一種人PAPP-A和Free-β-HCG時間分辨螢光雙標的定量檢測試劑盒的製作方法

2023-07-23 06:55:01 3

一種人PAPP-A和Free-β-HCG時間分辨螢光雙標的定量檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明屬於醫學檢測【技術領域】。本發明公開了一種人PAPP-A和Free-β-HCG時間分辨螢光雙標的定量檢測試劑盒，其包括螢光定量檢測試紙條和示蹤探針，其特徵在於，所述螢光定量檢測試紙條為PVC薄板上依次搭接並粘貼濾紙、玻璃纖維素膜、劃有兩條檢測線和一條質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，組裝完畢後剪切成試紙條；所述檢測線，其中一檢測線為固定有Free-β-HCG一抗的T1線，另一檢測線為固化有PAPP-A一抗的T2線；所述質控線為固化有羊抗兔IgG的C線；所述示蹤探針為螢光納米微球標記兔抗PAPP-A抗體和兔抗Free-β-HCG抗體。本發明所述試劑盒可用於檢測人血清、血漿和全血等樣本中人PAPP-A和Free-β-HCG，定量限PAPP-A為0.1mg/L，檢測線性範圍0.1mg/L～10mg/L；Free-β-HCG定量檢測限位10ng/mL，樣品添加回收率在80%～120%以內，整個檢測過程僅需10min，實現了血清、血漿和全血等樣品中快速定量檢測。
【專利說明】—種人PAPP-A和Free- β -HCG時間分辨焚光雙標的定量檢
測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫學檢測【技術領域】，具體屬於人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)和游離人絨毛膜促性腺激素β亞基定量檢測領域。
【背景技術】
[0002]妊娠相關血漿蛋白一 Α(ΡΑΡΡ—Α)是一種大分子糖蛋白化合物，是由胎盤合體滋養層細胞、蛻膜細胞合成並分泌進入血循環，且隨孕周逐漸增多的母體血漿高分子糖蛋白。妊娠相關血漿蛋白PAPP-A分量為8000kD，為四個相同的亞單位組成的四聚體。是由兩個PAPP — A分子和兩分子嗜伊紅主要鹼性蛋白前體(hDMBP)組成的異構聚合體，其生物學功能尚不完全清楚。近年來，運用PAPP—A在孕早期染色體異常核型的篩查，高危妊娠的監護及妊娠滋養細胞疾病的診斷等方面取得了進展。
[0003]hCG是胎盤滋養層分泌的糖蛋白，β -hCG升高是多種胎兒染色體異常的特徵，常伴有胎兒自然流產。1987年Bogart最先報導了孕中期β-hCG變化與Dow n』 s症候群的發生有關。Hsu發現β -hCG≥2.5M時，Dow n’s症候群檢出率為40%。王曉雯等發現在孕中期，胎兒為Dow n』 s症候群的孕婦血清、血漿和全血等樣本中β-hCG水平高出正常值兩倍以上。
[0004]出生缺陷是我國圍產兒死亡的主要原因之一，如在妊娠早、中期篩查出異常胎兒並及時終止妊娠，能有效降低由出生缺陷所引起的圍產兒死亡。
[0005]目前，常用的血清、血漿和全血等樣本學免疫檢測方法主要有以下3種:
[0006]1、放射免疫檢測:該方法靈敏度高、特異性強，在醫學及其他生物學科的研究領域中應用廣泛。近年來，有學者研究了針對自身抗原的液相放射免疫，結果表明檢測特異性有所提高。但由於本方法假陽性率較高且存在對人體的放射性損傷等因素現已較少應用。
[0007]2、化學發光免疫檢測:是一種將發光分析和免疫反應結合起來的測定技術。主要有化學發光酶免疫技術、化學發光標記免疫技術和電化學發光免疫技術。化學發光免疫測定法有較高的敏感性與特異性，且本底低，是一個較為活躍的研究領域。近期有研究表明，應用化學發光法檢測應將被測血清做100倍稀釋才能避免鉤狀效應的產生，得到更準確的結果。該法具有高敏感性和高特異性。測定範圍寬、試劑穩定、無毒害、無汙染、操作簡單、耗時短等優點但因其價格昂貴，在國內應用較少。
[0008]3、酶聯免疫檢測:是一種敏感的技術，可以在微克乃至納克水平對所測物質進行定量檢測，具有快速、敏感、簡便、易於標準化、投入低、基層實驗室也可開展等優點。但也存在固有缺陷，主要表現為:其一，傳統包被模式，抗體分子有效利用率降低，不僅浪費抗體增加試驗成本，且無效抗體分子佔用固相表面的有限面積，導致抗體包被量不足影響檢測的敏感度和檢測範圍；其二，抗體分子包被量受固相表面積限制，包被抗體量相對不足，導致不能形成雙抗體夾心複合物，抗原分子只與酶結合抗體反應，此時雖然待測抗原含量很高，沒產生較高的檢測信號。
【發明內容】

[0009]本發明要解決的技術問題在於提供一種人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)和游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-β-HCG)螢光定量檢測試紙條及其製備方法。採用螢光定量配體受體分析方法和免疫層析分析方法製備成本發明的螢光定量檢測試紙條，它可對人血清、血漿和全血等樣本中人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)和游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-β-HCG)進行快速定量檢測，整個檢測時間僅需lOmin，完全滿足孕早期血清、血漿和全血等樣本中人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)和游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-^-HCG)的大規模篩查檢測。
[0010]一種人PAPP-A和Free- β -HCG時間分辨螢光雙標的定量檢測試劑盒，其包括螢光定量檢測試紙條和示蹤探針；
[0011]所述的螢光定量檢測試紙條，採用以下方法組裝而成:在PVC薄板上依次搭接並粘貼濾紙、玻璃纖維素膜、劃有兩條檢測線和一條質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，組裝完畢後剪切成試紙條，即得本發明的時間分辨螢光雙標定量檢測試紙條。
[0012]該試紙條的示蹤物採用時間分辨螢光納米微球進行標記，並用西林瓶凍幹之後單獨保存。
[0013]所述檢測線Tl、檢測線Τ2及質控線C相隔均為0.5cm距離。
[0014]所述突光納米微球標記示蹤物為相關蛋白A (PAPP-A) 二抗、Free-β-HCG 二抗及羊抗兔二抗； [0015]優選的，所述納米微球粒徑範圍為100_300nm ;
[0016]所述螢光納米微球的螢光發光物為銪、釤、鋱、鏑等稀有元素；優選的，粒徑範圍為150_250nm。
[0017]所述螢光納米微球表面電荷為50-250 μ eq/g ；
[0018]所述螢光納米微球羧基密度為為25-35.7sq.A/grp。
[0019]本發明的的螢光定量檢測試紙條可用於檢測血清、血漿和全血等樣本中人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)和游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-13-HCG)，定量限人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)為0.3IU/mL，檢測線性範圍0.3IU/mL~20IU/M1:游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-β -HCG)定量檢測限位0.5mIU/ml，樣品添加回收率在80%~120%以內，整個檢測過程僅需lOmin，實現了血清、血漿和全血等樣本樣品中快速定量檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本發明的定量螢光定量試紙條的結構示意圖。
[0021]其中，圖1中的標號說明如下:(1)為PVC薄板，(2)為濾紙，(3)為玻璃纖維素膜，
(4)為硝酸纖維素膜，(5)為Free-P-HCG檢測線，(6)為人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)檢測線，(7)為質控線，(8)為吸水紙，(9)為西林瓶，(10)為螢光納米微球示蹤物
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發明作進一步的闡述，應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
[0023]實施例1
[0024]螢光微球標記的人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-^-HCG) 二抗及羊抗兔二抗IgG的製備
[0025]I)螢光微球的活化
[0026]取純化後的螢光微球20mg溶於0.01M pH4.8的硼酸緩衝液中，超聲波處理30秒後調節螢光微球濃度為5.0X IO12~1.0X IO13個/mL，磁力攪拌下緩慢加入lmL100mg/mL的碳二亞胺(EDC)和200ull00mg/mL的氮羥基琥珀醯亞胺(NHS)室溫勻速攪拌溫育30min後，10000-150000g離心15分鐘，收集沉澱，用0.01M pH4.8的硼酸緩衝液反覆洗滌離心3次即得活化的的螢光微球。
[0027]2)螢光素微球標記的人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)抗體、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-β -HCG)抗體及羊抗兔IgG的製備
[0028]將活化的螢光微球溶於0.01M pH7.4的磷酸緩衝液中，超聲波處理30min後調節螢光微球的濃度為1.0 X IO13~5.0 X IO13個/mL，加入50 μ g人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)抗體或游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-13-HCG)抗體或羊抗兔IgG，4°C勻速攪拌反應12h後，10000-15000g離心15分鐘，收集沉澱，復溶於含1.5% (m/v)海藻糖、2% (m/v)牛血清白蛋白、0.05% (v/v)的吐溫-20的0.01M pH7.4的磷酸緩衝液中，即得螢光微球標記的人妊娠相關蛋白A (PAPP-A)抗體、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基(Free-β-HCG)抗體及羊抗兔二抗IgG，置於4°C保存備用。
[0029]實施例2
[0030]螢光納米微球探針的凍幹
[0031]將實施例1中所製備的螢光探針分別用凍幹稀釋液(含4%蔗糖、2%牛血清白蛋白、1%甘露醇的0.05M pH7.4的PBPS緩衝液)稀釋200倍和300倍，然後按1:1 (v/v)混合均勻，再150 μ L每孔分裝於Iml西林瓶中，採用冷凍真空乾燥方式將其乾燥(凍幹工藝見表I )，然後用矽膠塞壓塞，鋁箔蓋鎖蓋密封保存。
[0032]表1凍幹曲線
[0033]
【權利要求】
1.一種人PAPP-A和Free-β -HCG時間分辨螢光雙標的定量檢測試劑盒，其包括螢光定量檢測試紙條和示蹤探針，其特徵在於，所述螢光定量檢測試紙條為PVC薄板上依次搭接並粘貼濾紙、玻璃纖維素膜、劃有兩條檢測線和一條質控線的硝酸纖維素膜、吸水紙，組裝完畢後剪切成試紙條；所述檢測線，其中一檢測線為固定有Free-P-HCG—抗的Tl線，另一檢測線為固化有PAPP-A—抗的T2線；所述質控線為固化有羊抗兔IgG的C線；所述示蹤探針為螢光納米微球標記兔抗PAPP-A抗體和兔抗Free- β -HCG。
2.根據權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述示蹤探針為凍乾粉。
3.根據權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述檢測線Tl、檢測線T2及質控線C相隔均為0.5cm距離。
4.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，檢測線和質控線相互平行，其中檢測線靠近濾紙、玻璃纖維素膜端，質控線靠近吸水紙端。
5.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，硝酸纖維素膜上的檢測線Tl線包被Free- β -HCG 一抗、Τ2線包被PAPP-A —抗和質控線C線包被羊抗兔IgG。
6.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述螢光納米微球的粒徑範圍為100_300nmo
7.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述螢光發光物為銪、釤、鋱、或鏑稀有元素。
8.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，所述螢光納米微球表面電荷為50-250 μeq/g。
9.如權利要求1所述定量檢測試劑盒，其特徵在於，羧基密度為25-35.7sq.A/grp。
【文檔編號】G01N33/76GK103760369SQ201310161196
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年5月3日 優先權日:2013年5月3日
【發明者】莊捷, 徐秀, 肖理文 申請人:上海溯源生物技術有限公司