一種幹細胞製劑及其製備方法和應用與流程
2023-07-12 15:01:36
本發明涉及再生醫學和生物學
技術領域：
，特別涉及一種幹細胞製劑及其製備方法和應用。
背景技術：
：骨壞死是指人體骨骼活組織成份壞死。中國醫學把骨壞死稱之為骨蝕症。而對於骨壞死，人體在任何部位都有可能發生，僅就缺血性壞死已經發現40餘處，而股骨頭壞死發生率最高，這主要由生物力學和解剖學方面的特點來決定的。股骨頭壞死的病因不盡相同，由於缺乏縱向比較研究以及理想的動物模型，其確切的發病機制尚未得到統一定論，目前的研究主要集中於股骨頭的血管微循環和微血管缺血方面，儘管股骨頭壞死的病因存在很大的差異，但都有一個共同的基本病理變化：股骨頭血供減少或者中斷導致骨細胞壞死，隨後壞死區出現修復反應，壞死與修復的過程交織進行，壞死的終末期可出現股骨頭負重區關節面塌陷以及繼發性骨性關節炎的產生。全能幹細胞具有以下特點：可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，同時還能表達多種基因，分泌多種成骨活性因子，為爬行替代、骨折癒合創造了有利條件，已在體外研究及體內骨與軟組織損傷修複方面顯示出良好的應用前景。同時動物實驗已證實全身或局部注入全能幹細胞或間充質幹細胞很少發生移植排斥反應，對於治療骨壞死具有一定的療效。目前，治療骨壞死的種子細胞主要為自體骨髓間充質幹細胞和臍帶間充質幹細胞，但兩者均為成體幹細胞類型，已經具有一定的分化程度，在體外進行擴增培養時，這兩種成體幹細胞很容易出現分化現象，導致治療效果較差，因此骨髓間充質幹細胞和臍帶間充質幹細胞對於治療骨壞死具有一定的局限性，需要研發一種新型的能夠有效治療骨壞死的幹細胞製劑。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供了一種幹細胞製劑及其製備方法和應用。該幹細胞製劑採用胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞聯合治療骨壞死，可有效促進骨壞死的癒合，顯著提高新生骨的生長，其治療效果顯著好於單純採用胚胎幹細胞或骨髓單個核細胞的治療效果。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種幹細胞製劑，包括胚胎幹細胞、骨髓單個核細胞、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)和溶媒。本發明採用胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞聯合治療骨壞死，替代骨髓幹細胞或臍帶幹細胞作為修復骨損傷的主要細胞。胚胎幹細胞保持著幹細胞最為原始的分化潛能，並未出現細胞衰退凋亡現象，狀態優良，且來源豐富，在體外分化能力強，治療效果顯著。此外，添加了骨髓單個核細胞，兩者聯合使用。研究顯示胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞聯合治療，可有效促進骨壞死的癒合，顯著提高新生骨的生長，其治療效果顯著好於單純採用胚胎幹細胞或骨髓單個核細胞的治療效果。在骨頭修復過程中需要多種生長因子的參與，而此時內源性生長因子往往難以滿足需要，故外源性生長因子在骨頭壞死的治療中正逐漸受到重視。在骨頭壞死的治療過程中，採用一定的方法適時適量地引入特定的生長因子，有助於骨頭缺損的修復與重建，這些特定的生長因子主要分為促血管內皮細胞生長因子和調控骨、軟骨細胞增殖分化因子。在本發明中，幹細胞製劑中添加了單核細胞趨化因子-1，利於胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞形成骨組織。作為優選，每1mL幹細胞製劑中各組分的用量為：胚胎幹細胞：(1～10)×106個；骨髓單個核細胞：(1～10)×106個；單核細胞趨化因子-1：1～20ng；溶媒：補足。優選地，每1mL幹細胞製劑中各組分的用量為：胚胎幹細胞：(1～5)×106個；骨髓單個核細胞：(1～5)×106個；單核細胞趨化因子-1：10ng；溶媒：補足。在本發明提供的實施例中，每1mL幹細胞製劑中各組分的用量為：胚胎幹細胞：(1～2.5)×106個；骨髓單個核細胞：(1～2.5)×106個；單核細胞趨化因子-1：10ng；溶媒：補足。在本發明提供的實施例中，溶媒為生理鹽水。製劑中選用生理鹽水作為溶劑，其與人體組織的滲透壓一致，不會對骨組織產生損傷。但溶媒的種類並非限定於此，本領域技術人員認可的溶媒均在本發明的保護範圍之內。作為優選，幹細胞製劑的保存溫度≤4℃。低溫保存製劑，一方面可避免MCP-1失活，另一方面則很好的保持了幹細胞的生物活性，提高治療效果。作為優選，幹細胞製劑的劑型為注射劑。本發明還提供了該幹細胞製劑在製備治療骨壞死藥物中的應用。在本發明提供的實施例中，骨壞死為股骨頭壞死。本發明還提供了該幹細胞製劑的製備方法，包括：將單核細胞趨化因子-1溶於溶媒中，得到單核細胞趨化因子-1溶液，採用單核細胞趨化因子-1溶液重懸胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞，製得幹細胞製劑。本發明提供了一種幹細胞製劑及其製備方法和應用。該幹細胞製劑包括胚胎幹細胞、骨髓單個核細胞、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)和溶媒。本發明至少具有如下優勢之一：1、本發明採用胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞聯合治療骨壞死，可有效促進骨壞死的癒合，顯著提高新生骨的生長，其治療效果顯著好於單純採用胚胎幹細胞或骨髓單個核細胞的治療效果；2、在本發明中，幹細胞製劑中添加了單核細胞趨化因子-1，利於胚胎幹細胞和骨髓單個核細胞形成骨組織，可提高療效；3、本發明提供的幹細胞製劑製備時間短，製備效率高，適合工業化生產。具體實施方式本發明公開了一種幹細胞製劑及其製備方法和應用，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。術語解釋：骨髓單個核細胞是指骨髓中的細胞核為單個的總稱，包括了造血幹細胞(HSC)、MSCs、內皮祖細胞(EPC)和基質細胞等，是含有多種細胞成分的混合細胞群。單核細胞趨化因子-1(MCP-1)是最早發現並被廣泛研究的CC類趨化因子家族的成員之一，它對單核細胞、天然殺傷細胞、T淋巴細胞、嗜鹼性細胞和樹突狀細胞有趨化作用。在本發明提供的實施例中，骨髓單個核細胞的分離純化方法參考文獻為：孫林，周旭，章體玲.骨髓單個核細胞的提取、分離、標記和體外培養.中國心血管病研究[J],2008,6(8):777-779。本發明提供的幹細胞製劑及其製備方法和應用中所用生物材料、試劑或儀器均可由市場購得。其中胚胎幹細胞購買於中國科學院。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1幹細胞製劑的製備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個核細胞和胚胎幹細胞，骨髓單個核細胞的終濃度為5.0×105個/mL，胚胎幹細胞的終濃度為5.0×105個/mL。③把製劑均分至1-2個注射器中。④製劑保存運輸：把製劑放入到無菌的空盒裡，把裝有製劑的空盒轉移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進行運輸。⑤細胞及製劑質量評價A、細胞質量評價(形態、活力、表面抗原)：表1製劑中的細胞的活率項目實施例1實施例2實施例3實施例4存活率(％)97.8996.4798.7699.43骨髓單個核細胞是一群細胞，是由多種類型的細胞組合而成，故不能通過表面抗原進行檢測，按照文獻報導的方法，即可獲取骨髓單個核細胞。B、製劑質量評價(細菌、真菌、內毒素、五類病毒)：表2製劑製成後檢測結果註：由於胚胎幹細胞購買於中科院，其質量不需要再做檢測。實施例2幹細胞製劑的製備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個核細胞和胚胎幹細胞，骨髓單個核細胞的終濃度為1.0×106個/mL，胚胎幹細胞的終濃度為2.5×106個/mL。③把製劑均分至1-2個注射器中。④製劑保存運輸：把製劑放入到無菌的空盒裡，把裝有製劑的空盒轉移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進行運輸。⑤細胞及製劑質量評價：試驗結果與實施例1近似。實施例3幹細胞製劑的製備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個核細胞和胚胎幹細胞，骨髓單個核細胞的終濃度為2.5×106個/mL，胚胎幹細胞的終濃度為1.0×106個/mL。③把製劑均分至1-2個注射器中。④製劑保存運輸：把製劑放入到無菌的空盒裡，把裝有製劑的空盒轉移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進行運輸。⑤細胞及製劑質量評價：試驗結果與實施例1近似。實施例4幹細胞製劑的製備①用生理鹽水溶解MCP-1(單核細胞趨化因子-1)，MCP-1終濃度為10ng/mL。②用含有MCP-1的生理鹽水重懸骨髓單個核細胞和胚胎幹細胞，骨髓單個核細胞的終濃度為5.0×106個/mL，胚胎幹細胞的終濃度為5.0×106個/mL。③把製劑均分至1-2個注射器中。④製劑保存運輸：把製劑放入到無菌的空盒裡，把裝有製劑的空盒轉移至已放有冰袋的保存箱中，低溫(0～4℃)進行運輸。⑤細胞及製劑質量評價：試驗結果與實施例1近似。實施例5動物實驗1、動物造模：取30隻紐西蘭大白兔，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(30mg/kg)，取髖關節前外側切口，顯露股骨頭及股骨頸前上部，行LightBμLb手術。在股骨頸軟骨與骨交界處，以3.5mm電鑽頭向股骨頭前內側鑽孔，深約4.0mm。刮匙向內側潛行刮除部分股骨頭松質骨至軟骨下骨，約佔股骨頭總體積的50％～60％，模擬骨壞死行病灶清理術，幹紗布保護股骨頭以外組織，用沾有液氮的棉球即刻填塞於缺損區冷凍，連續冷凍25次，每次約8s，共持續約3min，使骨細胞和骨髓細胞壞死，生理鹽水復溫，製備ANFH動物模型。2、股骨頭壞死(ANFH)動物模型修複方法：試驗分組：對照組：單純生理鹽水復溫後即刻縫合切口；實施例1組：吸取50μL實施例1的幹細胞製劑植入缺損區，使用骨蠟封閉骨孔，縫合切口；實施例2組：吸取50μL實施例2的幹細胞製劑植入缺損區，使用骨蠟封閉骨孔。實施例3組：吸取50μL實施例3的幹細胞製劑植入缺損區，使用骨蠟封閉骨孔。實施例4組：吸取50μL實施例4的幹細胞製劑植入缺損區，使用骨蠟封閉骨孔。各組縫合切口，術後連續3天臀大肌注入硫酸慶大黴素注射液，2ml/只，每日一次。3、評價方法：a、影像學觀察(X線評分)術後2、4、8周，實驗動物使用3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉(30mg/kg)後取仰臥位，攝髖關節正位X線片，觀察髖關節和骨缺損灶骨密度變化，並行Lane-SandhuX線評分評價成骨情況。b、組織學檢測(不同時間點新生骨面積百分比)4、X線評價比較結果表3：各組術後不同時間點X線評分比較組別製劑只數2周4周8周對照組生理鹽水30.34±0.161.05±0.041.48±0.03實施例1組實施例1製劑30.46±0.191.24±0.551.64±0.49實施例2組實施例2製劑31.75±0.42*2.28±0.37*3.81±0.56*實施例3組實施例3製劑31.89±0.37*2.33±0.51*3.96±0.43*實施例4組實施例4製劑32.59±0.27*4.57±0.16*6.47±0.38**表示與對照組相比，P0.05。實施例2～4組成骨明顯優於對照組1和實施例1組，差異有統計學意義(P<0.01)，且實施例4成骨優於實施例2、3組，差異有統計學意義(P<0.05)。實施例6動物實驗(對比實驗)本實施例動物造模、修複方法及評價方法同實施例5，各組製劑組成如下：表4：本實施例中所用製劑組別具體組成對照組1生理鹽水對照組23.5×106/mL骨髓單個核細胞+10ng/mLMCP-1對照組33.5×106/mL胚胎幹細胞+10ng/mLMCP-1實施例21.0×106/mL胚胎幹細胞+2.5×106/mL骨髓單個核細胞+10ng/mLMCP-1實施例32.5×106/mL胚胎幹細胞+1.0×106/mL骨髓單個核細胞+10ng/mLMCP-11、X線評價結果如下：表5：各組術後不同時間點X線評分比較組別只數2周4周8周對照組160.29±0.160.89±0.351.27±0.51對照組261.24±0.19*1.67±0.26*1.98±0.33*對照組361.38±0.17*1.85±0.19*2.24±0.28*實施例2組61.75±0.13#2.28±0.17#3.81±0.16#實施例3組61.80±0.20#2.32±0.28#3.96±0.23#*表示與對照組1相比，P<0.05，具有統計學意義；#表示與對照組2、3相比，P<0.01，具有極顯著的統計學意義。Lane-SandhuX線評分顯示：術後2、4、8周，對照組2、3與對照組1對比，差異有統計學意義(P<0.05)；且實施例2、3與對照組1對比，差異具有極顯著的統計學意義(P<0.05)。實施例2、3與對照組2、3對比，差異均具有極顯著的統計學意義(P<0.05)，表明胚胎幹細胞與骨髓單個核細胞組合使用後能夠產生更好的治療效果。2、新生骨面積百分比表6：各組術後不同時間點新生骨面積百分比比較組別只數2周4周8周對照組166.7±1.717.5±2.424.8±3.6對照組2612.6±2.1*26.7±2.1*45.0±4.1*對照組3614.2±1.8*28.9±2.5*54.6±5.4*實施例2組618.4±1.3#42.5±3.4#72.6±3.2#實施例3組619.3±1.8#44.1±2.9#74.5±3.7#*表示與對照組1相比，P<0.05，具有統計學意義；#表示與對照組2、3相比，P<0.01，具有極顯著的統計學意義。新生骨面積百分比檢測結果顯示：術後2、4、8周，對照組2、3與對照組1對比，差異有統計學意義(P<0.05)；且實施例2、3與對照組1對比，差異具有極顯著的統計學意義(P<0.05)。實施例2、3與對照組2、3對比，差異均具有極顯著的統計學意義(P<0.05)，表明胚胎幹細胞與骨髓單個核細胞組合使用後能夠產生更好的治療效果。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3