一種獲取植物韌皮部的方法
2023-08-07 05:02:46 1
一種獲取植物韌皮部的方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲取植物韌皮部的方法。本發明公開一種獲取植物韌皮部的方法,是將含有韌皮部的植物組織的石蠟切片用雷射顯微切割方法獲取其中的韌皮部。本發明通過石蠟切片和雷射顯微切割技術(Laser Capture Microdissection,LCM)相結合,成功的分離到番茄的純的韌皮部組織。本發明公開的方法相比於前人的韌皮部細胞獲得方法定位更加精確,細胞同質性較高,為進一步研究韌皮部的分子生物學及基因組學研究奠定基礎。
【專利說明】_種獲取植物韌皮部的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種獲取植物韌皮部的方法,屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 植物韌皮部篩分子中存在各類RNA分子,作為植物新的信號調控模式能夠通過韌 皮部進行長距離運輸,這是植物界一個突破性的發現。韌皮部作為維管植物的運輸組織, 主要負責將光合作用的產物,由進行光合作用的源器官(source)運輸到其他部位,即庫 (sink)部位。前人的研宄已證明韌皮部存在上千種RNA,但是只有一小部分被驗證其功能, 對於有些RNA能長距離運輸的調控機制還尚不明確,利用細胞學和分子生物學的方法研宄 韌皮部的物質運輸及基因表達與調控是科學家近年來努力解決的科學問題。
[0003] 番茄是一年生草本植物,莖中韌皮部較少。隨著生長發育逐步出現次生生長,木質 化程度增大,細胞和分子生物學的研宄難度也增大。傳統的細胞和分子生物學研宄的韌皮 部取材往往分析數量較多的幾類細胞的綜合值,難將番茄韌皮部完整而清晰分離,科學家 對番茄韌皮部的研宄還相當有限。如何提高取材部位的準確性,是研宄番茄韌皮部分子機 理的關鍵所在。
[0004] 隨著顯微操作術的發展,最初應用於醫學的雷射顯微切割技術(Laser Capture Microdissection,LCM)被應用於植物學領域的研宄,植物細胞與動物細胞相比有很大的差 異,具有細胞壁和液泡,尤其是雙子葉植物有次生生長特徵,存在細胞壁的次生加厚生長, 更加增加了組織樣品製備的難度。
[0005] 雷射顯微切割技術能夠快速準確地將目標細胞或細胞群從活體植物組織中分離 出來,用於後續的研宄或進一步的活體培養。因此應用該技術往往是深入研宄工作的重要 基礎。另外,雷射顯微切割技術與各種細胞和分子生物學研宄方法的結合,使得我們對植物 的生長發育過程中細胞功能和分化研宄更加準確易行。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種獲取植物韌皮部的方法。
[0007] 本發明提供一種獲取植物韌皮部的方法,是將含有韌皮部的植物組織的石蠟切片 用雷射顯微切割方法獲取其中的韌皮部;
[0008] 所述雷射顯微切割方法具體按照ArcturusXT雷射捕獲顯微切割儀說明書進行操 作;
[0009] 所述ArcturusXT雷射捕獲顯微切割儀購自Life technologies公司,產品型號為 ArcturuSa1"' Laser Capture Microdissection Systems。
[0010] 上述方法中,所述石蠟切片在所述用雷射顯微切割方法獲取其中的韌皮部之前還 包含將所述石蠟切片進行烘乾、脫蠟、脫水和晾乾的步驟。
[0011] 上述任一所述的方法中,所述烘乾的條件為在DEPC水上37°C -45°c烘乾,具體為 37°C烘乾。
[0012] 上述任一所述的方法中,所述脫蠟為二甲苯脫蠟;
[0013] 所述脫蠟的方法具體為二甲苯脫蠟兩次,每次lOmin。
[0014] 上述任一所述的方法中,所述脫水為100%的乙醇脫水;
[0015] 所述脫水的方法具體為100%的乙醇脫水兩次,每次lOmin。
[0016] 上述任一所述的方法中,所述石蠟切片的厚度為8-10 μ m。
[0017] 上述任一所述的方法中,所述韌皮部為所述植物的莖的韌皮部。
[0018] 上述任一所述的方法中,所述植物為番茄。
[0019] 本發明通過石賭切片和雷射顯微切割技術(Laser Capture Microdissection, LCM)相結合,成功的分離到番前的純的韌皮部組織。本發明提供的方法 相比於前人的韌皮部細胞獲得方法定位更加精確,細胞同質性較高,為進一步研宄韌皮部 的分子生物學及基因組學研宄奠定基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為材料的取樣部位。
[0021] 圖2為固定液的配製。
[0022] 圖3為冰上抽真空。
[0023] 圖4為搖晃低溫固定過夜。
[0024] 圖5為石蠟浸透過程。
[0025] 圖6為樣品包埋。
[0026] 圖7為冷凍切片下番茄莖的橫切結構。
[0027] 圖8為石蠟切片下番茄莖結構。
【具體實施方式】
[0028] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明,均為常規方法。
[0029] 下述實施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業途徑得到。
[0030] ArcturusXT雷射捕獲顯微切割儀購自Life technologies公司,產品型號為 Arcturusi:M Laser Capture Microdissection Systems。
[0031] 實施例I、石賭切片和雷射顯微切割技術(Laser Capture Microdissection, LCM) 相結合精確獲取番茄莖的韌皮部
[0032] 一、石蠟切片的製備
[0033] 1、材料種植:番茄種子經浸種催芽處理,2?3天左右,當60%種子"破嘴露白",即 露出胚根時,播種於育苗盤中,育苗基質為高溫消毒的草炭:蛭石(質量比1:1)。番茄育苗 期間置於溫室,培養溫度25-28°C,16hr光照/8hr黑暗,土壤溼度保持在50-60%。每兩周 供應一次MS營養液。當幼苗長至2-3葉時,將幼苗移植到8 X 8cm營養缽育苗。
[0034] 2、取生長旺盛的番茄幼苗,剪去葉,只留莖段,取距離莖尖3cm以下的健壯莖段 (如圖1),用鋒利的雙面刀片切成長度為4-5mm的小段,得到樣品,將樣品立即投入固定液 (冰醋酸:乙醇體積比為1:3,如圖2)。
[0035] 取材過程中嚴格控制用具是RNAase-free或是經過RNAase away清洗過的,盡力 減少實驗過程中存在的RNAase。取材過程要迅速,固定液事先在冰上預冷,固定液的體積是 樣品體積的20倍以上。
[0036] 3、冰上抽真空10minX3次,緩慢平衡真空瓶內的氣壓,使固定液儘快深入樣品內 (如圖3)。
[0037] 4、更換一次固定液後4°C搖晃固定過夜(如圖4)。
[0038] 5、將步驟4得到的樣品依次在由乙醇和二甲苯按體積比3:1,I: I,1:3, 0:1,0:1和 0:1混勻得到的各溶液中進行室溫梯度脫水,每級梯度脫水I. 5h,各級溶液的使用體積為 6 OmL 〇
[0039] 6、在步驟5最後脫水的60mL二甲苯溶液中加入石賭液到80mL(石賭和二甲苯的 體積比為1 :3),轉移到60°C恆溫箱,Ih後上下顛倒。30min後倒出40mL溶液,加石蠟液到 60mL(石蠟和二甲苯的體積比為1 :1),打開瓶蓋揮發二甲苯。4h後更換純石賭,4h重複更 換一次,浸透過夜(如圖5)。
[0040] 7、更換一次新的石蠟液,浸透4h後進行樣品包埋,得到包埋的樣品(如圖6)。將 包埋的樣品用錫箔紙包好避光4°C保存。
[0041] 8、石蠟切片機刀架附近及其他用具經過RNAase away清洗,包埋塊(包埋的樣品) 修切面修整成梯形,切片厚度 8-10 μ m(Leica RM2235, Leica Microsystems, Nussloch, Ger many)〇
[0042] 9、挑選完整條帶的切片整齊排列於載玻片上的DEPC水上,37°C (37°C_45°C均可) 烘片至乾燥。
[0043] 10、將烘乾的切片置於真空乾燥器中4°C保存過夜(此步可選擇保存,後續試驗要 求儘快完成)。
[0044] 11、將步驟10得到的樣品載玻片拿出放置至室溫,依次進行IOminX 2次的二甲苯 脫蠟,2min X 2次的100 %乙醇脫水,室溫晾乾載玻片。
[0045] 二、雷射顯微切割樣品及樣品的觀察
[0046] 按照ArcturusXT雷射捕獲顯微切割儀的說明書進行操作。
[0047] 主要步驟如下:
[0048] 1、點擊軟體右側工具欄Setup項目中的Present Stage按鈕,使載物臺移動到可 以放置玻片的位置,將步驟一得到的載玻片和Cap (在雷射切取組織後,需要用cap將切下 來的組織粘走,後續切割組織再使用此cap的其他部位粘,最後cap上會得到累加的韌皮部 組織)放置到載物臺上。
[0049] 2、在軟體右下角的Load Caps和Slide的欄目中,選擇所使用Cap的類型和數量, 以及每個位置所放置玻片的類型。
[0050] 3、選擇Slide欄目裡選擇要觀察的玻片,載物臺將會移動,使載玻片移動到顯微 鏡的觀察範圍內。
[0051] 4、在軟體下方中間的導航圖欄中點擊滑鼠右鍵,在彈出的窗口中選擇Reacquire Overview Image,為載玻片拍攝導航圖。
[0052] 5、在Imspect欄目中選擇所要使用倍數的顯微鏡,調整亮度和焦距,使看到的畫 面清晰。
[0053] 6、觀察玻片,找到所要捕獲的細胞所在的區域。
[0054] 7、在軟體下方中間的導航圖欄中點擊滑鼠右鍵,在彈出的窗口中選擇Place Cap at Region Center,儀器將會把Cap放到所要捕獲的細胞所在的區域。
[0055] 8、利用Select欄目中的畫圖工具圈定所捕獲的細胞。
[0056] 9、點擊Microdissect欄目中切割捕獲的按鈕,捕獲所選的細胞。
[0057] 10、點擊 Microdissect 欄目中的 Move Cap to QC Station 按鈕,儀器將會把 Cap 放置到QC的位置。
[0058] 11、觀察Cap上面捕獲到的細胞。如果捕獲成功,重新點擊Setup項目中的Present Stage按鈕,使載物臺推出。從儀器上取下Cap,進行後續的提取純化操作(如根據實驗的 目的提取韌皮部的DNA,RNA或是蛋白質)。
[0059] 石蠟切片下番茄莖結構如圖8所示。
[0060] 圖8中,A為石蠟切片下番茄莖橫切結構;B為雷射顯微切割韌皮部後剩餘的番茄 莖的橫切結構;C為Cap上獲取的番茄莖韌皮部組織。
[0061] 圖8A表明,番茄莖組織結構完整,能快速的分辨出韌皮部組織。
[0062] 圖8B表明,沒有除韌皮部之外的其他組織在獲取韌皮部過程中被取走。
[0063] 圖8C表明,獲取的韌皮部單一,沒有其他組織的汙染,且能估測獲取細胞的數量。
[0064] 對比例、冷凍切片獲取番茄莖的韌皮部
[0065] 一、冰凍切片機條件設置
[0066] 1、將Leica CM3050S冰凍切片機的機箱內溫度(CT)調節到-22°C到-24°C之間, 樣品頭溫度(OT)為-22°c到-24°c之間。
[0067] 2、設置修塊厚度和切片厚度:一般修塊厚度為50 ym或100 μπι。切片厚度在 10-16 μ m 之間。
[0068] 3、設置刀座角度:刀座角度在0-5°。
[0069] 二、冷凍切片的製備
[0070] 1、樣品的固定同實施例1中步驟一的1-4,將得到的莖段樣品用OCT包埋劑垂直粘 在樣品砣上,放在Leica CM3050S冰凍切片機的機箱內冷凍,包埋劑逐漸變白變硬,將莖段 固定在樣品砣上。然後,再在莖段周圍塗上適量的包埋劑,使莖段完全被包在包埋劑中。
[0071] 2、修塊:手搖冰凍切片機的手動輪進行修塊,使切面平整,且露出莖段橫切面。將 莖段橫切面周圍的包埋劑用單面刀片修成梯形,且底邊平行正對刀口。再修,平整切面。
[0072] 3、切片:放下防卷板,手搖或者自動切片。在切片過程中,可以調整刀座的角度,防 卷板與刀片之間的間隙,以獲得較好的切片。最理想的切片是:切片不捲曲,不破裂,組織完 整,獨立成片。
[0073] 4、粘片:掀起防卷板,用常溫下的載玻片輕輕接觸切片,由於溫差,切片就自動粘 附在載玻片上。
[0074] 5、脫水:切好的冰凍切片黏附在載玻片上,立即放入體積百分含量為70%的乙醇 水溶液(_20°C )中2min,再放入體積百分含量為95%乙醇水溶液中2min,100%乙醇2min 進行梯度脫水,自然風乾。
[0075] 脫水後的冷凍切片下番茄莖的橫切結構結果如圖7所示。
[0076] 圖7表明,由於幼嫩番茄苗的含水量較高,冰凍切片後1-5分鐘之內,細胞結構非 常清晰。但之後隨著冰凍切片逐漸與室溫平衡,細胞組織中的水分從固態逐漸變成液態,細 胞漲破,使得切片觀察到的結構特徵與剛製作完成的切片有很大區別,不易進行後續試驗。
[0077] 如果將冰凍切片機的機箱內溫度設在_25°C以下時,組織材料和包埋劑完全凝固, 且質地堅硬,切片時,由於溫度過低,容易出現切片撕裂的現象,影響效果。有時切片中的組 織和包埋劑在過低的溫度條件下會發生脫離。
[0078] 綜上所述,冷凍切片不適用於與雷射顯微切割技術相結合精確獲取番茄莖的韌皮 部。
【權利要求】
1. 一種獲取植物韌皮部的方法,是將含有韌皮部的植物組織的石蠟切片用雷射顯微切 割方法獲取其中的韌皮部。
2. 根據權利要求1所述的方法,其特徵在於:所述石蠟切片在所述用雷射顯微切割方 法獲取其中的韌皮部之前還包含將所述石蠟切片進行烘乾、脫蠟、脫水和晾乾的步驟。
3. 根據權利要求1或2所述的方法,其特徵在於:所述烘乾的條件為在DEPC水上 37°C -45°C烘乾,具體為37°C烘乾。
4. 根據權利要求1-3任一所述的方法,其特徵在於:所述脫蠟為二甲苯脫蠟。
5. 根據權利要求1-4任一所述的方法,其特徵在於:所述脫水為100%的乙醇脫水。
6. 根據權利要求1-5任一所述的方法,其特徵在於:所述石蠟切片的厚度為8-10 ym。
7. 根據權利要求1或2所述的方法,其特徵在於:所述韌皮部為所述植物的莖的韌皮 部。
8. 根據權利要求1所述的方法,其特徵在於:所述植物為番茄。
【文檔編號】C12N5/04GK104480061SQ201410670431
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】王紹輝, 範敬偉, 趙文超, 楊瑞, 趙福寬, 王建立 申請人:北京農學院