增加基於基質的離子源的高解析度成像的景深的製作方法

2023-08-07 21:17:21 3

專利名稱：增加基於基質的離子源的高解析度成像的景深的製作方法
技術領域：
本發明涉及增加基於基質的離子源的高解析度成像的景深。
背景技術：
質譜分析是用於定性和定量確定化學和生物樣品中的化合物的分析方法。樣品中的分析物被電離，根據它們的質量被質譜儀所分離，並被檢測以產生質譜。質譜提供關於質量的信息，並且在某些情況下，還提供關於構成樣品的各種分析物的量的信息。在特定實施例中，質譜分析可以被用於確定樣品中的分析物的分子量或分子結構。因為質譜分析快捷、清楚、靈敏，因此質譜儀設備已被廣泛應用於生物分析物的快速識別和表徵。
在過去幾年間，基於基質的電離方法(例如基質輔助雷射解吸/電離(MALDI)方法)已被證明對樣品的電離很有價值，並且已經發現其被廣泛應用於諸如基因學和蛋白質組學之類的各種領域。在執行基於基質的方法時，與樣品共結晶的有機基質與樣品相結合，然後將樣品沉積在樣品板上。樣品板被放置在離子源中，並且諸如雷射束之類的能量源使樣品汽化。在樣品汽化期間，形成分析物離子。基質的出現被認為使分析物能夠被電離，從而解決了其他方法的問題。
在很多情況下，基於基質的離子源與分析設備(例如質譜儀)集成在一起，以研究被電離的分析物。在大多數情況下，飛行時間質譜儀(「TOF-MS」)被用於此目的，但是，也可以使用多種其他質譜儀，包括離子回旋加速共振質譜儀(例如傅立葉變換離子回旋加速共振質譜儀)、離子阱質譜儀(例如高頻四極離子阱質譜儀)或者混合儀器(例如四極/飛行時間質譜儀，或Q-TOF)。
在使用基於基質的電離方法使樣品電離時，一般需要查看樣品板上的某個區域，以確保樣品已被沉積在該區域上，並確保雷射實際上將要撞擊該樣品。具體而言，需要一個提供樣品詳細圖像(具體而言，示出分析物晶體區域的圖像)的成像系統。
現有技術的成像系統能夠捕獲到基於基質的離子源的樣品板上的樣品的圖像，並將該圖像傳輸到監視器，以使該樣品可以被查看。但是，由於在這些成像系統中採用了光學器件，而它們通常受到限制，這是因為它們無法產生在整個視場(或者至少視場的擴展區域)上對焦的高解析度、高對比度的圖像。
例如，產生基於基質的離子源中的樣品板的某個區域的高解析度圖像是很有挑戰性的，因為該區域通常無法從上方(即在x和y方向與樣品板的表面共面時從z方向)直接查看。在大多數情況下，在產生離子源中的樣品板的某個區域的圖像時，必須以一定角度從側面查看該區域，該角度可能依賴於所使用的特定離子源和成像系統而差別很大。因為所使用的成像系統所固有的限制，所以使用這種系統產生高解析度圖像是很有挑戰性的。
因此，仍需要新型的基於基質的樣品板成像系統。本發明滿足該需求以及其他需求。

發明內容
本發明提供了用於產生離子源的樣品板上某個區域的對焦圖像的方法。該方法一般包括a)在成像設備的視場中定位某個區域；b)產生該區域的具有不同對焦區的多個圖像；以及c)使用這多個圖像生成該區域的對焦圖像。對焦圖像一般是包含這多個圖像的對焦區的合成圖像，並且可以是二維或三維圖像。所述具有不同對焦區的多個圖像可以使用多種方法來獲得，例如通過在樣品板的平面中移動所述區域，通過改變成像設備的焦距，或通過它們的組合。本發明還提供了用於執行上述方法的系統和程序。本發明可用於多種分析方法。例如，本發明可用於化學、環境、法醫、食品、藥品和生物研究應用。
這裡描述的本發明可以用於產生為用於離子源而配置的樣品板的表面上的樣品的對焦高解析度圖像。包含了包含晶體的分析物的樣品區域可以通過使用本發明被識別出。在某些實施例中，可以在基於基質的離子源中移動樣品板，以使離子源的電離雷射撞擊分析物包含晶體，從而促進分析物離子的產生。
本發明可以應用在採用了在其上沉積有樣品的樣品板的任意類型離子源中。下面將更詳細描述採用了用於基於基質的離子源的樣品板的示例性實施例。


圖1示意性地示出了離子源的樣品板表面上的某個區域，該區域是由成像設備以相對於樣品板表面一定角度捕獲的。
圖2示意性地示出了本發明的第一實施例。
圖3A示意性地示出了本發明的第二實施例。
圖3B示意性地示出了本發明的第三實施例。
圖4示意性地示出了本發明的第一示例性離子源。
圖5示意性地示出了本發明的第二示例性離子源。
圖6示意性地示出了本發明的質譜分析系統。
圖7示出了本發明的第四實施例。
圖8A到圖8D示出了本發明的示例。
具體實施例方式
術語定義除非另外定義，否則這裡使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬領域的普通技術人員所公知的相同意義。而且，下面的某些元素是出於簡化和易於參考的目的而定義的。
這裡使用的術語「使用」與其傳統意義相同，同樣指採用(例如交付使用)方法或構成以達到目的。例如，如果程序被用於創建文件，則程序被執行以創建文件，該文件通常是該程序的輸出。在另一示例中，如果文件被使用，則它被訪問、讀取，並且存儲在該文件中的信息被採用以達到目的。
「離子源」是可以產生離子以用於質譜分析系統中分析的任何裝置。示例性的離子源包括電子撞擊(EI)和基於基質的離子源以及其他離子源。離子源可以工作於任意環境壓力(例如大約10-8Torr到大約2,500Torr之間)，其中「環境壓力」是離子源外殼內的壓力。離子源內的環境壓力例如可以是高於或低於100mTorr的任意壓力，在100mTorr到大約2,500Torr或者高真空(例如從大約10-8Torr到大約10-4Torr)範圍內的任意壓力，包括大氣壓(大致760Torr)。換句話說，離子源可以工作於大氣壓、高於大氣壓或者低於大氣壓。
術語「基於基質的離子源」指的是這樣的離子源，在該離子源中，樣品與基質(一般是有機基質)相結合，並在其被電離之前被沉積在樣品板上。基於基質的離子源不依賴於用於電離的揮發溶劑。示例性的基於基質的離子源包括快原子轟擊電離(FAB)離子源和基質輔助雷射解吸電離(MALDI)離子源。這裡使用的術語「MALDI」包含大氣壓MALDI(AP-MALDI)以及低於大氣壓的MALDI(例如真空或中間壓力MALDI)。因此，對MALDI設備(例如MALDI離子源或MALDI樣品板)的引用指示該設備適合與AP-MALDI方法一起使用，或者適合與低於大氣壓的MALDI(例如真空或中間真空MALDI)方法一起使用。
「離子源樣品板」或「被配置為在離子源中使用的樣品板」是適合在質譜分析系統的離子源中使用的樣品板。離子源樣品板可以具有任何形狀，例如圓形、方形、矩形、橢圓形等等，並且可以由任何材料(例如任何金屬)構成。在離子源樣品板的表面上的樣品在離子源中被電離。
術語「相鄰的」指的是附近的、緊接著的或者鄰接的。相鄰的某物也可以是與另一組件相接觸、圍繞另一組件、與另一組件相隔或者包含另一組件的一部分。
「遠端位置」指的是除離子源所在位置之外的位置。例如，遠端位置可以是同一建築物中的另一房間，或者同一城市中的另一建築物、不同城市中的另一位置、不同州中的另一位置、不同國家中的另一位置等等。當一個項目被指示為位於另一項目的「遠端」時，意味著這兩個項目可能在同一房間中，但被分離開，或者至少在不同的房間或不同的建築物中，並且可能至少相距1英裡、10英裡或至少100英裡。「傳輸」信息指的是通過合適的通信信道(例如專用或公共網絡)將代表該信息的數據作為電信號傳送。「轉發」項目指的是無論通過物理地運輸該項目還是利用其他方法(在該方法可能的情況下)將該項目從一個位置轉移到下一位置的任何手段，並且至少在該項目為數據的情況下，包括物理地運輸攜帶數據的介質或傳輸該數據。傳輸介質的示例包括去往另一計算機或聯網設備的無線電或紅外傳輸信道以及網絡連接，以及包括了電子郵件傳輸和記錄在網站上的信息的網際網路或內聯網等等。「多個」至少是2個，例如2、3、4、6、8、10、12或大於12。短語「多個」和「多重」可互換使用。多個元件至少包含第一元件和第二元件。
術語「光圈數」指的是成像設備的光圈大小的量度。光圈數越大，光圈越小。
作為其他圖像的「組合」的圖像是由來自兩個或更多個其他圖像中的每個圖像的至少一部分構成的圖像。
「二維圖像」是可以利用x和y坐標來描述的圖像。二維圖像是平面的並且沒有深度。
「三維圖像」是可以參考x、y和z坐標來描述的圖像。三維圖像具有深度並且可以在任何一個維度上旋轉。
術語「定位」指物體在一維、二維或三維中的任意方向上的移動。當第一物體相對於第二物體定位時，第一物體可以移動，第二物體可以移動，或者兩個物體都可以移動。
本發明的具體描述本發明提供了產生基於基質的離子源的樣品板上的某個區域的對焦圖像的方法。該方法一般包括a)在成像設備的視場中定位某個區域；b)產生該區域的具有不同對焦區的多個圖像；以及c)使用這多個圖像生成該區域的對焦圖像。該對焦圖像一般是包含了多個圖像的對焦區的合成圖像，並且可以是二維的或者三維的圖像。具有不同對焦區的多個圖像可以使用多種方法來獲得，例如通過在樣品板的平面上以彼此相對的方式移動該區域和成像設備，通過改變成像設備的焦距或者通過這些方法的組合。用於執行這些方法的系統和程序已被提供。本發明可用於多種分析方法。例如，本發明可用於化學、環境、法醫、食品、藥品和生物研究應用。本發明尤其可用於MALDI(例如AP-MALDI)方法中。
這裡敘述的方法可以以被敘述事件的任意邏輯上可能的順序來執行，也可以以事件的敘述順序來執行。此外，當提供了值的範圍時，應該理解，該範圍的上限和下限之間的所有中間值，以及在所述範圍中的任意其他已述值或中間值都被包含在本發明內。
提供所引用的項目僅僅是因為在本申請的申請日前它們已公開。這裡任何內容都不應解釋為許可由於在先發明而使本發明無權使這些材料的日期提前。
對單數項目的引用包括出現多個相同項目的可能性。更具體而言，這裡以及在所附權利要求中使用的單數形式「所述」等包括多個指示物，除非上下文另外明確指示。還要注意，權利要求可能被撰寫為排除任何可選元素。這種陳述正如其所表示的一樣，是要結合權利要求元素的引述、或者「否定」限制的使用，作為諸如「僅僅」、「唯一」等這種排他術語使用的在前基礎。
用於產生樣品板的某個區域的對焦圖像的方法在理想設置中，用於產生基於基質的離子源的樣品板的某個區域的圖像的成像系統應該具有儘可能開啟(open)的物鏡(例如設置為具有小光圈數，並因此具有大數值孔徑)，以便提供最大的解析度。但是，由於景深(DOF；即圖像的對焦區的大小)與數值孔徑的平方成反比(即遵循等式DOF＝λ/n2，其中λ是光的波長，而n是所使用透鏡的數值孔徑)，因此採用開啟的物鏡的成像系統通常具有非常小的景深。代表由具有開啟的物鏡的系統產生的典型圖像的圖示如圖1所示。參考圖1，圖像2一般包含視場4，視場4包含樣品板6的某個區域。視場4包含三個區對焦區8和兩個離焦區10和12。視場4是以透視圖的方式示出的，如圖所示該區域具有梯形的形狀。離焦區10最接近成像設備，而離焦區12遠離成像設備。因此，使用採用開啟的物鏡的成像系統產生的樣品板的某個區域的圖像通常包含具有高清晰度和對比度的對焦區和大量模糊的離焦區。這種圖像通常不適合於識別被沉積樣品的小的結構特徵，例如包含了樣品晶體的區域，因為這些特徵可能出現在圖像的離焦區中。
相反，物鏡光圈儘可能緊縮(close)(即設置在最大的光圈數)的成像系統可以被用於產生在其整個視場上完全對焦的樣品板上某個區域的圖像。但是，由於通過緊縮物鏡降低了解析度，因此由這種系統產生的圖像通常不適合於識別小的結構特徵。雖然由這種系統產生的圖像可以完全對焦，但是圖像的解析度可能低到不足以識別這些特徵。
鑑於以上論述，這裡描述的方法提供了一種使用可以採用開啟物鏡(例如光圈數為大約1.0到大約8.0的物鏡，例如光圈數是1.0、1.4、2、2.8、4、5.6或8或者等同的數值孔徑值)的成像系統來產生樣品板的某個區域的對焦圖像的裝置。所產生的圖像通常是對焦的(即清晰且銳利)，並且具有足夠高的解析度和對比度以識別樣品板表面(例如包含分析物晶體的區域)上的小特徵。在某些實施例中，可以認為本發明的方法在不用緊縮成像設備的光圈的情況下延長了成像設備的景深。
本發明的方法的一般特徵在圖2中示出。參考圖2，該方法一般包括產生多個(即至少2個)圖像，例如MALDI樣品板的區域19的圖像20、24和28。所產生的具有不同對焦區(例如對焦區22、26和30)的圖像被組合在一起以生成該區域的對焦圖像32。因此，利用該方法產生的對焦圖像32是包含了多個圖像的對焦區的合成圖像。
一般而言，方法是利用由計算機的處理器執行的計算機可執行指令(即程序)來執行的。用於執行該方法的計算機可執行指令一般存儲在計算機可讀介質中，該計算機可讀介質可以與包含樣品板成像系統的離子源相分離，也可以可操作地與之相連接。換句話說，計算機可執行指令可以與離子源相關聯或不相關聯。該樣品板成像系統將在下面更詳細的描述。
取決於採用哪種具體方法，下面還將更詳細描述，對焦圖像可以是高解析度的二維圖像或三維圖像，這些圖像允許在二維或三維空間中容易地識別特徵(例如分析物晶體包含區域)。
在執行所述方法時，所產生的圖像的數目一般依賴於將被成像的區域的大小以及所採用的成像系統的景深。此外，可以使用該系統產生任意數目的具有不同對焦區的圖像，並且所產生的任意數目的圖像可以被組合以生成對焦圖像。例如，在某些實施例中，可以產生2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、50個或更多個、100個或更多個、500個或更多個、1000個或更多個或者10000個或更多個具有不同對焦區的圖像。來自所產生的圖像的全部或任意部分的對焦區可以被組合以產生對焦圖像。此外，由於在這些圖像的對焦區之間可能存在大量重疊，因此不是所產生的圖像中的每個圖像的所有對焦區都可以被用於產生對焦圖像。換句話說，來自所產生的任意多個圖像的對焦區的任意兩個或更多個區域可以被組合以生成對焦圖像。
在某些實施例中，將被組合的對焦區的位置和大小可能在產生包含這些區的圖像之前就已知道。例如，圖像的對焦區的位置可以憑經驗確定或使用已知的公式來計算(例如通過計算所使用的成像系統的景深，並使景深與圖像相關)。在這些實施例中，多個圖像的對焦區可以以預定的方式被組合。需要產生其對焦圖像的區域的不同圖像的數目也可以被容易地計算出。例如參考圖2，如果所使用的成像系統的景深不改變(即是固定的)，則需要產生其對焦圖像的區域的圖像數目可容易地計算出(在此情況下，需要3個圖像)。此外，由於對焦區22、26和30的大小和位置因為景深已知而可以容易地計算出，因此這些區域可以以預定方式(即無需任意進一步的分析來識別每個圖像中的對焦區)被組合以得到對焦圖像32。
在其他實施例中，將被組合的圖像的對焦區的位置和大小在它們被產生時可能是未知的。在這些實施例中，可以採用圖像分析軟體來識別將被組合的圖像的對焦區。適用於這些實施例的圖像分析方法是本領域公知的，並且包括基於對比度的方法(例如參見US 6,320,979)和基於金字塔的方法(例如參見Ogden等人的RCA Engineer 1984 30-54-15、Adelson等人的RCA Engineer 1984 29-433-41和US專利4,797,942、6,661,986和4,498,843，這裡通過參考而將這些參考資料結合於此)以及當前在共焦顯微鏡中採用的其他方法。用於執行這種圖像分析方法的軟體可以從多個供應商(包括Sun Microsystems(Santa Clara，CA))處購買並且容易適用於此。
因為基於金字塔的方法可被用於產生二維和三維圖像，因此它們尤其適用於即時方法。基於金字塔的方法可以是低通的(或者基於「高斯金字塔」)，也可以是帶通的(或者基於「拉普拉斯金字塔」)。雖然關於這些方法存在若干變體，但是這些方法可以包含使具有不同對焦區的多個原始圖像模糊以產生多個模糊的圖像，從它們相應的原始圖像中減去模糊的圖像以產生一組其中顯示有「邊沿」(即定義的特徵)的圖像。這些邊沿指示原始圖像的對焦區，並且這些對焦區的組合產生完全對焦的圖像。例如，多個連續的對焦二維圖像可以被堆疊在彼此的頂上或旁邊，以得到對焦三維圖像。
基於金字塔的方法將圖像表示為空間上帶通的多個圖像之和，同時在每個頻帶中保留局部空間信息。金字塔可以通過利用緊湊的二維濾波器對圖像G0進行低通濾波而創建。然後，經濾波的圖像通過每隔一個像素和每隔一行執行刪除而被子採樣，從而獲得簡化圖像G1。該過程被重複，以形成高斯金字塔G0、G1、G2、G3...GnGk(i,j)=mnGk-1(2i+m,2+n),k=1...N]]>將G1擴展到與G0相同的大小並且相減，從而產生帶通圖像L0。可以構建包含遞減的大小和空間頻率的帶通圖像的拉普拉斯金字塔L0、L1、L2，...Ln-1Lk＝Gk-Gk+1，k＝0...N-1其中經擴展的圖像G由下式給出Gk,l(i,j)=4mnGk,l-1[(2i+m/2.2j+n)/2]f(m,n)]]>原始圖像可以從經擴展的帶通圖像重建G0＝L0+L1，1+L2，2+...+LN-1，N-1+GN，N在逐漸降低的空間頻率上，高斯金字塔包含原始G0的低通版本。當高斯金字塔的層級被擴展到與G0相同的大小時，可以清楚地看到這種效果。拉普拉斯金字塔包含G0的帶通拷貝。每個拉普拉斯層級包含某個大小的邊沿，並且在空間頻率上大致跨越一個倍頻程。
在將圖像合併之前先將它們分解成一組帶通分量。然後，寬交換域(transition zone)被用於低頻分量，而窄交換域被用於高頻分量。為了具有平滑的混合，在給定頻帶中的轉換域寬度應該大約是頻帶中心頻率的一個波長。然後，經合併的帶通分量被重組以獲得最終的圖像鑲嵌。
令S0、S1、S2...Sk是一組K個源圖像。一組二進位掩碼(mask)圖像M0、M1、M2...Mk確定源圖像可以被如何組合。當源圖像Sk有效時Mk為「1」，否則為「0」。通過將Sk與Mk相乘，並在k上求和，從而提供帶有階梯邊沿的「剪貼」合成。可替換地，可以產生每個源圖像的拉普拉斯金字塔Lkl、以及每個掩碼圖像的高斯金字塔Mkl。通過利用每個源金字塔層級的相應掩碼圖像對該源金字塔層級進行加權，從而通過在每個空間尺度上「剪貼」來形成合成的拉普拉斯金字塔LclLcl(i，j)＝Mk(i，j)Lkl(i，j)最終的圖像是通過擴展每個層級並求和而從Lc重建的。由於在每個金字塔層級中的交換域與該層級的中心頻率的波長具有可比性，因此實現了平滑混合。某些類型的信息可以被逐個節點地合併到金字塔中，並被節點自己的值所引導。
在一個示例中，兩個源圖像的拉普拉斯金字塔LA和LB被採用。由於焦距的改變對圖像的低頻分量幾乎沒有影響，因此這些金字塔的低頻層級應該具有幾乎相等的值。焦距的改變將影響編碼高空間頻率信息的金字塔層級中的節點值。在兩個圖像中的相應節點一般將代表場景的同一特徵，並且其差別將主要在於由於模糊而引起的衰減。具有最大幅度的節點將在最接近對焦的圖像中。「對焦」圖像分量可以在金字塔中逐個節點地選出，而不是在原始圖像中逐個區地選出。通過將每個節點設置為等於具有較大絕對值的LA或LB中的相應節點來構建合成圖像的金字塔LC如果LAl(i，j)＞LBl(i，j)那麼LCl(i，j)＝LAl(i，j)否則LCl(i，j)＝LBl(i，j)最終的對焦圖像是通過將LC的層級擴展並相加而獲得的。
有多種方法可以被用於產生具有不同對焦區的多個圖像。這些方法一般可以包括a)相對於樣品板表面上的某個區域改變成像設備的視場(例如通過在樣品板的x-y平面上在朝著和/或遠離成像設備的方向上移動樣品板，通過相對於樣品板移動成像設備或者通過移動成像設備和樣品板兩者)，b)改變成像設備的焦距，或者c)例如相對於樣品板表面上的某個區域改變成像設備的視場並且改變成像設備的焦距。在使用在其他光學裝備(例如數位相機等等)中常用的對焦裝置和/或機動化的樣品板託架的離子源中，可以容易地實現這些方法。示例性的方法如圖3A和圖3B所示。
在圖3A所示的一個示例性實施例中，成像設備40被對焦在樣品板44的區域42上。如雙向箭頭所指示，樣品板可以在其樣品包含表面的平面中在朝著和/或遠離成像設備移動。在該示例性實施例中，樣品板朝向成像設備(在圖3A中從右到左)移動，並且在位置46、48和50處，產生樣品區域42的圖像。圖像以透視的方式被分別示為元素52、54和56。區域42是相對於成像設備的視場(被示為梯形)被示出的。圖像52、54和56的陰影區域代表這些圖像的對焦區。圖像52、54和56的對焦區通過使用上述方法被組合，從而產生對焦圖像58。
在圖3B所示的另一示例性實施例中，成像設備60被對焦在樣品板44的區域42上。如雙向箭頭所指示，成像設備60的焦距可以改變(實際上是改變物鏡和該區域之間的距離)。在該示例性實施例中，成像設備的焦距被改變以產生圖像62、64和66，其中每個圖像具有不同對焦區。區域42是相對於成像設備的視場(被示為梯形)被示出的。本領域技術人員清楚，在該實施例中，視場通常是固定的，並且改變的是成像設備的焦距，以產生具有不同對焦區的多個圖像。圖像62、64和66的陰影區域代表這些圖像的對焦區。圖像62、64和66的對焦區通過使用上述方法被組合，從而產生對焦圖像68。
在另一實施例中，採用圖3A和圖3B所示方法的組合。換句話說，在某些實施例中，通過既移動成像設備的視場(例如通過相對移動樣品板和成像設備，例如通過移動樣品板和/或成像設備)也改變成像設備的焦距來產生多個圖像。
上述方法可以被用於產生樣品板的某個區域的二維或三維圖像。通過朝著和/或遠離成像設備移動樣品板並且改變成像系統的焦距來產生多個圖像的方法的實施例尤其適用於生成三維圖像。在一個示例性實施例中，可以通過如上所述那樣生成一系列二維圖像，並且利用軟體將這些圖像按順序彼此相鄰對齊(即「堆疊」)，從而產生三維圖像。這些方法容易從例如共焦顯微鏡和醫療成像(例如磁共振成像(MRI)或計算機化X線斷層照相掃描(CAT掃描))中已經採用的那些方法中修改而來。在某些實施例中，三維圖像可以被存儲在計算機可讀介質中，以使其可以被圖像分析軟體所訪問。三維圖像可以在監視器上查看。
在一個實施例中，本發明可以被用於產生樣品板表面上的三維樣品的三維圖像。三維圖像一旦產生，就可以對其進行檢查(例如自動地使用圖像分析軟體、利用監視器手工查看圖像或其組合)以識別樣品內的物體。在特定實施例中，三維圖像可以被檢查以識別呈現在三維樣品中的感興趣的特徵(例如晶體)。
一旦感興趣的特徵被識別出，就可以產生關於該特徵的位置信息(例如該特徵相對於樣品板上的固定位置的x、y和z坐標)，並且該位置信息可以被用於在離子源的電離雷射的路徑中定位該特徵。這可以通過移動樣品板和/或通過移動雷射來實現，從而使雷射照射該特徵。該特徵內的分析物可以通過用電離雷射照射該特徵而被電離。
因此，如上所述，本發明提供了多種用於分析在樣品板表面上的三維樣品的方法。樣品的三維圖像可以通過使用上述方法產生，並且上述方法可以被用於識別和/或電離樣品內的特徵。
上述方法還可以包括校正由於從側面對該區域成像而導致的對焦圖像失真。例如，幾何失真(例如透視失真)和/或對比度失真可以被校正，從而產生看起來好像是從某區域上方直接對該區域成像的圖像。用於執行這種校正的軟體是本領域公知的。
計算機可讀介質本發明還提供了用於執行以上方法的計算機可執行指令(即程序)。計算機可執行指令被記錄在計算機可讀介質上。因此，本發明提供了包含如下程序的計算機可讀介質，所述程序用於產生離子源(例如MALDI離子源)中的樣品板上某個區域的對焦圖像。所述程序包括用於產生該區域的具有不同對焦區的多個圖像的指令；以及用於利用這些圖像來生成該區域的對焦圖像的指令。所述指令可以控制樣品板在離子源中其x-y平面中的移動，可以控制成像設備的焦距和/或可以控制圖像捕獲的時刻。該程序還可以包括用於校正該程序產生的對焦圖像的任意失真的指令。
這裡使用的術語「計算機可讀介質」指的是參與向計算機提供指令和/或數據以用於執行和/或處理的任意存儲設備或傳輸介質。存儲介質的示例包括軟盤、磁帶、CD-ROM、硬碟驅動器、ROM或集成電路、磁光碟或諸如PCMCIA卡之類的計算機可讀卡等等，這些設備可以位於計算機內部或外部。包含信息的文件可以被「存儲」在計算機可讀介質上，其中「存儲」的意思是記錄信息，以使其能夠隨後被計算機訪問和獲取。
關於計算機可讀介質，「永久存儲器」指的是永久不變的存儲器。永久存儲器不會由於向計算機或處理器的供電終止而被擦除。計算機硬體ROM(即沒有被用作虛擬存儲器的ROM)、CD-ROM、軟盤和DVD都是永久存儲器的示例。隨機訪問存儲器(RAM)是非永久存儲器的一個示例。在永久存儲器中的文件是可以被編輯和重寫的。
在一個實施例中，計算機可讀介質是計算機的存儲器。在另一實施例中，計算機可讀介質是可攜式存儲設備，例如CD-ROM等等。
離子源本發明一般地提供產生離子源(例如基於基質的離子源)的樣品板的某個區域的對焦圖像的系統。該系統一般包含基於基質的離子源，該離子源包含用於對樣品板成像的成像設備。在該系統中，成像設備可操作地連結到包含上述計算機可讀介質的計算機。如上所述，計算機可讀介質一般包含用於產生某個區域的具有不同對焦區的多個圖像的指令；以及用於利用這些圖像生成該區域的對焦圖像的指令。
在操作期間，離子源可能具有至少100mTorr(例如大氣壓)或小於100mTorr的環境壓力(並且，在某些實施例中，可能是大氣壓、真空或中間真空MALDI離子源)。成像設備一般在離子源內，並且直接朝向(經由任意反射鏡和/或其他光學組件)將被成像的區域。離子源還可以包括照明設備，例如離子源內的燈泡或者具有離子源外部光源的光纖照明器，以用於照亮該區域。成像設備可以被連接到顯示器(例如視頻監視器)以用於查看該區域的對焦圖像。被成像的樣品板的區域可能包含雷射在樣品板上的撞擊點，並且該區域還可以包含被沉積的樣品。
在圖4中示意性地圖示出了示例性系統。參考圖4，示例性系統70包含離子源72，該離子源72包含成像設備74。該成像設備一般包含光電傳感器陣列(例如像素陣列)76和物鏡(它也被稱為「成像」透鏡)78。成像設備74產生離子源內的樣品板82上的區域80的圖像。成像設備的視場在圖4中被示為元素84。該成像設備被連接到包含上述程序的計算機86。線纜88可以將成像設備連接到計算機。
成像設備74可以是任意類型的照相機，但是提供數位化輸出的照相機(例如數位相機)最容易被採用。在某些實施例中，所採用的照相機可以是電荷耦合設備(CCD)或者互補金屬氧化半導體(CMOS)照相機。如上所述，這些成像設備一般包含光電傳感器陣列。該陣列的方向可以與進入成像設備的光線呈任意角度。在一個實施例中，光電傳感器陣列的方向可以被確定為在通常垂直於(即在垂線旁1°以內)進入成像設備的光線的方向上，以確保高解析度和對比度。在某些實施例中，成像設備是可對焦的(如雙向箭頭90所示)，並且成像設備的焦距可以受控於計算機86的指令。在其他實施例中並如雙向箭頭92所示，樣品板可以在其x-y平面中(即在其樣品包含表面的平面中)朝著和/或遠離成像設備移動。樣品板朝著和/或遠離成像設備的移動可以受控於計算機86的指令。計算機86的指令一般可以控制系統的多個方面，例如成像設備74的焦距和/或樣品板92的移動，成像設備74捕獲圖像的時刻，以及對每個區域產生多少圖像。一旦多個圖像被系統產生，計算機就利用上述方法而使用這些圖像來產生對焦圖像，並將該圖像(該圖像可以是二維或三維圖像)顯示在顯示器上。在顯示器上還可以示出電離雷射的撞擊點。在圖5所示的一個實施例中，本發明提供了包含圖4所示元件的系統以及用於以光線96照亮區域80的照明設備94。在某些實施例中，照明設備可以經由光導(例如光纖光導)100被連接到離子源外部的光源98(例如滷素或LED燈)。離子源還可包含電離雷射102，該電離雷射被引導到區域80內的雷射撞擊點104。離子源還可以包含置於雷射撞擊點104上方的離子出口管106，其用於將離子傳出離子源。離子源還可以包含X-Y臺以用於移動樣品板。
在某些實施例中，所述區域可以通過使用掠射角照明系統而被照亮，該系統在2005年6月8日遞交的題為「ION SOURCE SAMPLE PLATEILLUMINATION SYSTEM」的共同待決美國專利申請中有所描述，這裡為了所有目的而將該專利申請的全部內容結合於此。
使用上述系統產生的對焦圖像可以被用於多個目的。在一個實施例中，該圖像被用於確保電離雷射將撞擊樣品板表面上的所需區域。因此，如上所述，本發明還提供了使樣品電離的方法。該方法一般包括在成像設備的視場中定位樣品；產生樣品的具有不同對焦區的多個圖像；利用這些圖像生成樣品的對焦圖像；定位樣品板以使離子源的電離雷射將撞擊該樣品以及使樣品電離。
質譜分析系統本發明還提供了質譜分析系統，其包含上述用於產生樣品板的某個區域的對焦圖像的系統。包含離子源的質譜分析系統一般是本領域公知的，因此在這裡無需對其進行詳細描述。一般而言，質譜分析系統包含離子源和包含離子檢測器的質量分析儀，它們通過一個或多個中間腔體相連。圖6示出了本發明的示例性質譜分析系統。本領域常見離子源72和質量分析儀通過至少一個中間真空腔體118相分離，通過該中間真空腔體，離子在已經經由離子出口管退出離子源之後被傳輸。依賴於系統需求，可以採用一個或多個真空級。如上面詳細描述的，計算機116處理由成像設備114產生的圖像以產生樣品板112的某個區域的對焦圖像。
質量分析儀和檢測器122可以例如包括四極、三組四極、三維離子阱、線性離子阱、飛行時間(TOF)、磁區、傅立葉變換離子回旋加速共振(FTICR)或其他本領域公知的質荷分析儀。
在使用中，如果離子源72保持在大氣壓，則中間腔體118保持在比環境壓力低大約2個數量級的壓力，而質量分析儀122保持在比中間腔體的壓力低大約2到4個數量級的壓力。離子經由離子收集管退出離子源72，並且由於離子源72和腔體118之間的壓力差而通常經由漏勺(skimmer)以氣體流的形式衝入真空腔體118。離子穿過腔體118(以及任意離子導引120，和可能存在的離子束成形或對焦透鏡)並且進入質量分析儀122。質量分析儀122確定離子的m/z比，因此它可用於確定樣品中的分析物的分子量。離子導引120可以是多極離子導引、分段的多極離子導引、連續盤狀RF離子導引、離子漏鬥或其他本領域公知的離子導引。離子導引120可以連續延伸到一個或多個真空抽運級，或者可以在單個真空級中開始和結束。
效用上述方法一般地提供了離子源的樣品板某個區域的高解析度對焦圖像。該對焦圖像一般示出成像區域內特徵的詳細結構，並且可以容易地區分樣品包含區域、包含分析物晶體的區域以及其他結構。由上述方法產生的對焦圖像可以以各種不同的方式被採用。
例如，在一個實施例中，該方法可以被用於產生樣品板的某個區域的二維或三維圖像，並且在顯示器(例如監視器)上示出該圖像。在某些實施例中，還可以在顯示器上示出離子源的雷射撞擊點(即離子源的電離雷射在樣品板表面上的撞擊點)。因此，可以與電離雷射在樣品板上的撞擊點相關地查看樣品板的樣品包含區域的位置，並且可以據此調整(例如手工地或通過使用軟體)樣品板的位置，以確保雷射被發射時撞擊樣品包含區域(或樣品包含區域的任意特徵)。
在本實施例中，可以在樣品板的被照亮區域中的樣品被電離之前、期間或之後對該區域成像。此外，當樣品板被成像時，樣品板可以在樣品板表面的平面(即x-y平面)內移動，從而允許操作者識別希望電離的區域(例如樣品包含區域或樣品包含區域內的晶體包含區域)並且無需太多努力就可以將電離雷射引導至這些區域。
在另一實施例中，例如，可以對圖像進行分析，並且可以確定(手工或使用軟體)用於描述樣品板上的樣品的二維或三維形狀、尺寸和位置的樣品參數。樣品板的樣品參數可以被存儲在文件或存儲器中，並被離子源用於將雷射引導至該樣品板上的樣品包含區域。這樣的方法在2003年5月2日遞交的公布為US20040217278的共同待決美國專利申請10/429,234中作了一般性地詳細描述，這裡為了所有目將該專利申請的全部內容結合於此。
在特別感興趣的實施例中，所述方法被用在所謂的「成像質譜分析」方法中，在該方法中，生物樣品(例如可以是單個細胞或組織切片)被固定在基於基質的離子源的樣品板上。該樣品可以利用任意可獲得的手段獲取，包括切片或雷射捕獲顯微解剖。基質被添加到樣品中，並且可以使用能與基質相容的染色劑對樣品染色。利用本發明的方法產生的樣品的對焦圖像一般可以具有足夠細節(即可以具有足夠高的解析度)以允許樣品的特定區域被識別和電離。例如，對焦圖像可以示出染色區域、未染色區域、細胞器官、細胞、細胞類型或感興趣的切片的特定區域。該區域可以使用上述方法來電離，以提供關於該區域中的分子(例如多肽)的質量的信息。在替換實施例中，樣品的區域可以被隨意(例如隨機地)電離，並且從這些區域獲得的質量概況可以與在圖像上識別出的結構相關。成像質譜分析方法的細節可以在多種出版物中找到，包括但不局限於Rubakhin等的(Anal.Chem.2003 755374-5380)；Chaurand等的(Anal.Chem.2004 761145-1155)；Stoechli等的(Nat.Med.200 17493-496)；Masumori等的(Cancer Res.2001 612239-2249)；Chaurand等的(Proteomics 2001 11320-1236)和Palmer-Toy等的(Clin.Chem 2000461513-1516)，通過參考將這些出版物結合於此。這些方法可以被用於檢查正常和患病的細胞，例如包括癌細胞和患病細胞。
在另一實施例中，如圖7所示，本發明的方法可以被用於產生包含在存在於樣品板的表面上的三維透明樣品內的物體(例如植入樣品)的二維或三維高解析度圖像。該物體可以使用本發明的方法來識別，並且該物體可以在離子源的雷射下移動並被電離。如圖7所示，成像設備136結合上述方法被用於產生物體134的對焦圖像，該物體134處於在樣品板130上的三維透明基板132內部。
本發明通常被用在樣品質量分析的方法中，其中樣品可以是沉積或結晶在樣品板表面上的任意物質或多種物質的混合物。樣品通常包含一種或多種感興趣的成分。樣品可以從多種來源獲得，例如來自食品、環境物質、諸如從物體(例如植物體或動物體)分離的組織或流體之類的生物樣品或其任意生化片段，其中所述生物樣品例如包括但不局限於，血漿、血清、脊髓液、精液、淋巴液、皮膚的外切片、呼吸、腸內和泌尿生殖器的器官系統、眼淚、唾液、乳汁、血細胞、腫瘤、器官以及生物體外的細胞培養菌成分的樣品(包括但不局限於來源於細胞培養基成長過程中的條件培養基、推定被病毒感染的細胞、重組細胞和細胞成分)。
工具包與本發明結合使用的工具包也被提供。這種工具包包括上述組成部分中的任意一種，包括計算機可讀介質或可對焦的成像設備。該工具包還可以包含用於改進帶有成像設備的基於基質的離子源的指令或用於執行任意上述方法的指令，其中這些指令通常出現在與該工具包相關的材料上，例如一張或多張紙。
用於實施這些方法的指令通常被記錄在合適的記錄介質上。例如，指令可以被列印在諸如紙或塑料等的材料上。同樣，指令可以作為包裝說明書存在於工具包中，或存在於工具包的包裝物標籤中或其組件(即與包裝或分包裝相關聯)中等等。在其他實施例中，指令作為存在於合適的計算機可讀存儲介質(例如CD-ROM、磁碟等)上的電子存儲數據文件而出現。在其它實施例中，實際指令沒有存在於工具包中，而是提供例如經由網際網路從遠端源獲得指令的裝置。該實施例的示例是包括web地址的工具包，在所述web地址處可以查看指令和/或從其下載指令。對於指令，這種用於獲取指令的手段被記錄在合適的材料上。
實驗方式以下示例是為了向本領域普通技術人員提供關於如何實現和使用本發明的某些實施例的描述而提出的，並且這些示例不是要限制發明人所認為的其發明的範圍。
示例1以下方法使用了AP-MALDI樣品板的三個單獨的圖像。AP-MALDI樣品板被放置在AP-MALDI離子源內。這些圖像是使用黑白CCD照相機捕獲的，並被發送到程序以用於在個人計算機上顯示圖像。可以通過使用控制樣點位置的程序利用光標按鈕來移動樣品板(通過控制機動臺)。
第一圖像是在對焦到沉積的樣品的最左側部分時被拍攝的(參見圖8A)。樣品板並重新定位，並且在對焦到樣點中心區域時拍攝第二圖像(參見圖8B)。樣品板並重新定位，並且在對焦到樣點的最右側部分時拍攝第三圖像(參見圖8C)。
在個人計算機上，通過使用標準圖像分析軟體PAINTSHOP PROTM來可視化地檢查所有三個圖像。通過複製和粘貼將樣點的被認為對焦的部分組合起來以產生樣品在整體上對焦的圖像。最終的對焦圖像如圖8D所示。
然後，最終圖像被饋送到在個人計算機上運行的另一程序，該程序用於自動監測樣點位置。然後，該程序能夠找到樣點的確切中心位置，這在圖像沒完全對焦的情況下利用同樣程序無法實現的。
從上述結果和論述中顯而易見，本發明提供了一種用於產生樣品板上的樣品的對焦圖像的重要手段。因此，本發明代表了對質譜分析領域的重大貢獻。
本說明書中引用的所有出版物和專利都通過參考結合於此，就好像專門單獨指示出每個單獨的出版物或專利都通過參考結合於此一樣。引用任意公開物是因為該公開物在申請日前已公開，而不應解釋為許可由於在前發明而使本發明無權使該公開物的日期提前。
雖然已經參考本發明的特定實施例描述了本發明，但是本領域技術人員應該理解，在不脫離本發明的真實精神和範圍的情況下，可以作出各種改變並且可以對等同物進行替換。另外，可以作出很多修改，以使特定情形、材料、物質組合、過程、過程步驟或步驟適於本發明的目的、精神和範圍。所有這些修改都是在所附權利要求的範圍內。
權利要求
1.一種用於產生基於基質的離子源的樣品板上的區域的對焦圖像的方法，包括在成像設備的視場中定位所述區域；使用所述成像設備產生具有對焦區和離焦區的第一圖像；使用所述成像設備產生具有對焦區和離焦區的第二圖像；以及使用所述第一和第二圖像的所述對焦區生成最終對焦圖像。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述方法包括產生多於兩個具有對焦區的圖像。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述最終對焦圖像包括多個所述對焦區。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述第一圖像和所述第二圖像是通過改變所述成像設備相對於所述區域的位置而產生的。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述視場通過在所述樣品板表面的平面中移動所述樣品板而被改變。
6.如權利要求4所述的方法，其中所述方法包括改變所述成像設備的焦距。
7.如權利要求4所述的方法，其中所述方法包括相對所述成像設備移動所述樣品板；以及改變所述成像設備的焦距。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述最終對焦圖像是二維圖像。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述最終對焦圖像是三維圖像。
10.如權利要求1所述的方法，其中預定數目的圖像被組合以產生所述最終對焦圖像。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述第一圖像和所述第二圖像的圖像在預定位置上被組合在一起，以產生所述最終對焦圖像。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述第一圖像和所述第二圖像的對焦區是使用圖像分析軟體選擇出的，並且被組合以產生所述最終對焦圖像。
13.如權利要求1所述的方法，還包括在顯示器上顯示所述最終對焦圖像。
14.一種使基於基質的離子源中的樣品板上的樣品電離的方法，包括在成像設備的視場中定位所述樣品；使用所述成像設備產生具有對焦區和離焦區的第一圖像；使用所述成像設備產生具有對焦區和離焦區的第二圖像；使用所述第一和第二圖像的所述對焦區生成所述樣品的最終對焦圖像；以及使所述樣品電離。
15.如權利要求14所述的方法，還包括在所述基於基質的離子源中移動所述樣品板，以使所述樣品可以被電離。
16.一種計算機可讀介質，其包含用於產生基於基質的離子源中的區域的對焦圖像的程序，所述程序包括用於產生所述區域的具有不同對焦區的多個圖像的指令；以及用於使用所述圖像來生成所述區域的對焦圖像的指令。
17.如權利要求16所述的計算機可讀介質，其中所述指令使成像設備相對於所述區域移動。
18.如權利要求16所述的計算機可讀介質，其中所述指令改變所述成像設備的焦距。
19.如權利要求16所述的計算機可讀介質，還包括用於校正所述對焦圖像的任意幾何失真的指令。
20.如權利要求16所述的計算機可讀介質，還包括用於校正所述對焦圖像中的任意對比度差異的指令。
21.一種用於產生樣品板的區域的對焦圖像的系統，該系統包括包括成像設備的基於基質的離子源；以及包含程序的計算機，所述程序包括用於產生所述區域的具有不同對焦區的多個圖像的指令；以及用於通過使用所述多個圖像來生成所述區域的對焦圖像的指令。
22.如權利要求21所述的系統，還包括連接到所述成像設備的顯示器。
23.一種質譜分析系統，包括包括成像設備的基於基質的離子源；可操作地連結到所述基於基質的離子源的離子傳輸設備；連結到所述離子傳輸設備的質譜儀；以及包含程序的計算機，所述程序包括用於產生樣品板的區域的具有不同對焦區的多個圖像的指令；以及用於使用所述多個圖像來生成所述區域的對焦圖像的指令。
24.如權利要求23所述的質譜分析系統，其中所述質譜儀是單組四極質譜儀、三組四極質譜儀、二維離子阱質譜儀、三維離子阱質譜儀、飛行時間質譜儀、磁區質譜儀或傅立葉變換離子回旋加速共振質譜儀。
25.如權利要求23所述的質譜分析系統，其中所述基於基質的離子源是基質輔助雷射解吸/電離離子源。
26.如權利要求23所述的質譜分析系統，其中所述基質輔助雷射解吸/電離離子源工作於至少100mTorr的壓力。
27.如權利要求23所述的質譜分析系統，其中所述基質輔助雷射解吸/電離離子源工作於小於100mTorr的壓力。
全文摘要
本發明提供了一種方法，用於產生離子源的樣品板上區域的對焦圖像，該離子源例如是基於基質的離子源、或採用了其上沉積有樣品的樣品板的任意其他類型的離子源。該方法一般包括a)在成像設備的視場中定位樣品板的一個區域；b)產生該區域的具有不同對焦區的多個圖像；以及c)使用這多個圖像生成該區域的對焦圖像。該對焦圖像可以是二維的或三維的。本發明還提供了用於執行這些方法的系統和程序。
文檔編號G06K9/00GK1888880SQ20051013019
公開日2007年1月3日 申請日期2005年12月19日 優先權日2005年6月27日
發明者瓊-魯克·圖克, 格雷戈·歐瓦內 申請人:安捷倫科技有限公司