Sars核酸,蛋白質,疫苗以及它們的用途的製作方法

2023-08-07 16:23:26

專利名稱：Sars核酸,蛋白質,疫苗以及它們的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及病毒核酸序列，蛋白質和亞單位(核酸和重組蛋白)疫苗，更特別地，它涉及經過優化能在哺乳動物宿主細胞中表達的病毒核酸序列。
背景技術：
嚴重急性呼吸器官綜合症(SARS)是一種正在出現的傳染性疾病，它具有在人與人之間快速傳播的傾向(MMWR Morb Mortal Wkly Rep，52(12)255-6，2003；MMWR Morb Mortal Wkly Rep，52(12)241-6，248，2003；Lee Net al.，N Engl JMed，348(20)1986-94，2003；Poutanen et al.，N Engl J Med，348(20)1995-2005，2003)。現在已經確定一種新鑑定的冠狀病毒是它的病原體(Drosten et al.，N Engl J Med，348(20)1967-76，2003；Ksiazek et al.，N Engl JMed，348(20)1953-66，2003)。冠狀病毒具有特異性的由表面S糖蛋白寡聚物形成的表面外包膜突起。S蛋白是中和抗體的主要作用靶(Saif，VetMicrobiol，37(3-4)285-97，1993)。在冠狀病毒疾病(例如鳥傳染性支氣管炎病毒疾病和呼吸性牛冠狀病毒疾病)的幾種動物模型中已經顯示了體液免疫的保護效力(Lin et al.，Clin Diagn Lab Immunol 8(2)357-62，2001；Mondal andNaqi，Vet Immunol Immunopathol，79(1-2)31-40，2001；Wang et al.，Avian Dis，46(4)831-8，2002.18)。
最近公開的人SARS冠狀病毒(人SARS-CoV)序列顯示，該病毒代表一種新毒株(Drosten et al.，N Engl J Med，348(20)1967-76，2003；Ksiazek et al.，N Engl J Med，348(20)1953-66，2003)。雖然它和針對1型冠狀病毒的一些抗血清和單克隆抗體能發生血清反應，但其序列與其它毒株的序列趨異，因此將其歸類作為第四種血清型似乎是最好的。利用現有抗體進行中和的情況還沒有被報導。因為SARS流行病能快速傳播，死亡率達5％，而且在年老個體中死亡率更高，因此研發治療和預防它的藥物非常重要。這種感染的最嚴重的臨床結果與延長的病毒血症有關(Drosten et al.，N Engl J Med，348(20)1967-76，2003)。
對很可能患有SARS的個體的恢復期血清樣品的實驗室分析顯示，與感染細胞有高水平的特異性反應，並且在間接螢光抗體測試中從陰性反應轉變為陽性反應，或產生診斷反應(Ksiazek et al.，N Engl J Med，348(20)1953-66，2003)。相反，來自美國血液捐獻者和HCV 229E或OC43已知感染者的血清與針對這種新冠狀病毒的抗體的反應呈陰性。這些結果顯示這種病毒還沒有在人群中廣泛傳播(Ksiazek et al.，N Engl J Med，348(20)1953-66，2003)。
概述本發明部分基於可以利用下述核酸的經密碼子優化的變異體形式在合適宿主細胞中表達相應蛋白質的觀察結果，其中所述核酸編碼SARS-CoV刺突糖蛋白(S蛋白)，膜蛋白(M蛋白)，包膜蛋白(E蛋白)和核衣殼蛋白(N蛋白)。增強蛋白質的表達能提供大量可用於診斷和治療的SARS蛋白和其片段。編碼能在哺乳動物宿主細胞中有效表達的SARS-CoV抗原的核酸可以用於例如在宿主體內誘導針對這種抗原的免疫反應。在哺乳動物細胞中製備病毒蛋白能提供正確摺疊的、與天然結合配體形成寡聚體的、和/或具有天然翻譯後修飾例如糖基化修飾的SARS蛋白。這些特徵能增強免疫原性，因此能增強用這些蛋白(或編碼這些蛋白的核酸)免疫所帶來的保護效果。可以採用合成方式構建經密碼子優化的核酸，這樣就不必從活病毒中獲取核酸，因此能降低用SARS-CoV操作所引起的風險。
一方面，本發明特徵在於一種分離的核酸，該核酸包括編碼SARS-CoVS多肽或其片段，SARS-CoV M多肽或其片段，SARS-CoV E多肽或其片段，SARS-CoV N多肽或其片段的序列，其中對該序列進行了密碼子優化處理以便其表達在哺乳動物宿主中(例如在人宿主中，例如當序列是合成序列或人工序列的情況)。
在一個實施例中，所述序列編碼SARS Co-V S多肽或其片段，其中該序列(或其片段)包含與SEQ ID NO1中所列出的序列(或SEQ ID NO1的相應片段，例如編碼S蛋白1-535位胺基酸或11-535位胺基酸的片段)至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。在一個實施例中，所述序列編碼與S多肽天然或非天然相關的前導肽(例如異源前導肽)。在一個實施例中，所述序列編碼tPA前導肽(或另一種能促進所述多肽表達或分泌的前導肽)。
在一個實施例中，所述序列編碼S多肽的胞外區(例如SEQ ID NO2的1-1190位胺基酸，或缺少公認的前導肽的部分，例如SEQ ID NO2的12-1190位胺基酸)。
另一方面，本發明特徵在於一種分離的核酸，該核酸包括編碼SARS-CoV M多肽或其片段的序列，其中該序列包含與SEQ ID NO19中所列出的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。
另一方面，本發明特徵在於一種分離的核酸，該核酸包括編碼SARS-CoV E多肽或其片段的序列，其中該序列包含與SEQ ID NO21中所列出的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。
另一方面，本發明特徵在於一種分離的核酸，該核酸包括編碼SARS-CoV N多肽或其片段的序列，其中該序列包含與SEQ ID NO23中所列出的序列至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性。
另一方面，本發明特徵在於一種核酸表達載體，該載體包括編碼SARS-CoV S多肽，M多肽，E多肽，N多肽或它們的片段的序列，其中為了在哺乳動物宿主中表達，對該序列進行了密碼子優化處理。
另一方面，本發明特徵在於一種包含分離的核酸的組合物，其中分離的核酸包含(a)經密碼子優化的序列，其編碼SARS-CoV S多肽或其片段，SARS-CoV M多肽或其片段，SARS-CoV E多肽或其片段，SARS-CoV N多肽或其片段；(b)緊接上述核苷酸序列上遊的起始密碼子；(c)與所述經密碼子優化的序列操作性連接的哺乳動物啟動子；和(d)與所述核苷酸序列操作性連接的哺乳動物多腺苷酸化信號，其中所述啟動子指導編碼SARS-CoV多肽的mRNA的轉錄。所述組合物還可以包含佐劑。在一個實施例中，所述哺乳動物啟動子是巨細胞病毒立即早期啟動子。
在一個實施例中，多腺苷酸化信號來源於牛生長激素基因。在一個實施例中，組合物進一步包含有藥學上可接受的載體。在一個實施例中，組合物進一步含有適合皮內，肌內或黏膜施用的連接了所述分離的核酸的顆粒。
另一方面，本發明特徵在於一種含有這裡所述的核酸的分離的細胞。
另一方面，本發明特徵在於一種由這裡所述的核酸編碼的分離的多肽。
另一方面，本發明特徵在於一種能與這裡所述的多肽(例如SARS蛋白)特異性結合的分離的抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本發明特徵在於一種製備SARS-CoV多肽的方法，這種方法包括構建包含編碼SARS-CoV S多肽或其片段、SARS-CoV M多肽或其片段、SARS-CoV E多肽或其片段、SARS-CoV N多肽或其片段的序列的核酸、且編碼所述多肽的密碼子已經優化以便在宿主細胞中表達，在允許產生所述多肽的條件下在宿主細胞中表達所述核酸，分離所述多肽。
另一方面，本發明特徵在於一種在受試者體內誘導針對SARS-CoV多肽的免疫反應的方法，這種方法包括給受試者施用含有分離的核酸的組合物，其中分離的核酸包含(a)編碼SARS-CoV S多肽或其片段，SARS-CoVM多肽或其片段，SARS-CoV E多肽或其片段，SARS-CoV N多肽或其片段的經密碼子優化的序列；(b)緊接該核苷酸序列上遊的起始密碼子；(c)與所述經密碼子優化的序列操作性連接的哺乳動物啟動子；和(d)與所述核苷酸序列操作性連接的哺乳動物多腺苷酸化信號，其中所述啟動子指導編碼SARS-CoV多肽的mRNA的轉錄，其中組合物的施用量足以讓所述核酸表達SARS-CoV多肽，而且SARS-CoV多肽的表達水平足以在所述受試者體內誘導針對SARS的免疫反應。
本發明也描述了用於在受試者體內誘導針對SARS-CoV多肽的免疫反應的包含編碼SARS-CoV S多肽或其片段，SARS-CoV M多肽或其片段，SARS-CoV E多肽或其片段，SARS-CoV N多肽或其片段的序列的核酸，其中為了在受試者體內表達，已經對所述序列進行了密碼子優化。所述核酸可以包括這裡描述的經密碼子優化的核酸序列(例如編碼S蛋白或其片段的經密碼子優化的DNA序列，例如包含全長或部分SEQ ID NO1)。
本發明也描述了利用核酸來製備用於誘導受試者產生針對SARS-CoV多肽的免疫反應的藥劑的用途，其中所述核酸包含編碼SARS-CoV S多肽或其片段，SARS-CoV M多肽或其片段，SARS-CoV E多肽或其片段，SARS-CoV N多肽或其片段的序列，為了在受試者體內表達，已經對所述序列進行了密碼子優化。所述核酸可以包括這裡描述的經密碼子優化的序列(例如編碼S蛋白或其片段的經密碼子優化的DNA序列，例如包含全長或部分SEQ ID NO1)。
除非另外說明，這裡使用的任何技術和科學術語的含義與本發明所屬領域的普通技術人員的通常理解相同。雖然在實施或測試本發明時，可以使用那些與這裡描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但接下來還是描述了合適的方法和材料。所有這裡提到的公開出版物，專利申請，專利和其它參考文獻都全部引入作為參考。即使出現衝突，本發明的說明書，包括定義也能夠控制。另外，材料，方法和實施例只是為了解釋本發明，而不是為了限制本發明。
從接下來詳細的說明書和權利要求書中可以看出本發明的其它特徵和優點將是顯而易見的。


圖1是對SARS-CoV刺突糖蛋白和由這裡描述的核酸構建物編碼的經密碼子優化的S蛋白的描述。「tPA」指組織纖溶酶原前導序列。「TM」指跨膜區。「dTM」指缺少跨膜區的蛋白。S1，S2，S1.1，S1.2是S蛋白的片段。「ACE2 R」指S蛋白上的血管緊張素轉換酶2受體結合域。
圖2是描述測定結果的圖，其中測定是為了確定被編碼wt-S蛋白或tPA-S.dTM的經密碼子優化的DNA載體或單獨的載體免疫的兔的抗血清的結合力。箭頭表示給動物施用DNA的時間點。
圖3A和3B是描述測定結果的系列圖，其中測定是為了確定被編碼tPA-S.dTM，tPA-S1.1，tPA-S1.2，tPA-S2.dTM的經密碼子優化的DNA載體或單獨的載體免疫的兔的抗血清的反應性。在圖3A中，測定了對tPA-S蛋白的反應性，在圖3B中，測定了對tPA-S1.2的反應性。
圖4A描述了由多種經密碼子優化的DNA構建物表達的S蛋白抗原的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中利用被編碼tPA-S.dTM的經密碼子優化的DNA免疫的兔的抗血清進行探測。
圖4B描述了由多種經密碼子優化的DNA構建物表達的S蛋白抗原的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中利用已被編碼tPA-S1.1的經密碼子優化的DNA免疫的兔的抗血清進行探測。
圖4C描述了由多種經密碼子優化的DNA構建物表達的S蛋白抗原的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中利用已被編碼tPA-S1.2的經密碼子優化的DNA免疫的兔的抗血清進行探測。
圖4D描述了由多種經密碼子優化的DNA構建物表達的S蛋白抗原的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中利用已被編碼tPA-S2.dTM的經密碼子優化的DNA免疫的兔的抗血清進行探測。
圖4E描述了由多種經密碼子優化的DNA構建物表達的S蛋白抗原的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中利用針對S蛋白的抗血清進行探測。在SDS-PAGE之前用尿素處理待分析的S蛋白抗原A亞型。
圖5描述了經裂解的SARS-CoV原種或未感染的Vero E6細胞的SDS-PAGE和Westem印跡分析，其中利用已被編碼各種S蛋白片段的經密碼子優化的DNA免疫的兔的抗血清進行探測。LMP低分子量產物，HMC高分子量複合物。S預期的徹底糖基化的刺突蛋白。
圖6A-6C是培養皿的系列圖，其中培養皿中包含有模擬感染的Vero E6細胞(圖6A)，SARS-CoV感染4天後的Vero E6細胞(圖6B)和抗血清存在時培養的被SARS-CoV感染的Vero E6細胞，其中抗血清來自已被編碼S蛋白的經密碼子優化的DNA免疫的兔。
圖7描述了確定抗血清中中和抗體滴度的測定結果，其中從已用編碼S蛋白片段的經密碼子優化的DNA構建物(或單獨的載體)免疫的兔中收集抗血清。
圖8A-8B是描述SARS-CoV被抗血清中和的百分比的系列圖，其中抗血清是從已被編碼S蛋白片段的多種經密碼子優化的DNA構建物免疫的兔中收集的。圖8A描述已用tPA-S.dTM，tPA-S1，tPA-S2.dTM或單獨的載體免疫的動物的抗血清的測定結果。圖8B描述了已用tPA-S1.1，tPA-S1.2免疫的動物的抗血清或抽血前血清的測定結果。
圖9描述了多種S蛋白片段的SDS-PAGE和Western印跡分析，其中包括與SARS-CoV病毒粒子結合的S蛋白的片段。有一組蛋白樣品在SDS-PAGE前用N-糖苷酶F(PNGase F)處理。
圖10A和10B代表編碼全長SARS-CoV S蛋白的經密碼子優化的核苷酸序列。
圖11代表全長SARS-CoV S蛋白的胺基酸序列。
圖12代表編碼SARS-CoV S蛋白的1-535位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。
圖13代表編碼SARS-CoV S蛋白的1-535位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。核苷酸(NT)1-96編碼tPA前導序列；NT97-1608編碼S蛋白的一部分。
圖14代表編碼SARS-CoV S蛋白的534-798位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。NT1-96編碼tPA前導序列；NT97-804編碼S蛋白的一部分。
圖15代表編碼SARS-CoV S蛋白的797-1255位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。NT1-96編碼tPA前導序列；NT97-1380編碼S蛋白的一部分。
圖16代表編碼SARS-CoV M蛋白的1-222位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。
圖17代表編碼SARS-CoV E蛋白的1-77位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。
圖18代表編碼SARS-CoV N蛋白的1-424位胺基酸的經密碼子優化的核苷酸序列。
圖19A-19B代表SARS-CoV S蛋白的天然核苷酸序列(也參見GenBankAcc.No.AY278741)。
圖20代表SARS-CoV M蛋白的天然核苷酸序列(也參見GenBankAcc.No.AY278741)。
圖21代表SARS-CoV E蛋白的天然核苷酸序列(也參見GenBankAcc.No.AY278741)。
圖22代表SARS-CoV E蛋白的天然核苷酸序列(也參見GenBankAcc.No.AY278741)。
圖23代表SEQ ID NO3編碼的胺基酸序列。
圖24代表SEQ ID NO5編碼的胺基酸序列。
圖25代表SEQ ID NO7編碼的胺基酸序列。
圖26代表SEQ ID NO9編碼的胺基酸序列。
圖27代表SEQ ID NO11編碼的胺基酸序列。
圖28代表SEQ ID NO13編碼的胺基酸序列。
圖29代表SEQ ID NO15編碼的胺基酸序列。
圖30代表天然SARS-CoV S蛋白的胺基酸序列。
圖31代表天然SARS-CoV M蛋白的胺基酸序列。
圖32代表天然SARS-CoV E蛋白的胺基酸序列。
圖33代表天然SARS-CoV N蛋白的胺基酸序列。
在不同附圖中的相同的參考標記表示相同的元件。
發明詳述冠狀病毒會顯示由表面S糖蛋白寡聚物形成的刺突。這些蛋白能介導病毒與宿主細胞上的受體發生相互作用，使病毒進入細胞並發生融合，而且它們也是中和抗體的主要作用靶。S蛋白的有效表達在製備治療和診斷蛋白，以及在製備抗體，例如診斷，治療，預防和分析SARS冠狀病毒的抗體方面是有用的。其它的病毒蛋白在治療和診斷方面也有用。例如，膜蛋白(M)，包膜蛋白(E)和核衣殼蛋白(N)也可以用在冠狀病毒的研究和治療中。這些SARS病毒抗原中的每一種都可以作為以亞單位為基礎的單一成分(single-agent)或多成分(multi-agent)SARS預防疫苗製劑的組分。
這裡提供了編碼SARS-CoV S，M，E和N蛋白的經密碼子優化的核酸序列和構建這些序列的方法。本發明也描述了能在受試者體內表達這些蛋白的核酸疫苗，其中所述蛋白的表達濃度高到足以提供保護性免疫對抗隨後接觸的SARS。表達的蛋白質本身，表達蛋白的方法都可以用作重組蛋白SARS疫苗。可以用這些核酸序列和蛋白質來產生能識別SARS蛋白或其片段的抗體，這些抗體可用於診斷，預防和治療SARS。
為了更容易理本發明解，首先定義了一些術語。在詳細描述的說明書各處會列出其它的定義。
「亞單位」疫苗指這樣一種疫苗，其活性成分抗原只是病原體的一部分，例如具有多種蛋白的病原體的一種蛋白或該蛋白的片段。
「核酸疫苗」是這樣一種疫苗，其活性成分為至少一種分離的、編碼多肽抗原的核酸。
「重組蛋白疫苗」是這樣一種疫苗，其活性成分為至少一種通過重組表達產生的蛋白抗原。
「分離的核酸」是不含有在天然存在目的基因的生物體或病毒的基因組中該目的基因的側接基因的核酸。因此該術語包括整合到哺乳動物系統的自主表達質粒上的重組DNA。它還包括單獨(separate)的分子，例如cDNA，基因組片段，通過聚合酶鏈反應得到的片段或限制性酶切片段。它也包括作為雜合基因即融合蛋白編碼基因的一部分的重組核苷酸序列。分離的核酸實質上不含有其它細胞成分或病毒成分(例如不含有病毒載體的蛋白質部分)，或在利用重組技術製備時不含有培養基，在化學合成時，不含有化學前體或其它化學物質。
當表達控制序列被整合到其它核酸中時，它們是「操作性連接的」，因此它們能有效控制目的基因的表達。
「佐劑」是能增強核酸疫苗引發免疫反應的能力的化合物或化合物的混合物。
「哺乳動物啟動子」是能驅動編碼SARS蛋白的mRNA在哺乳動物細胞中轉錄的任何不論來源的核酸序列。
「哺乳動物多腺苷酸化信號」是能夠終止編碼SARS蛋白的mRNA在哺乳動物細胞中轉錄的任何不論來源的核酸序列。
術語「S蛋白」指由SARS-CoV編碼的刺突糖蛋白。「蛋白質」可以和「多肽」互換使用，既包括體外製備的蛋白質，也包括將核酸序列施用到宿主動物或人受試者體內後在活體內表達的蛋白質。預計的前導肽對應於SEQ ID NO18的1-11位的胺基酸。預計的配體結合區對應於SEQ ID NO10的318-510位的胺基酸。預計的成熟S蛋白的胞外區對應於SEQ ID NO18的12-1190位的胺基酸，它是可溶解的，由細胞分泌。預計的跨膜區對應於SEQ ID NO18的1192-1226位的胺基酸。預計的胞漿區對應於SEQ IDNO18的1227-1255位的胺基酸。
「抗SARS蛋白抗體」或「抗SARS抗體」是能與SARS蛋白相互作用(例如結合)的抗體。這裡所述的術語「進行治療」或「治療」被定義為將編碼SARS-CoV S，M，E或N蛋白的核酸或其片段或抗SARS抗體給受試者，例如病人應用或施用，或者給來自受試者，例如病人的組織或細胞應用，再將所述組織或細胞送回病人體內。也能施用核酸編碼的蛋白質或特異性與蛋白質結合的抗體。核酸可單獨施用或者與第二種試劑一起施用。受試者可以是患有病症(例如病毒病症，如SARS)，出現疾病症狀或具有易患病體質的病人。所述治療能夠治療，治癒，緩解，減輕，改變，補救，改善，緩和，改進或影響疾病或其症狀。
這裡所述的能有效治療疾病的核酸，蛋白質或抗SARS蛋白抗體的量，或「有效治療量」指以單一劑量或多劑量形式給受試者施用、有效治療SARS-CoV感染者的量。這裡所述的能有效預防疾病的核酸，蛋白質或抗SARS蛋白抗體的量，或「預防有效量」指以單一劑量或多劑量形式給受試者施用、有效預防或延緩SARS疾病的發生或復發，或治療其症狀的量。
這裡所述的「特異性結合」指抗體的下列能力(1)特異性生物化學分析，例如Western印跡分析中的特異性條帶顯示的結合SARS蛋白的能力，或(2)通過反應性與SARS蛋白結合的能力，其中結合SARS蛋白的反應性比結合非SARS蛋白抗原(例如BSA，酪蛋白)的反應性至少高兩倍。
這裡所述的術語「抗體」指包含至少一個，優選兩個重鏈(H)可變區(這裡簡稱為VH)，和至少一個，優選兩個輕鏈(L)可變區(這裡簡稱為VL)的蛋白質。VH和VL區可以進一步地被細分為高變區，也稱為「互補決定區」(「CDR」)，其間間插更加保守的稱為「框架區」(FR)的區域。已經精確限定框架區和CDRs的範圍(參見Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242，and Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.，196901-917，在此引入作為參考)。優選地，每一條VH和VL由三個CDR和四個FR組成，它們從氨基末端到羧基末端按如下順序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
抗體的VH或VL鏈可以進一步包含全部或部分重鏈或輕鏈恆定區。在一個實施例中，抗體是兩條重鏈免疫球蛋白鏈和兩條輕鏈免疫球蛋白邊的四聚體，其中重鏈和輕鏈免疫球蛋白鏈相互連接，例如可通過二硫鍵相互連接。重鏈恆定區包括三個域CH1，CH2和CH3。輕鏈恆定區由一個域CL組成。重鏈和輕鏈的可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區通常介導抗體與宿主組織或因子的結合，其中宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。術語「抗體」包括IgA，IgG，IgE，IgD，IgM型(以及它們的亞型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ或λ型。
這裡所述的術語「免疫球蛋白」指實質上由免疫球蛋白基因編碼的一條或多條多肽組成的蛋白質。已經識別的人免疫球蛋白基因包括κ，λ，α(IgA1和IgA2)，γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，δ，ε，μ恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白「輕鏈」(大約25Kd或214個胺基酸)由位於氨基末端的可變區基因(大約110個胺基酸)，以及位於羧基末端的κ或λ恆定區基因編碼。類似地，全長免疫球蛋白「重鏈」(大約50Kd或446個胺基酸)由可變區基因(大約116個胺基酸)和前面提及的其它恆定區基因，例如γ(編碼大約330個胺基酸)編碼。術語「免疫球蛋白」包括具有非人類來源的CDRs和低抗原性框架區的免疫球蛋白，其中非人類來源的CDRs實例有來源於非人類抗體的CDRs，例如來源於小鼠免疫球蛋白或另一種非人類免疫球蛋白的CDRs，來源於共有序列或採用任何產生多樣性的其它方法得到的CDRs；其中框架區與非人類框架區相比，在人體內具有較低的抗原性，例如當CDRs來源於非人類免疫球蛋白時，該框架區比選出非人類CDRs的那些免疫球蛋白的非人類框架區具有更低抗原性。免疫球蛋白的框架區可以是人類的框架區，被修飾的降低了在人體內抗原性的人源化的非人類，例如小鼠的框架區，或者是合成的框架區，例如共有序列。
這裡所述的術語「同種型」指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgG1)。
這裡所述的術語，抗體的「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「片段」)指能與SARS蛋白(例如S蛋白)特異性結合的抗體部分，例如含有一條或多條非全長免疫球蛋白鏈，但能與SARS蛋白特異性結合的分子。包含在術語抗體的「抗原結合片段」範圍內的結合片段的實例包括(i)Fab片段，是由VL，VH，CL和CH1區組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，是包含兩個通過二硫鍵在鉸鏈區連接的Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1區組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH區組成的Fv片段；(v)由VH區組成的dAb片段(Wardet al.，(1989)Nature 341544-546)和(vi)具有足以進行特異性結合的框架的分離的互補決定區(CDR)，例如可變區的抗原結合部分。可以利用重組技術，通過合成接頭將輕鏈可變區的抗原結合部分和重鏈可變區的抗原結合部分連結起來，例如將Fv片段的兩個區VL和VH連結起來，使它們形成單個蛋白鏈，其中VL和VH區配對形成單價分子(也稱為單鏈Fv(scFv)；例如參見，Bird et al.(1988)Science，242423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，855879-5883)。也希望將這種單鏈抗體包含在術語抗體的「抗原結合片段」的範圍內。採用本領域技術人員公知的常規技術就能獲得這些抗體片段，可採用篩選完整抗體的方法來篩選這些片段的有用性。
術語「單特異性抗體」指對具體標靶，例如抗原表位表現出單一結合專一性和親和力的抗體。這一術語包括「單克隆抗體」或「單克隆抗體合劑」，這裡使用的「單克隆抗體合劑」指單一分子組成的抗體製劑或該抗體片段的製劑。
術語「多克隆抗體」指抗體製劑，可以是動物或人血清，或者體外製備的抗體，它能與一個SARS抗原上的一種以上的抗原表位結合，或者能結合多個抗原上的多種抗原表位。
這裡所述的術語「重組抗體」指通過重組方法製備，表達，創造或分離的抗體，例如將重組表達載體轉染到宿主細胞中表達的抗體，從重組的組合抗體文庫中分離的抗體，從導入了人免疫球蛋白基因的轉基因動物(例如小鼠)中分離的抗體，或者是採用任何涉及將人免疫球蛋白基因序列與其它DNA序列拼接的其它方法製備，表達，創造或分離的抗體。這種重組抗體包括人源化的，CDR嫁接的，嵌合的，體外產生(例如噬菌體展示)的抗體，它們可選地包括來源於人類免疫球蛋白序列的恆定區。
這裡使用的術語「實質上相同」(或「實質上同源」)指第一種胺基酸或核苷酸序列包含了足量的與第二種胺基酸或核苷酸序列相同或等價(例如具有相似的側鏈，例如保守胺基酸替換)的胺基酸殘基或核苷酸，使得第一種和第二種胺基酸或核苷酸序列具有相似的活性。對抗體來說，指第二種抗體具有與第一種抗體相同的特異性，而且其親和力是第一種抗體的至少50％。
按如下方式來計算兩條序列之間的「同源性」或「同一性」。為了進行最佳的比較，先比對序列(例如，為了達到最佳比對，可以在第一種和第二種胺基酸或核苷酸序列的一條或所有兩條中引入間隙，為了進行對照比較可以忽略非同源序列)。在不同的實施例中，參考序列用於比較的長度是該參考序列長度的至少50％，例如至少60％，70％，80％，90％或100％。接著將相應胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一種序列的一個位點被第二種序列相應位點上的相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，這兩個分子在這一位點相同(這裡使用的胺基酸或核苷酸「同一性」等同於胺基酸或核苷酸「同源性」)。兩條序列之間的同一性百分比是兩條序列共有的相同位點數量的函數，它考慮了為使兩條序列最佳比對而引入的間隙的數量及每一間隙的長度。
利用數學算法可以完成序列的比較，並確定兩條序列的同源性百分比。利用Needleman and Wunsch(1970)，J.Mol.Biol.，48444-453中的算法和Blossum 62評分矩陣來確定兩個胺基酸序列之間同源性百分比，該算法整合在GCG軟體包的GAP程序中，Blossum 62評分的間隙記罰分12分，間隙延伸記罰分4分，移碼間隙記罰分5分。
這裡所述的術語「在低嚴謹，中嚴謹，高嚴謹或超高嚴謹條件下雜交」描述了雜交和洗滌的條件。在Molecular Biology，John Wiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中的Current Protocols中能找到實施雜交反應的指南，在此將其引入作為參考。也可以使用這篇參考文獻中描述的水性和非水性方法中的一種。這裡提到的特異性雜交條件指如下條件1)低嚴謹雜交條件為，大約45℃時在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中進行雜交，接著在至少50℃(低嚴謹條件中洗滌的溫度可增加到55℃)的條件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌兩次；2)中嚴謹雜交條件為，大約45℃時在6XSSC中進行雜交，接著在60℃的條件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴謹雜交條件為，大約45℃時在6XSSC中進行雜交，接著在65℃的條件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次；4)超高嚴謹雜交條件為，65℃時在0.5M磷酸鈉，7％SDS中雜交，接著在65℃的條件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次。
應理解這裡描述的抗體或其抗原結合片段還可具有另外的保守或非必需胺基酸替換，這種替換對多肽的功能不產生實質性影響。採用Bowie et al.，(1990)Science，2471306-1310中描述的方法能確定一種具體的替換是否能被耐受，即對所需生物學特性無負面影響，例如結合活性。「保守胺基酸替換」指胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基替換。本領域已經確定具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括鹼性側鏈胺基酸(例如賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側鏈的胺基酸(例如天門冬氨酸，穀氨酸)，不帶電荷的極性側鏈胺基酸(例如天門冬醯胺，穀氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非極性側鏈胺基酸(例如甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β分支側鏈胺基酸(例如蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳香族側鏈胺基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。
「非必需」胺基酸殘基指能從多肽(例如結合劑，如抗體)的野生型序列轉變而來且並不變實質上改變生物學活性的殘基，但「必需」胺基酸殘基的轉變會導致生物學活性發生變化。
構建優化序列病毒蛋白質和天然的低水平表達的蛋白質給利用重組技術進行有效表達提出了挑戰。病毒蛋白質通常表現出在哺乳動物宿主細胞中被無效翻譯的密碼子選擇(codon usage)。改變病毒序列天然的密碼子有助於更強地表達這些蛋白。已經在許多物種中確定了使蛋白質豐富表達所需的密碼子，這能為密碼子替換提供指導。為了增強HIV env和gag病毒抗原的表達，已經對這些基因進行了密碼子優化。利用常規方法，例如定向誘變或通過化學合成構建出對應於該優化序列的寡核苷酸，就可以完成病毒密碼子的替換。例如，參見Mirzabekov et al.，J Biol Chem.，274(40)28745-50，1999。
優化也應該包括對影響寡聚物合成和/或表達的其它因素的考慮。例如，應避免使用會導致預計的RNAs具有高度二級結構的序列。富集AT和GC的序列會干擾DNA的合成，因此也應避免使用。對表達不利的其它基序包括內部的TATA盒，chi-位點，核糖體進入位點，原核抑制基序(procaryainhibitory motif)，隱藏的剪接供體和受體位點，以及分支點。計算機軟體能夠鑑別這些序列，手動構建經密碼子優化的序列能排除這些序列。
核酸，載體和宿主細胞一方面，本發明涉及能用來重組表達優化核酸序列和用作疫苗的分離的核酸，載體和宿主細胞組合物。
另一方面，本發明特徵在於宿主細胞和載體(例如重組表達載體)，這些宿主細胞和載體中含有核酸，例如編碼SARS蛋白的優化序列，或編碼抗-SARS蛋白抗體或其抗原結合片段的序列。
可以使用原核或真核宿主細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在這裡可以互換使用。這一術語不僅指具體的受試細胞，也指這種細胞的子代或潛在的子代。在以後的傳代過程中，因為突變或環境的影響，子代可能會發生某些修飾，這種子代實際上與親代細胞並不相同，但仍將它們包括在這裡使用的這一術語的範圍中。宿主細胞可以是任何原核細胞，例如細菌細胞，如大腸桿菌，或者是真核細胞，例如昆蟲細胞，酵母或哺乳動物細胞(例如培養的細胞或細胞系，例如靈長類動物細胞如Vero細胞或人類細胞)。其它合適的宿主細胞本領域技術人員已經公知。
另一方面，本發明特徵在於載體，例如重組表達載體。可以設計本發明的重組表達載體使其能夠在原核或真核細胞中表達SARS蛋白，抗-SARS蛋白抗體或其抗原結合片段。例如可以在大腸桿菌，昆蟲細胞(例如使用杆狀病毒表達載體)，酵母細胞或哺乳動物細胞中表達這裡描述的新多肽。Goeddel，(1990)Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA中進一步討論了合適的宿主細胞。或者可在體外轉錄和翻譯重組表達載體，例如使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。
蛋白質在原核細胞中的表達通常利用含有能指導融合或非融合蛋白表達的組成型或誘導型啟動子的載體在大腸桿菌中進行。融合載體將多個胺基酸加入到其中編碼的蛋白質或抗體上，通常加入到重組抗體的恆定區。
使用哺乳動物表達載體可以在哺乳動物細胞中表達經密碼子優化的核酸。哺乳動物表達載體的實例包括pCDM8(Seed，B.Nature 329840，1987)和pMT2PC(Kaufman et al.EMBO J 6187-195，1987)。在哺乳動物細胞中使用時，通常由病毒調控元件來提供表達載體的控制功能。例如，通常使用的啟動子來源於多瘤病毒，腺病毒2，巨細胞病毒和猴病毒40。其它適合原核和真核細胞的表達系統可以參見Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual. 2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989的16，17章。
在一個實施例中，重組的哺乳動物表達載體能指導核酸優先在特定的細胞類型中表達(例如可使用組織特異性調控元件來表達核酸)。組織特異性調控元件本領域技術人員已經公知。合適的組織特異性啟動子的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝特異性的；Pinkert et al.，Genes Dev.，1268-277，1987)，淋巴樣-特異性啟動子(Calame and Eaton，Adv.Immunol.，43235-275，1988)，特別是T細胞受體啟動子(Winoto and Baltimore，EMBO J，8729-733，1989)和免疫球蛋白啟動子(Banerji et al.，Cell，33729-740，1983；Queen and Baltimore，Cell，33741-748，1983)，神經元特異性啟動子(例如神經微絲啟動子；Byme and Ruddle，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 865473-5477，1989)，胰腺特異性啟動子(Edlund et al.，Science，230912-916，1985)和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子；美國專利4,873,316和歐洲專利申請264,166)。也包括調節發育的啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel and Gruss，Science，249374-379，1990)和甲胎蛋白啟動子(Campesand Tilghman，Genes Dev.，3537-546，1989)。
除了編碼序列外，這裡描述的新重組表達載體還帶有被操作性連接的調控序列，這些調控序列控制蛋白質/抗體基因在宿主細胞中的表達。
核酸疫苗由這種新方法或組合物中所用的經密碼子優化的核酸編碼的SARS多肽是與天然存在的SARS蛋白，例如SARS S，M，E或N蛋白共有抗原表位的任何蛋白質或多肽。通過胺基酸序列中的添加和替換，SARS多肽可以不同於野生型序列，但其仍保留SARS多肽的生物學功能(例如S蛋白的受體結合)。可以基於相關殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性，親水性和/或兩親性的相似性進行胺基酸替換。
非極性(疏水性)胺基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門冬醯胺和穀氨醯胺。正電荷(鹼性)胺基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸。負電荷(酸性)胺基酸包括天門冬氨酸和穀氨酸。
優選的殘基變化是保守改變，例如鹼性胺基酸替換為另一個鹼性胺基酸。
在誘導免疫反應方面有用的核酸包括至少三個部分(1)開始於起始密碼子的SARS蛋白編碼序列，(2)為了表達SARS蛋白，操作性地與編碼序列連接的哺乳動物轉錄啟動子，和(3)操作性地與編碼序列連接，可終止啟動子驅動的轉錄的哺乳動物多腺苷酸化信號。在本文的上下文中，「哺乳動物」啟動子或多腺苷酸化信號不必是來源於哺乳動物的核酸序列。例如，已經公知，哺乳動物啟動子或多腺苷酸化信號可以來源於病毒。
核酸載體可以任選地包含其它序列，例如增強子元件，剪接信號，終止和多腺苷酸化信號，病毒複製子和細菌質粒序列。可以採用本領域公知的方法製備這些載體。例如，可以將編碼目的SARS蛋白的核酸插入到各種可商業獲得的表達載體中。例如，參見Invitrogen Catalog，1998。另外，Yasutomi et al.，J Virol，70678-681(1996)中描述了特別構建的用於核酸疫苗的載體。
施用核酸本文所述新核酸可以在促進核酸吸收或將免疫系統細胞募集到接種位點的物質存在時給個體施用或接種。例如，已經顯示包裹在微粒中的核酸能促進核酸載體活體內表達輪狀病毒蛋白(美國專利5,620,896)。
可以通過任何腸胃外路徑，例如靜脈內，腹膜內，皮內，皮下，肺內或肌肉內途徑給哺乳動物接種核酸。也可以口服，或利用基因槍進行顆粒轟擊，或利用其它不使用針的遞送系統來施用這種新的核酸疫苗。因為哺乳動物具有成比例的大肌肉塊，而且經皮直接注射就能方便的接觸這些肌肉塊，因此肌肉是遞送和表達編碼SARS蛋白的核酸的有用組織。可以通過多次和/或重複注射，使相當大劑量的核酸積存在肌肉中。多次注射可用於時間周期較長的治療。
利用常規的顆粒轟擊施用核酸的方法可以用來遞送核酸，使SARS蛋白在皮膚內或黏膜表面表達。利用商業購買的裝置能實施顆粒轟擊。例如可以利用商業上可獲得的幾種「基因槍」中的一種，Accell II(PowderJectVaccines，Inc.，Middleton，WI)顆粒轟擊裝置來遞送被核酸包被的金珠。也可以利用Helios Gene Gun(Bio-Rad)來施用這種DNA顆粒。在包括下列文獻的來源中能找到有關顆粒轟擊裝置和方法的信息Yang et al.，Proc NatlAcad Sci USA，879568(1990)；Yang，CRC Crit Rev Biotechnol，12335(1992)；Richmond et al.，Virology，230265-274(1997)；Mustafa et al.，Virology，229269-278(1997)；Livingston et al.，Infect Immun，66322-329(1998)和Chenget al.，Proc Natl Acad Sci USA，904455(1993)。
在一些實施例中，通過黏膜途徑對個體進行接種。可以採用多種方法，包括利用含有核酸的滴鼻劑，吸入劑，栓劑或微球，將編碼SARS蛋白的核酸施用到黏膜表面。或者，可以通過溶劑萃取技術，例如Jones et al.，InfectImmun，64489(1996)和Jones et al.，Vaccine，15814(1997)中描述的技術將含有經密碼子優化的基因的核酸載體包裹在聚(丙交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide)，PLG)微粒中。例如，將核酸和溶解在二氯甲烷中的PLG一起乳化，用水性聚乙烯醇(乳化穩定劑)乳化這種油包水乳液，形成水包(油包水)的復乳劑(double emulsion)。將這種復乳劑加入到大量的水中分散出二氯甲烷，使微滴硬化形成微粒。通過離心收集這些微滴或微粒，將其洗滌數次去除聚乙烯醇和殘留的溶劑，最後將這些微滴或微粒凍幹。這些包含核酸的微粒的平均粒徑為0.5um。為了檢測核酸含量，可以在100℃將微粒溶解在0.1M NaOH中10分鐘。測定A260，從標準曲線計算出核酸的含量。摻入到微粒中的核酸為1.76g-2.7g核酸/毫克PLG。
將含有大約1-100ug核酸的微粒懸浮在大約0.1-1ml的pH為8.5的0.1M的碳酸氫鈉中，經口服給小鼠或人施用。不論給藥途徑如何，都可以在施用核酸前，施用核酸期間或施用核酸後應用佐劑。佐劑能增加細胞對核酸的攝取，也能增加來自核酸的抗原在細胞中的表達，並能誘導抗原提呈細胞侵潤表達抗原的組織區域，或能增強淋巴細胞的抗原特異性反應。
評價疫苗效能將這裡描述的疫苗應用於人類之前，先要利用動物進行效能測試。在效能測試實例中，通過肌肉內注射來免疫小鼠。在起始免疫之後或者在任意加強免疫之後，監測小鼠(和陰性對照)出現疫苗誘導的SARS特異性免疫反應的指徵。在Townsend et al.，J Virol，713365-3374(1997)；Kuhober et al.，Jlmmunol，1563687-3695(1996)；Kuhrober et al.，Int Immunol，91203-1212(1997)；Geissler et al.，Gastroenterology，1121307-1320(1997)和Sallberg etal.，J Virol，715295-5303(1997)中描述了測量免疫反應的方法。
利用公知方法可以確定免疫動物體內的抗-SARS血清抗體水平。利用容易獲得的參考標準將抗體濃度標準化。
可以按照如下方法來實施細胞毒活性測定。將從免疫小鼠中獲得的脾細胞懸浮在補充了10％胎牛血清和5×10-5M 2-巰基乙醇的完全MEM中。在培養5天後，收集細胞毒活性效應淋巴細胞群，在96孔圓底培養板中用靶細胞來實施5小時51Cr釋放測定。效應細胞和靶細胞的比例可以變化。溶解百分比定義為(實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放)×100。
抗體本發明還提供了抗SARS S，M，E或N蛋白，和/或S，M，E或N蛋白的特異性片段，例如S蛋白的胞外區的抗體或其抗原結合片段。
許多種抗SARS蛋白抗體或其抗原結合片段在本發明的方法中都有用。抗體可以是不同的同種型，包括IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA1，IgA2，IgD或IgE。優選的抗體是IgG同種型，例如IgG1。抗體分子可以是全長的抗體(例如IgG1或IgG4抗體)，或者只包含抗原結合片段(例如Fab，F(ab′)2，Fv或單鏈Fv片段)。這些抗體分子包括單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人抗體，人源化抗體以及前述抗體的抗原結合片段。
在這裡描述的新方法中可以使用單克隆抗體。利用包括常規的單克隆抗體方法學在內的多種技術，例如Kohler and Milstein，Nature 256495(1975)中描述的標準的體細胞雜交技術可以製備單克隆抗體。可以通過免疫動物或人類受試者來製備多克隆抗體。多克隆抗體的優點包括對具體病原體的抗原特異性寬。一般可參見，Harlow，E.and Lane，D.(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。
這裡描述的有用的免疫原包括所述的SARS蛋白，例如優化的核酸序列表達的SARS蛋白。
在這裡描述的方法中有用的抗-SARS蛋白抗體或其片段也可以是被編碼目標抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈的DNA轉化的宿主細胞產生的重組抗體。可以利用公知的基因工程技術來製備重組抗體。例如可以通過克隆編碼目標抗體的免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核苷酸序列，例如cDNA或基因組DNA來製備重組抗體。接著將編碼那些多肽的核苷酸序列插入到表達載體中，使兩種基因都能操作性地與它們自己的轉錄和翻譯表達控制序列連接。選擇表達載體和表達控制序列，使它們與使用的表達宿主相適應。比較典型的是將兩種基因都插入到同一表達載體中。可以使用原核或真核宿主細胞。
優選在真核宿主細胞中表達，因為與原核細胞相比，真核細胞更傾向於組裝和分泌正確摺疊的免疫活性抗體。但是可參照已經公知的方法(Kimand Baldwin，″Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteinsand the Mechanism of Protein Folding，″Ann.Rev.Biochem.，51，pp.459-89(1982))來復原因為非正確摺疊而無活性的抗體。宿主細胞也可能只產生完整抗體的一部分，例如輕鏈二聚體或重鏈二聚體，它們也是抗體同系物。
我們將了解，對上述方法作一些改變是有用的。例如可能需要用編碼抗體輕鏈或重鏈(不是輕鏈和重鏈)的DNA轉化宿主細胞。也可以利用重組DNA技術去除編碼並非結合必需的輕鏈或/和重鏈的DNA的一部分或全部，例如可以通過刪除具體胺基酸來修飾恆定區。這種截短的DNA分子表達的分子在這裡描述的方法中是有用的。另外，也可以製備雙功能抗體，使其一條輕鏈和一條重鏈是抗SARS蛋白抗體，而另一條輕鏈和另一條重鏈則特異性地針對一種與SARS蛋白不同的抗原，或針對同一蛋白的另一種表位，或針對另外一種SARS蛋白的另一種表位。
也可以利用本領域公知的重組DNA技術來製備嵌合抗體。例如，用限制性內切酶消化編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子Fc恆定區的基因以去除編碼鼠Fc的區域，替換編碼人Fc恆定區的基因的等同部分(參見Robinson et al.，國際專利申請PCT/US86/02269；Akira，et al.，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison et al.，歐洲專利申請173,494；Neuberger et al.，國際申請WO 86/01533；Cabilly et al.美國專利4,816,567；Cabilly et al.，歐洲專利申請125,023；Better et al.(1988 Science，2401041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS，843439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol。1393521-3526；Sun et al.，(1987)PNAS，84214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.，47999-1005；Wood et al.，(1985)Nature，314446-449；和Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.，801553-1559)。
可以利用本領域已知的方法使抗體或免疫球蛋白鏈人源化。例如一旦獲得鼠抗體，就可以對其可變區進行測序。可以確定CDRs和框架殘基的位置(參見，Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of lmmunologicallnterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242，和Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.，196901-917，在此引入作為參考)。輕鏈和重鏈可變區可以任選與相應的恆定區連接。
可以利用本領域公認的方法對鼠抗體進行測序。利用CDR嫁接或CDR替換可以製備人源化或CDR-嫁接的抗體分子或免疫球蛋白，其中免疫球蛋白鏈的一個，兩個或所有CDRs可以被替換。例如，參見美國專利5,225,539；Jones et al.，1986，Nature，321552-525；Verhoeyan et al.，1988，Science，2391534；Beidler et al.，1988，J.Immunol.，1414053-4060和Winter，美國專利5,225,539，因此特別引入所有這些文獻的內容作為參考。
Winter描述了一種可以用來製備人源化抗-SARS蛋白抗體的CDR-嫁接方法(1987年3月26日提交的英國專利申請GB2188638A；Winter US5,225,539)，特別引入這些文獻的內容作為參考。可以用非人CDR的至少一部分替換具體人抗體的所有CDRs，或者只用非人CDR替換部分CDRs。只有人源化抗體與預定抗原結合所必需的CDRs是必需替換的。
用來自人Fv可變區的等同序列替換Fv可變區中不直接參與結合抗原的序列，可以製備人源化抗體。Morrison，S.L.，1985，Science，2291202-1207和Oi et al.，1986，BioTechniques，4214，以及Queen et al.的美國專利5,585,089；5,693,761和5,693,762中提供了製備人源化抗體的一般方法，在此引入所有這些文獻的內容作為參考。那些方法包括分離，操作(manipulate)和表達編碼來自至少一條重鏈或輕鏈的全部或部分免疫球蛋白Fv可變區的核酸序列。這種核酸的來源本領域技術人員已經公知，例如，可以如上所述從產生抗指定目標的抗體的雜交瘤中獲得這種核酸。接著可以將編碼人源化抗體或其片段的重組DNA克隆到合適的表達載體中。
這裡的抗體也包括已經替換，刪除或添加特定胺基酸的人源化抗體。尤其是，優選的人源化抗體在框架區中具有胺基酸替換，例如為了改善與抗原的結合而進行的替換。舉例來說，可以用相應的供體胺基酸來替換人源化免疫球蛋白鏈上選定的少量受體框架區殘基。優選的替換位點包括與CDR相鄰的胺基酸殘基，或能與CDR相互作用的胺基酸殘基(例如參見，美國專利5,585,089)。在美國專利5,585,089(例如，12-16欄)中描述了從供體中選擇胺基酸的標準，在此將其內容引入作為參考。受體框架區可以是成熟的人抗體框架區序列或共有序列。
這裡使用的術語「共有序列」指相關序列家族中最經常出現的胺基酸(或核苷酸)形成的序列(例如，參見Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在一個蛋白家族中，共有序列上的每一個位點都被這個家族中該位點最經常出現的胺基酸佔據。如果兩個胺基酸出現的頻率相等，那麼其中的任何一個胺基酸都可以包含在共有序列中。「共有框架」指共有免疫球蛋白序列中的框架區。在1992年12月23日公開的Padlan et al.的EP 519596A1中描述了使抗體人源化的其它技術。
這裡提供的抗體也包括轉基因小鼠產生的抗體，其中的轉基因編碼免疫球蛋白重鏈或輕鏈的一個或多個片段。例如參見，
發明者盧山, 周吳德惠, 王世霞 申請人:麻薩諸塞大學