燈盞細辛內生真菌的製作方法
2023-07-12 01:24:21 1
專利名稱：燈盞細辛內生真菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種經發酵能夠產生抗腫瘤及具有治療人類心腦血管疾病藥用成份的微生物。
燈盞細辛為菊科植物短葶飛蓬的全草。傳統醫學認為它有散寒解表、止痛舒絡、活血治癱瘓的功效。臨床用於治療腦血栓形成、腦栓塞、多發性神經炎、慢性蛛網膜炎等腦血管意外所致的癱瘓，效果十分顯著，主要藥用成分為燈盞花乙素。目前由於燈盞花素的來源主要是從植物中提取獲得，而以其它方式的獲得途徑尚有待於研究。
本發明的目的是提供一種經發酵能夠產生抗腫瘤及具有治療人類心腦血管疾病藥用成份的微生物——燈盞細辛內生真菌。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌命名為交鏈孢黴(Alternaria sp.)，保藏登記號為CCTCC NOM201028。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌是從短葶飛蓬[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz]菊科植物活體中採用內生真菌微生物分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定為交鏈孢黴Alternaris sp.，該菌株已在國家知識產權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期2001年7月27日，保藏登記號為CCTCC NOM201028。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌的固體培養特徵為一、PDA培養基28℃培養4天，菌落直徑47mm，7天75mm，11天90mm。菌落鋪展較疏鬆，灰黑色絮狀，邊緣整齊，背面黑色；二、麥芽法培養基28℃培養4天，菌落直徑45mm，7天75mm，11天90mm。菌落隆起較疏鬆，邊緣整齊，黃灰褐色絨絮狀，背面黑色；三、察貝克培養基28℃培養4天，菌落直徑33mm，7天70mm，11天mm 90mm。菌落疏鬆扁平，黃褐色長絨狀，邊緣整齊，背面肉褐色。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌的液體培養特徵為
一、培養基PDA，搖瓶培養時間5天，培養溫度28℃±2℃；二、發酵培養特徵培養第1天，菌種有零星的自色菌絲點；培養第2天，長滿白色菌絲；培養第3天，發酵液菌絲體密集，菌絲體呈淡褐色；培養第4天，長滿深黑褐色菌絲體，發酵液粘稠，培養第5天，發酵液菌絲體密集成塊狀，黑褐色菌絲體。
形態特徵一、無性世代，菌絲橄欖褐色有隔，分生孢子梗分化明顯，分枝淡褐色，分生孢子聚為分枝的鏈，倒梨形或卵形，縱橫分隔，具短喙，淡褐至金黃褐色，光滑，孢子直徑10.0～13.75×25.0～43.75微米。
二、有性世代，未發現。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌菌株18SRNA鹼基組成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN本發明所述的燈盞細辛內生真菌，經發酵可獲得異香豆素化合物及黃酮類化合物，其工藝步驟為菌種→試管斜面→種子培養→發酵培養→發酵物提取→分離化合物→有效成分。
其中，發酵原料為馬鈴薯培養基(PDA)，發酵方式為液態發酵；菌種斜面試管斜面菌種培養採用馬鈴薯葡萄糖固體培養基(固體PDA)；種子培養為馬鈴薯葡萄糖培養基(液體PDA)；發酵培養基為馬鈴薯葡萄糖液體培養基(液體PDA)，PH自然，培養時間試管斜面菌種活化培養96小時，種子搖床培養時間72小時，發酵培養時間5天，培養溫度試管斜面菌種培養溫度28℃±1℃種子搖床培養28℃±1℃溫度，發酵培養溫度為28℃±2℃；發酵物提取發酵完畢，收集發酵液，按常規化學提取方法，採用95％乙醇4分級提取黃酮類化合物，採用三氯甲烷、丙酮溶系統提取異香素類化合物；分離化合物採用矽膠柱層析方法分離純化獲得燈盞花乙素；採用葡聚糖凝膠柱層析方法分離純化獲得異香豆素類化合物。
本發明所述的燈盞細辛內生真菌，該菌株最顯著的特徵是該菌株液體發酵能夠產生抗心血管疾病的臨床有效成分燈盞花乙素及黃酮類化合物，能夠產生抗腫瘤的藥用成分異香豆素化合物，如鏈格孢菌素(Alternariol)、鏈格孢醇甲基醚(Alternariol Monomethyl Ether)等，是尋找具有抗腫瘤和治療人類心腦血管疾病藥用成份生物資源的重要微生物。
圖1為本發明所述的燈盞細辛內生真菌菌絲體用400倍顯微鏡觀察到的形態圖。
圖2為本發明所述的燈盞細辛內生真菌分生孢子用400倍顯微鏡觀察到的形態圖。
圖3為本發明所述的燈盞細辛內生真菌菌株細微結構圖(菌絲體電子顯微鏡圖片，放大倍數33000倍)。
圖4為本發明所述的燈盞細辛內生真菌菌株細微結構圖(電子顯微鏡圖片，放大倍數16000倍)。
實施例取編號為YM31961菌種，在無菌條件下(無菌室或超淨工作檯)，用接種針挑取少許菌種，轉接於已滅菌的固體PDA培養基試管(18×180mm)中，置培養箱內28℃±1℃活化培養96小時。
取出活化96小時的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子液體PDA培養基中，在28℃±1℃下搖床培養72小時，即為YM31961種子。
發酵採用500毫升玻璃三角瓶，裝入配製好的液體PDA培養基100毫升，15磅滅菌30分鐘後，取出待冷卻至30℃在無菌條件下，取YM31961種子，接種子裝有100毫升液體PDA培養基的500毫升玻璃三角瓶中，種子接種量為5～10％(28℃±2℃轉到通氣培養5天。在發酵期間，注意發酵室溫度變化，檢查有無染菌現象。
發酵完畢，收集發酵物，裝入一定體積的容器內，按常規化學分離提取方法，採用95％乙醇分級萃取黃酮類化合物，矽膠柱層析方法分離純化可得到燈盞花乙素。採用三氯甲烷、丙酮溶劑系統提取異香豆素類化合物，葡聚糖凝膠柱層析方法分離純化可得到鏈格孢菌素及鏈格孢醇甲基醚。
權利要求
1.一種燈盞細辛內生真菌，其特徵在於命名為交鏈孢黴(Alternaria sp.)，其保藏登記號為CCTCC NOM201028。
2.根據權利要求1所述的一種燈盞細辛內生真菌，其特徵在於所述的固體培養特徵為一、PDA培養基28℃培養4天，菌落直徑47mm，7天75mm，11天90mm。菌落鋪展較疏鬆，灰黑色絮狀，邊緣整齊，背面黑色；二、麥芽法培養基28℃培養4天，菌落直徑45mm，7天75mm，11天90mm。菌落隆起較疏鬆，邊緣整齊，黃灰褐色絨絮狀，背面黑色；三、察貝克培養基28℃培養4天，菌落直徑33mm，7天70mm，11天mm 90mm。菌落疏鬆扁平，黃褐色長絨狀，邊緣整齊，背面肉褐色。
3.根據權利要求1所述的一種燈盞細辛內生真菌，其特徵在於所述的的液體培養特徵為一、培養基PDA，搖瓶培養時間5天，培養溫度28℃±2℃；二、發酵培養特徵培養第1天，菌種有零星的白色菌絲點；培養第2天，長滿白色菌絲；培養第3天，發酵液菌絲體密集，菌絲體呈淡褐色；培養第4天，長滿深黑褐色菌絲體，發酵液粘稠，培養第5天，發酵液菌絲體密集成塊狀，黑褐色菌絲體。
4.根據權利要求1所述的一種燈盞細辛內生真菌，其特徵在於所述的形態特徵一、無性世代，菌絲橄欖褐色有隔，分生孢子梗分化明顯，分枝淡褐色，分生孢子聚為分枝的鏈，倒梨形或卵形，縱橫分隔，具短喙，淡褐至金黃褐色，光滑，孢子直徑10.0～13.75×25.0～43.75微米。二、有性世代，未發現。
5.根據權利要求1所述的一種燈盞細辛內生真菌，其特徵在於年述的菌株18SRNA鹼基組成系列CTAAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACCGGGAAANCTGCGAATGGCTCATTAATCAGTTATCGTTTATTGGATAGTACCTTACTNACTNGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAACCCCAANCTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTNTCTTGGTGATTCATGATAACTTCACGGATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGANCGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAAGGTATTGGCNTTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGNGGAGCCTGAGAAACGGTTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAANTTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGNCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTCCAATTTAAACCTCTTAACGANN
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，本發明所述的燈盞細辛內生真菌是從短葶飛蓬菊科植物活體中採用內生真菌微生物分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑑定為交鏈孢黴，該菌株已在國家知識產權局專利局指定的保藏單位保藏，保藏日期2001年7月27日，保藏登記號為CCTCC NOM201028。本發明最顯著的特徵是該菌株液體發酵能夠產生抗心血管疾病的臨床有效成分燈盞花乙素及黃酮類化合物，能夠產生抗腫瘤的藥用成分異香豆素化合物，是尋找具有抗腫瘤和治療人類心腦血管疾病藥用成份生物資源的重要微生物。
文檔編號C12N1/14GK1421522SQ0113997
公開日2003年6月4日 申請日期2001年11月22日 優先權日2001年11月22日
發明者陳有為, 楊麗源, 李紹蘭, 李治瀅, 周斌, 張琦 申請人:雲南省微生物研究所