蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法
2023-07-22 22:51:21 1
專利名稱：蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質類藥物的相關檢測，具體涉及一種蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法。
背景技術：
蛋白質的三維構像與它的生物活性密切相關，對於蛋白質藥物而言，它的三維構像在一定程度上決定了它在人體內的代謝速度和自身免疫性，而這是除去生物活性之外的重要的生物藥物指標。由於蛋白質類藥物三維構像的重要性，在生物製藥的研發和生產過程中有多種技術被用來檢測蛋白質類藥物的三維構像。比較通用的技術包括:(I)分子篩層析(Molecular Seive or Gel Filtration) ； (2)超速離心(Ultracentrifugation) ； (3)突光分析(Fluorescence) ； (4)蛋白質⑶光譜；(5)電泳分析(Electrophoresis)。但是以上所述的方法都有很大的局限性，主要表現在:(I)分析方法不夠精確:所得到的數據只能反映蛋白質的總體差別，不能區分在不同蛋白質表面的差異。(2)分析方法不夠快速:每一個樣品需要幾小時或者幾十小時。(3)分析方法一次只能分析一個或幾個樣品，不能將多個樣品同時並列分析。由於以上的限制，蛋白質三維構像的分析手段是藥物研發中相對薄弱。鑑於蛋白質三維構像在藥物研發和生產中的重要性，一種精確，快速，簡便的分析技術將會為蛋白質藥物的研發和生產提供重要的信息。通過蛋白質的多肽片段製備抗體是一種成熟的技術，在生物化學研究領域，這種技術被用來進行抗原點測定(Epitope mapping)。一般情況下,5_8個胺基酸就可以形成一個抗原點，而6-8個胺基酸所組成的專一'丨生順序在人體蛋白質組(Proteome)中是具有專一性的。由於多肽在動物體內降解迅速，多肽本身不宜於用來直接生產抗體，而是先共價結合到一個穩定的蛋白質載體上面。通常情況下牛白蛋白(BSA)或血藍蛋白(KLH)被廣泛用來作載體蛋白。化學合成的多肽在與載體蛋白共價結合後，可以在動物體內有較長時間的存活期使動物產生相應的抗多肽 的抗體。
發明內容
本發明的目的是提供一種蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，能夠從分子水平系統定量檢測蛋白質類藥物三維構像及其變化，並且測定準確，精度高。本發明所述的一種蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，包括以下步驟:(I)將選取的蛋白質藥物的胺基酸序列被用來設計相應的多肽抗原，該多肽抗原的胺基酸數量為15 50個；(2)多肽抗原通過聯接一個半胱氨酸與蛋白質載體共價結合，結合的方式是N末端或C末端；(3)多肽抗原與蛋白質載體共價結合後通過動物產生多肽抗體，其中，動物選自馬、羊、牛、兔子、雞或鼠中的一種；
(4)將多肽抗體採用雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法測定蛋白質類藥物三維構像。其中，步驟(I)中所設計的相鄰的兩個多肽抗原相鄰有重疊的胺基酸序列，重疊數目為I個 10個，更優選為5個。用重疊設計的目的是保證生產出的序列抗體可以全面的對蛋白質藥物的構像作出測定而不會有遺漏的區域。步驟(2)中多肽抗原與蛋白質載體共價結合的化學反應選用的交聯劑優選為二氯乙烷或甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物，最好為甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物；多肽抗原與蛋白質載體的當量比優選為10:1 50: 1，更優選20: I ;蛋白質載體優選為血藍蛋白或牛血清白蛋白，更優選血藍蛋白。步驟(3)中注射動物的抗原劑量優選為50微克/次/只 5毫克/次/只，更優選為I毫克/次/只。步驟(3)中動物優選用紐西蘭白兔。步驟(4)的具體步驟優選為:將雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒的平板分組用不同的多肽抗體包被，在經過牛血清白蛋白覆蓋後，需要測定的蛋白質藥物可以在不同濃度下與檢測盒平板孔中的多肽抗體相混合，當蛋白質藥物的表面有與孔中相應的多肽抗體所對應的抗原點，孔中的多肽抗體將與這部分蛋白質藥物形成複合物，在下一步，一種抗人體免疫球蛋白的多克隆抗體將填加到檢測盒的孔中，抗人體免疫球蛋白是經過生物素共價標記的，當孔中有多肽抗體與抗人體免疫球蛋白的複合體，抗人體免疫球蛋白將進一步與這個複合體形成更高一級的複合體，為多肽抗體-蛋白質藥物-抗人體免疫球蛋白複合體，此複合體可以進一步與酶聯親和素形成複合體，而這個複合體的數量可以用過氧化酶的底物的轉化反應出來，最後經分光光度計經光吸收測定蛋白質類藥物三維構像。其中，雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒優選採用24孔平板、96孔平板或384孔平板中的一種，更優選採用96孔平板。雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒被多肽抗體包被的溫度優選為4攝氏度或室溫，更優選為4攝氏度。本發明的優點在於:採用的多肽抗原設計方案優良，以此方案設計的多肽抗原可以有效地在動物體內產生高效價的專一性的抗體；多肽抗原與載體蛋白的共價結合方法，此方法可以使生產出的抗體更具有針對性，能夠檢測多種情況下的蛋白質構像變化。本發明精確度能夠達到分子水平的快速，對蛋白質三維構像能夠進行系統的分析，為蛋白質藥物的研發和生產提供重要的質量控制數據。
圖1為多肽抗體效價的測定結果；圖2為多肽抗體專一性的測定結果；圖3為雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法靈敏度的測定結果；圖4為市場上9種不同單克隆抗體藥物輕鏈部分的構像測定結果；圖5為同種抗體藥物不同實驗條件下的構像比較結果；圖6為市場 上同種抗體藥物不同生產批次間的構像分析結果(輕鏈)；圖7為市場上同種抗體藥物不同生產批次間的構像分析結果(重鏈)。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進一步說明。實施例1:以帕立珠(Synagis)生物藥為例，提供多肽設計的具體信息，具體見下表。表1:帕立珠多肽抗原設計的序列。
權利要求
1.一種蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)將選取的蛋白質藥物的胺基酸序列被用來設計相應的多肽抗原，該多肽抗原的胺基酸數量為15 50個； (2)多肽抗原通過聯接一個半胱氨酸與蛋白質載體共價結合，結合的方式是N末端或C末端; (3)多肽抗原與蛋白質載體共價結合後通過動物產生多肽抗體，其中，動物選自馬、羊、牛、兔子、雞或鼠中的一種； (4)將多肽抗體採用雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法測定蛋白質類藥物三維構像。
2.根據權利要求1所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於步驟(I)中所設計的相鄰的兩個多肽抗原有重疊的胺基酸序列，重疊數目為I個 10個，優選為5個。
3.根據權利要求1所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於步驟(2)中多肽抗原與蛋白質載體共價結合的化學反應選用的交聯劑為二氯乙烷或甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物，優選甲基丙烯酸甲酯-丁二烯-苯乙烯三元共聚物；多肽抗原與蛋白質載體的當量比為10:1 50: 1，優選20: I;蛋白質載體為血藍蛋白或牛血清白蛋白，優選血藍蛋白。
4.根據權利要求1所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於步驟⑶中注射動物的抗原劑量為50微克/次/只 5毫克/次/只，優選為I毫克/次/只。
5.根據權利要求1所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於步驟(3)中動物選用紐西蘭白兔。·
6.根據權利要求1所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於步驟(4)的具體步驟為:將雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒的平板分組用不同的多肽抗體包被，在經過牛血清白蛋白覆蓋後，需要測定的蛋白質藥物可以在不同濃度下與檢測盒孔中的多肽抗體相混合，當蛋白質藥物的表面有與孔中相應的多肽抗體所對應的抗原點，孔中的多肽抗體將與這部分蛋白質藥物形成複合物，在下一步，一種抗人體免疫球蛋白的多克隆抗體將填加到檢測盒的孔中，抗人體免疫球蛋白是經過生物素共價標記的，當孔中有多肽抗體與抗人體免疫球蛋白的複合體，抗人體免疫球蛋白將進一步與這個複合體形成更高一級的複合體，為多肽抗體-蛋白質藥物-抗人體免疫球蛋白複合體，此複合體可以進一步與酶聯親和素形成複合體，而這個複合體的數量可以用過氧化酶的底物的轉化反應出來，最後經分光光度計經光吸收測定蛋白質類藥物的三維構像。
7.根據權利要求6所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒採用24孔平板、96孔平板或384孔平板中的一種，優選採用96孔平板。
8.根據權利要求6所述的蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法檢測盒被多肽抗體包被的溫度為4攝氏度或室溫，優選為4攝氏度。
全文摘要
本發明涉及蛋白質類藥物的相關檢測，具體涉及一種蛋白質類藥物三維構像的抗體陣序列檢測方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將選取的蛋白質藥物的胺基酸序列被用來設計相應的多肽抗原；(2)多肽抗原通過聯接一個半胱氨酸與蛋白質載體共價結合；(3)多肽抗原與蛋白質載體共價結合後通過動物產生多肽抗體；(4)將多肽抗體採用雙抗夾心酶標記免疫吸附檢測法測定蛋白質類藥物的三維構像。本發明精確度能夠達到分子水平，能對蛋白質三維構像能夠進行快速系統的分析，為蛋白質藥物的研發和生產提供重要的質量控制數據。
文檔編號G01N33/68GK103235136SQ20121012961
公開日2013年8月7日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者王星 申請人:淄博高新區雲橋生物技術研究所