從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法
2023-08-07 04:52:26 3
專利名稱：從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法
技術領域：
本發明涉及利用轉基因蠅蛆提取抗菌肽，特別是從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法。
在自然界，蒼蠅是傳播疾病的重要媒介害蟲，最多能給人、畜傳染多種疾病，但自身並不染病。蒼蠅對惡劣環境具有極強的適應能力和有效的防禦機制；大量研究證實，任何病菌在蒼蠅體內的存活時間最多不超過7天，而只要有萬分這一濃度的蒼蠅抗菌物質，就可以殺死多種病菌，其效力是目前人類已發現的任何一種抗菌素所無法比擬的。在目前不少病原菌對已有抗生素逐漸產生耐藥性，而新的抗生素發現又極為困難，蒼蠅抗菌肽不乏是未來抗菌素的最佳選擇。
蒼蠅的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以成為新一代不會在人體內形成抗藥性的超級抗生素藥物。美國的馬蓋寧製藥公司於1987年開始致力於Magainin的商業性研製，現已人們讚譽「馬蓋寧」象青黴素那樣，具有劃時代的應用潛力。馬蓋寧(一種蛙皮肽)作為人用藥。2000年批准上市後，當年銷售額即達10億美元。
現代研究證實，抗菌肽廣泛存在於動物(昆蟲)，植物和微生物中，採用純化方法難以獲得大量的抗菌肽。我們將人工合成的一種外源性抗菌肽，採用基因工程方法實現轉基因蠅蛆抗菌肽為工廠化生產高含量抗菌肽奠定了堅實基礎。
本發明的目的是利用現代技術手段，從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法。
從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法_收集蠅蛆→蠅蛆滅菌技術處理→蠅蛆抗菌肽含量→低溫深凍、貯存原料低溫粉碎製成超微勻漿→抽提去除雜質→濃縮→分離純化→鑑定各項指標→加穩定劑及賦形劑→調配不同規格製品→半成品鑑定→成品分裝。
一、轉基因抗菌肽家蠅的飼養轉基因抗菌肽蠅蛆接種於已配好的飼料中，飼料配方按麩皮、奶粉、白糖、米粉、豆餅粉等比例配成轉基因抗菌肽蠅蛆的飼養。使配料鬆軟透氣，也可增加酵母粉及蛋白質的含量，以利幼蛆蛆的生長與發育。飼養盒(框)中飼料，厚度以不超過4-5公分為好，接種時用小鏟將孵化盒中所孵化出的一齡幼蛆(種子)剷出並慢慢放入飼養盒中飼料上，接種量不可過密，也不能過稀。
幼蟲(蛆)飼養盒中吃飼料時，一般是自上而下，若飼養盒中的培養物要注意溫度、溫度和PH值，以及室內光線和通氣。要隨時檢查溫度、溼度、PH值，飼料及蠅蛆的密度，隨時調整。
幼蛆從卵孵化出，體長2毫米，24-36小時幼蛆進行第一次蛻皮，再經一次蛻皮民為老熟幼蟲，此時體長可達12-14毫米，整個幼蟲期為5-8天。
成熟的老熟幼蟲(蛆)即停止取食，改變趨向，靜止化蛹。飼養人員可及時給予這樣的環境使之化蛹保種。同時，大量成蛆(老熟幼蟲)分離出來，加入適量緩衝液利用滲透透壓的壓差，使蠅蛆中抗菌肽游離，同時還用物理學方法誘導或降低氧氣濃度以進一步提高轉基因蠅蛆體內抗菌肽的含量。經過這樣處理後按一定規格分裝，低溫冷凍。作產品原料或商品貯存備用。
家蠅要在工廠化滅菌條件飼養。以滿足抗菌肽藥品產業化的需要。
二、從轉基因抗菌肽蠅蛆製備藥用抗菌肽的方法從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備藥用抗菌肽工藝可人分為轉基因抗菌肽蠅蛆原料的貯藏、蠅蛆抗菌肽粗品提取、精品純化、分裝燈檢與包裝。
1、蠅蛆原料要求與貯藏原料要從工廠化無菌飼養轉基因家蠅的蠅蛆，於低溫保存。要有轉基因抗菌肽蠅蛆、重金屬和相關衛生指標的檢定報告。
2、粗品提取冷凍的轉基因抗菌肽蠅蛆用絞肉機絞碎，再用膠體磨研磨製成勻漿，倒入大罐內，按勻漿量1∶1加入蒸餾水置入加層升溫鍋，使溫度加熱至100度，持續20分鐘，用輸液泵把藥液輸入濾槽內進行過濾，再將藥液放入水槽冷卻，微孔濾膜過濾除去殘渣，藥液為抗菌肽粗品，置於2-8度保存。
3、精製純品取微孔濾膜除去殘渣的抗菌肽藥液再用5000分子量超濾膜超濾除5000以上大分子，然後用3000分子量超濾膜除3000以下小分子，濃縮最後過層析柱，分離得到的半成品原液其抗菌肽純度達98％，也可將加熱升溫後的勻漿，用大容量低溫離心收集上清液，將上清液加入硫酸銨沉澱，離心分離收集沉澱，然後在沉澱中加入緩衝液溶解，離心分離收集上清液，上清液經G-25脫鹽、DEAE離子交換柱、phenyl疏水層析過柱、S-100凝膠層析柱分離得到合格的半成品原液，純度也可達98％。
4、分裝、燈檢及包裝將檢定合格的半成品原液加入賦型劑以及保護劑按生產所需規格稀釋，稀釋液經過筒式過濾器除菌，經過熱源質、無菌試驗合格後，經過分裝機裝入西立瓶，進行軋蓋、燈檢。抽樣做成品檢定，經過成品檢定合格後可包裝入庫。
三、藥用抗菌肽理化性質及質量檢定基因抗菌肽藥品是利用轉基因抗菌肽家蠅受精卵工程技術構建的工程家蠅繁育出的蠅蛆提取純化而成。臨床上主要用於治療感染性疾病代替抗菌素，對腫瘤，真菌、病毒也有很好的治療作用。
按照WHO《保證DNA重組技術藥品質量的指導原則》和國家新藥的要求，結合本品的生產工藝特點，參考國內外藥典及國內外企業相關標準，對藥用基因抗菌肽的性化和質量進行檢定。
1、性質鑑別DNA重組藥物質量控制，可利用製品的分子量、電荷、等電點、胺基酸組成和疏水性等化學物理性質，採用現代分析手段，如聚丙烯醯胺凝膠電滬、等電聚焦、排陰色譜、反相色譜、離子交換色譜。肽圖分析、胺基酸分析、紫外光譜、園二色散等其它光譜技術進行嚴格分析鑑定。本項目據國內現有條件參照國外標準，暫定三項鑑別試驗1)還原型SDS-PAGE法測定遷移率，樣品遷移率應與對照品一致，以證實基因藥物與天然藥物分子量大小一致。從一個側面反映二者的同質性，用SDS-PAGE(還原法)。
2)RP-HPLC法測定保留時間，本標準採用BP的方法，以含有正丙醇的Tris緩衝液作為流動相，該法能鑑別帶甲硫氨酸的與無甲硫氨酸的重組基因人抗菌肽。樣品保留時間應與對照品一致(=2％)，以證實二者在疏水性方面具有同質性。用鑑別與相關蛋白測定方法。
3)肽圖譜本標準採用BP的方法，用胰蛋白酶裂解樣品與照品，採用RP-HPLC法分離裂解的片段，在214nm波長處檢測。從肽圖譜上可以鑑別基因藥物與天然藥物在蛋白質一級結構上是否具有同質性。因為肽圖說對第一咱蛋白質來說都是特徵的、專一的。因製劑中非抗菌肽成份影響肽圖分析，與對照圖譜一致。用胰肽圖譜方法之質量檢定。
2、質量檢定
(1)宿主蛋白由於轉基因藥物臨床時間短，宿主蛋白是否具有危害性還難以在短期內觀察到，因此還需要控制其含量。本標準採用斑點免疫分析法，其檢測靈敏度達2ng。檢查國內各批原料中含宿主蛋白不得過30ng/mgpro，製劑可不做此檢查。用宿主蛋白測定方法。
(2)殘餘DNA作為外源DNA，被認為是具有潛在致癌性雜質。WHO要求每劑量藥品中殘餘DNA含量應＜100pg。本標準採用非放射性地高辛標記DNA作控針，並與待測樣品中的同源DNA序列進行分子雜交，用免疫學法顯色，通過比較樣品與標準DNA的顯色程度，米檢查樣品中殘餘DNA的量。該法靈敏度可達1pg。BP標準中未規定其限量，故本標準規定同WHO的要求，製劑不做此項檢查，用殘餘DNA含量測方法。
(3)相關蛋白主要指氧化抗菌肽及其它相關抗菌肽，這些成份多不具有抗菌肽的生物活性，其過量存在將大大影響抗菌肽的療效。BP標準規定，總相關蛋白，原料中應＜10％，故暫訂為不得過10％，用鑑別與相關蛋白測定方法。
(4)高分子蛋白主要指二聚和多聚抗菌肽，它們不具有生物活性，產品中其含量高時將極大影響藥品的療效。本標準採和BP的方法(HPSEC法)，檢測國內產品，其高分子蛋白量均＜4％，故本標準暫訂為原料與製劑中含量高分子蛋白應＜4％。用高分子蛋白與含量測定方法。
(5)脫氨組份抗菌肽分子含有的Asn和Gln，在一事實上條件下會脫去氨基，表現為等電點降低。本標準採用等電聚焦電泳檢查原料與製劑中的脫氨組份。目前所測國內試驗正式產品均未檢出脫氨組份。BP中採用此方法，僅作鑑別，Kabi企業標準用此法，並規定脫氨組分應＜10％，因此本標準暫訂＜10％！用等電聚焦法。
6、活性測定用的平四瓊脂糖孔穴擴散法進行了改進，命名檢測敏感性提高2.2-3.8倍，抗菌肽含量為0.1ug時即可觀察到有明顯的抑菌圈。薄層平板法可保證瓊脂糖厚度一致，從而提高檢查結果的穩定性，同時由原來的半定量發展為定量測定。用薄層平板瓊脂糖孔穴擴散法。
(7)純度本標準採和銀染法非還原SDS-PAGE法，BP標準不用此法，USP標準草案及國外企業均採用此法，故本標準用薄層掃描電泳膠片，按歸一化法計算主成份相對百分含量，規定純度為98％。用SDS-PAGE(非還原型)方法。
(8)基因藥物半成品無菌、內毒素等均應符合注射劑要求。
4、含量測定(1)基因抗菌肽含量目前BP、EP和USSP標準草案及國外企業標準均採用HPSEC法測定抗菌肽含量，已無生物效價測定項目。所用色譜條件基本一致。製劑以ug/瓶標示。本標準依據BP的方法，並以「馬蓋宇」(蛙抗菌肽)樣為對照，測定原料與製劑中抗菌肽單體含量。參照USP草案，本標準暫訂製劑中抗菌肽的含量應為標示量的90-11％。
(2)總蛋白含量的測定總蛋白測定採用了USP標準草案和「馬蓋寧」樣品標定所用方法，即紫外吸收係數法，該法具有簡便、快速、準確的特點。取本品，用水配成1mg/ml的深液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVA)，在適度nm的波長和適度nm的波長處檢測吸收度，按吸收係數(EL％C)為0.8，以下式計算即得。 四、基因抗菌肽藥物指標控制要點下述項目與指標必須符合基因生物藥品質量規定要求。Lowos檢測蛋白含量 1.65外觀檢查微色液體SDS-PAGE電泳純度測定 ＞97PH值6.55HPLC純度測定 100 無菌試驗合格SDS-PAGE電脈分子量測定3300熱原質檢定(家免法) 合格等電聚焦電泳等電點測定5.5 內毒素試驗(魚試劑法)＜kc/n特異性及純度檢測(免疫印跡法) 陽性安全試驗合格殘餘DNA檢測 ＜10pg/mg 穩定性試驗 合格宿主蛋白含量測定 ＜510pg/mg全自動紫外全波段掃描 276.9效價測定 4.72肽圖譜測定合格N端胺基酸序列 與理酸一致(N端不含胺基酸)生物活性測定 50ug/ml本發明的特點1、規模大，適用於產業化生產。
2、工藝流程短、簡便，可連續操作；3、收率高，抗菌肽回收率可達70％；
4、純度好，活性抗菌肽蛋白純度可達98％；5、各環節質控指標嚴，產品合格率可達到95％。
實施例1從冷凍庫中提取轉基因抗菌肽蠅蛆的合格原料10公斤，將凍塊分割絞碎，製成勻漿，加10公斤蒸餾水攪拌，升溫100度持續20分鐘，降溫除去變性蛋白及殘渣，兩次超濾濃縮，過層析柱，收集藥液，置於2-8度低溫保存，供製劑抗菌肽藥品用。
實施例2從轉基因抗菌肽家蠅工廠化無菌飼養場冷凍庫取迴轉基因抗菌肽蠅蛆，新鮮原料100公斤，用絞肉機絞碎，放入大型膠體磨研磨成勻漿，再加入100公斤蒸餾水攪拌置入加層升溫鍋，升溫至100度持續20分鐘，降溫用輸液泵過濾除去變性蛋白，再用微孔濾膜除去殘渣，再次超濾濃縮最後過層析柱，使其藥液中抗菌肽純度達98％。在整個製備中嚴格控制各項質控指標。使藥液完全符合國家規定的基因生物藥品各項質量指標的要求。
權利要求
1.從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法，收集蠅蛆→蠅蛆滅菌技術處理→蠅蛆抗菌肽含量→低溫深凍、貯存原料低溫粉碎製成超微勻漿→抽提去除雜質→濃縮→分離純化→鑑定各項指標→加穩定劑及賦形劑→調配不同規格製品→半成品鑑定→成品分裝。
2.根據權利要求1所述的製備人用基因抗菌肽藥品的方法，冷凍的轉基因抗菌肽蠅蛆用絞肉機絞碎，再用膠體磨研磨製成勻漿，倒入大罐內，按勻漿量1∶1加入蒸餾水置入加層升溫鍋，使溫度加熱至100度，持續20分鐘，用輸液泵把藥液輸入濾槽內進行過濾，再將藥液放入水槽冷卻，微孔濾膜過濾除去殘渣，藥液為抗菌肽粗品，置於2-8度保存。
3.根據權利要求1或2所述的製備人用基因抗菌肽藥品的方法，從冷凍庫中提取轉基因抗菌肽蠅蛆的合格原料10公斤，將凍塊分割絞碎，製成勻漿，加10公斤蒸餾水攪拌，升溫100度持續20分鐘，降溫除去變性蛋白及殘渣，兩次超濾濃縮，過層析柱，收集藥液，置於2-8度低溫保存，供製劑抗菌肽藥品用。
4.根據權利要求1所述的製備人用基因抗菌肽藥品的方法，取微孔濾膜除去殘渣的抗菌肽藥液再用5000分子量超濾膜超濾除5000以上大分子，然後用3000分子量超濾膜除3000以下小分子，濃縮最後過層析柱，分離得到的半成品原液其抗菌肽純度達98％，也可將加熱升溫後的勻漿，用大容量低溫離心收集上清液，將上清液加入硫酸銨沉澱，離心分離收集沉澱，然後在沉澱中加入緩衝液溶解，離心分離收集上清液，上清液經G-25脫鹽、DEAE離子交換柱、phenyl疏水層析過柱、S-100凝膠層析柱分離得到合格的半成品原液，純度也可達98％。
5.根據權利要求1或4所述製備人用基因抗菌肽藥品的方法，從轉基因抗菌肽家蠅工廠化無菌飼養場冷凍庫取迴轉基因抗菌肽蠅蛆，新鮮原料100公斤，用絞肉機絞碎，放入大型膠體磨研磨成勻漿，再加入100公斤蒸餾水攪拌置入加層升溫鍋，升溫至100度持續20分鐘，降溫用輸液泵過濾除去變性蛋白，再用微孔濾膜除去殘渣，再次超濾濃縮最後過層析柱，使其藥液中抗菌肽純度達98％。
全文摘要
從轉基因抗菌肽蠅蛆中製備人用基因抗菌肽藥品的方法,取轉基因抗菌肽蠅蛆原料冷凍粉碎製成均漿,接比例加蒸餾水攪拌放入加層鍋升溫,使蛋白變性,降溫抽濾除去蛋白,濾液用微孔濾膜除去殘渣至透明液體,經兩次超濾濃縮再除去大、小分子,最後過層析柱,使其藥液抗菌肽活性蛋白純度達98%,經各項指標檢定符合基因生物藥品要求。
文檔編號A61K38/02GK1312292SQ01106190
公開日2001年9月12日 申請日期2001年2月23日 優先權日2001年2月23日
發明者苟仕金, 苟鴻鷹, 王成餘 申請人:遼寧天成生物製藥研究所