘餘物中加入5ml H2O，冰水浴冷卻下，用1N HCl調節pH至3。過濾除去少量不溶物，濾液用乙酸乙酯萃取3次，合併萃取液，用飽和NaCl溶液洗滌3次，無水Na2SO4乾燥。過濾，洗滌，合併濾液和洗液，旋蒸除去乙酸乙酯，殘餘物用乙酸乙酯～石油醚重結晶得到DIPP-L-Phe-L-Phe。
在50ml燒瓶中加入4mmol(0.73g)3，4，5-三甲氧基苯胺、4mmol(0.405g)NMM和10ml乾燥的四氫呋喃，攪拌下加入4.2mmol(1.99g)DIPP-L-Phe-L-Phe和4.2mmol(0.567g)HOBt，冰水浴下滴加4.2mmol(0.866g)DCC與5ml乾燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應過夜後過濾，殘餘物用THF洗滌三次，合併濾液和洗液，旋蒸除去溶劑，殘餘物加飽和NaHCO3溶液，充分攪拌後用氯仿萃取，合併萃取液依次用飽和NaHCO3溶液、10％檸檬酸、飽和NaCl溶液洗滌三次，無水Na2SO4乾燥，過濾、洗滌、旋蒸除去氯仿，殘餘物用矽膠柱層析純化，即可得到產物，產率為77％所得化合物用電噴霧質譜(ESI-MS)及核磁共振(NMR)檢測，得到波譜數據如下ESI-MS(pos)m/z641.8(M+H)+31P NMR(CCL3)6.01ppm
1H NMR(CCL3)δ1.05～1.20(m，12H，i-propyl CH3×4)，2.88～3.10(m，4H，Phenylalanine β-CH2×2)，3.31(q，1H，Phenylalanine NH)，3.76(s，1H，OCH3)，4.15(m，1H，Phenylalanine αCH)，4.53～4.60(m，2H，i-propyl CHO×2)，4.9(m，1H，*Phenylalanine α-CH)，6.00～6.20(d，1H，*Phenylalanine NH)，6.29～6.41(m，10H，Ph-H×10)，9.00(S，1H，aniline NH)ppm證明得到的化合物為DIPP-L-Phe-L-Phe-R。
使用以上相同的方法進行活性實驗，測得所製得化合物對人類慢性髓性白血病細胞K562和肝癌細胞HepG2的IC50值(24h)分別為150umol/L和17umol/L。
權利要求
1.二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物或其主體異構體，其特徵在於該化合物的結構式為 其中AA1和AA2為相同或不相同的胺基酸殘基。
2.根據權利要求1所述的二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物，其特徵在於AA1和AA2均為L-胺基酸殘基。
3.根據權利要求2所述的二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物，其特徵在於AA1和AA2依次為纈氨酸殘基和苯丙氨酸殘基。
4.根據權利要求2所述的二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物，其特徵在於AA1和AA2都為苯丙氨酸殘基。
5.權利要求1所述的二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物的製備方法，其特徵在於製備過程包括(1)二異丙氧基磷醯化二肽甲酯在甲醇存在下與氫氧化鈉作用製得並分離純化出二異丙氧基磷醯化二肽；(2)二異丙氧基磷醯化二肽在縮合劑作用下與3，4，5-三甲氧基苯胺反應製得並分離純化出二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物。
6.根據權利5所述二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物的製備方法，其特徵在於二異丙氧基磷醯化二肽的製備過程為將二異丙氧基磷醯化二肽甲酯溶於甲醇中，冰水浴冷卻下加入氫氧化鈉溶液，加入的二異丙氧基磷醯化二肽甲酯與氫氧化鈉的摩爾比為1∶1.25，室溫攪拌反應3-5小時，再分離純化得到二異丙氧基磷醯化二肽。
7.根據權利5所述二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物的製備方法，其特徵在於(2)的過程為在反應容器中加入3，4，5-三甲氧基苯胺、NMM和乾燥的四氫呋喃，攪拌下加入異丙氧基磷醯化二肽和HOBt，加入的3，4，5-三甲氧基苯胺與異丙氧基磷醯化二肽的摩爾比為1∶1.05，冰水浴下滴加DCC與乾燥的四氫呋喃的混合溶液，室溫反應過夜，再分離純化得到目的產物。
全文摘要
本發明屬於生物化學領域，提供二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物及其製備方法。本發明二異丙氧基磷醯化二肽三甲氧基苯醯胺化合物的結構式如上式，其中AA
文檔編號C07K1/00GK1789277SQ200510101669
公開日2006年6月21日 申請日期2005年11月18日 優先權日2005年11月18日
發明者蔣宇揚, 宇小青, 張楠, 劉峰, 蔡普欽, 周建宇, 莫卓華 申請人:清華大學深圳研究生院