可用作治療性抗腫瘤疫苗的多肽的製作方法
2023-08-07 06:22:46 2
專利名稱：可用作治療性抗腫瘤疫苗的多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽，具體說是粘蛋白MUC1來源的多肽，及其在製備治療腫瘤的藥物(疫苗)中的用途。
背景技術：
治療性疫苗，其形式屬於疫苗類，而作用則屬藥品，是目前最具開發前景的新型疫苗技術。其作用機制與傳統的預防性疫苗十分相似，都是利用蛋白等物質的免疫原性來激發人類機體的免疫系統去抵禦疾病的發生。傳統的預防性疫苗多以產生抗病原菌的抗體為主要目的，而抗腫瘤治療性疫苗除產生傳統的抗腫瘤細胞抗體外，更主要的目的是激發自身的細胞免疫系統產生抗腫瘤的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，這種具有高度特異性的細胞毒性T淋巴細胞能起到「吃」掉腫瘤細胞的作用而達到治療的效果。
用於製造抗腫瘤治療性疫苗的抗原多為在腫瘤細胞表面特異性表達的生物大分子，以蛋白為主。利用這類腫瘤細胞表面抗原研製的腫瘤治療性疫苗可分四大類腫瘤細胞疫苗、重組蛋白疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗。
多肽治療性疫苗是各種治療性疫苗中研究最多、效果最好、技術最成熟的抗腫瘤治療性疫苗。多肽疫苗已成為目前抗腫瘤的一項新策略，研發中的生物技術抗癌新藥，多肽抗腫瘤治療性疫苗所佔的比例最大。
MUC1是一種粘蛋白。粘蛋白是一類分布廣泛的生物大分子細胞表面糖蛋白，在正常上皮細胞表面分布相當廣泛。粘蛋白的糖基化程度很高，50％到90％的分子量來自分子的多糖部分；其功能是保護和潤滑上皮表面，同時還有介導信號傳導和細胞粘附的功能。
MUC1是粘蛋白家族中最早被克隆的一個，其基因定位於染色體1q21。其外周結構由蛋白骨架和糖鏈組成。蛋白骨架含有空間結構穩定一致的由20個胺基酸組成的連續重複序列，構成許多相同的、重複的表位。這些表位可被抗體識別，也可作為超抗原與T細胞受體多價結合而活化T細胞。
MUC1在許多腫瘤細胞表面分布異常豐富，但與正常人體細胞表面的MUC1分子在結構、組成、以及多糖化的程度上有明顯的不同。在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌及肺癌等腺癌中MUC1呈異常表達。具體體現在以下三個方面a)表達量增高，可超過正常細胞的10倍以上，且增加的程度與腫瘤的惡性程度成正比；b)極性分布消失，整個腺上皮細胞表面均表達MUC1，甚至胞漿中也有表達；c)糖鏈的糖基化不完全，糖鏈變短，分支變少，結構簡單，導致新糖鍊表位形成和肽鍊表位暴露，使MUC1的多肽骨架成為可被免疫系統識別的腫瘤抗原。
這種明顯的病理學差異，使此粘蛋白分子成為理想的抗癌目標，是目前最有臨床潛力的抗腫瘤靶標之一。
世界上已有多個國家的企業在研究與MUC1有關的抗癌藥，主要分抗腫瘤疫苗和抗MUC1單克隆抗體兩大類，而MUC1多肽治療性疫苗最被看好。
由於MUC1的腫瘤細胞病理特異性和MUC1抗癌藥前期開發的成功，使之成為抗癌藥研究開發的熱點之一。在2001年11月3日，德國和加拿大的兩家製藥公司發表聯合新聞，他們將聯合開發MUC1抗癌藥。由於公司的兩種MUC1衍生抗癌藥物臨床進展結果喜人，公司將暫時擱置其它研究項目，集中精力開發這兩種抗癌藥。這條新聞的發布，可以從一個側面說明，MUC1抗癌藥的開發進展前景十分樂觀。目前在美國、加拿大、英國、德國和澳大利亞都有與MUC1有關的抗癌藥開發研究，其開發進展從臨床前到臨床三期不等。MUC1衍生的抗癌藥物主要屬兩大類治療性疫苗和單克隆抗體，以治療性疫苗為主。而治療性疫苗又分兩種MUC1多肽類和MUC1多糖類。雖然多糖類開發較早，且已進入三期臨床中期，但多糖的合成繁瑣且難度大，產量低，成本高。自從人們對人體的細胞免疫系統有了更深入的了解並掌握了一定的激活機理後，多肽疫苗的開發便成了研究的重點，目前國際上已有多家生物技術公司和製藥企業在MUC1多肽治療性疫苗的開發上投入巨大的人力和財力，是目前抗癌藥開發中被認為最有希望項目之一。
在歐美等國，多肽類治療性疫苗MUC1抗癌藥根據其針對的癌症類型不同，所處的研究進展也不一樣，其分布從臨床前到二期臨床後期不等。另外，還有幾家美國公司以MUC1為抗原，成功研製了抗腫瘤抗體，經過抗體工程的人化改造，也已經進入二期臨床。但由於單克隆抗體往往不能「清除」腫瘤細胞，而MUC1治療性疫苗能激發產生癌細胞特異的毒性淋巴細胞，從而起到「清除」腫瘤細胞效果，因此，治療性疫苗類MUC1抗癌藥更被看好。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗腫瘤治療性疫苗，尤其一種粘蛋白MUC1來源的多肽。
MUC1在腺細胞和上皮細胞來源的腫瘤細胞表面分布非常豐富。在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、前列腺癌及肺癌等腺癌中MUC1呈異常表達。MUC1的多肽骨架具較強的抗原表位，但由於外周巨大的糖鏈結構對其的掩蓋作用，其抗原表位不能暴露而難以表現其抗原性。這一缺陷可由體外合成多肽加以克服。MUC1的多肽骨架中含有許多連續重複序列，可非MHC(主要組織相容性複合體)限制性活化CTL，特異性殺傷腫瘤細胞。本發明的MUC1抗腫瘤疫苗是設計了一個含有特殊胺基酸序列的多肽來效仿其連續重複序列來誘發針對腫瘤細胞的特異性細胞免疫應答，從而消除了糖基化對肽鍊表位免疫原性的影響。因此，本發明的多肽具有非常強的免疫原性，除產生傳統的抗腫瘤細胞抗體外，更重要的是激發自身的細胞免疫系統產生抗腫瘤的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，這種高度特異的淋巴細胞可殺死腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。
本發明的技術方案包括以下內容1、一種多肽，其胺基酸序列如序列表中序列1所示，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或與之具有60％以上，尤其70％以上，更尤其90％以上的一致性的多肽。
2、以上項1的多肽的活性片段，其胺基酸序列如序列表中序列2所示。
3、以上項1的多肽的活性片段，其胺基酸序列如序列表中序列3所示。
4、以上項1的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
5、以上項4的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
6、以上項2的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
7、以上項6的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
8、以上項3的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
9、以上項8的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
10、一種疫苗組合物，包括以上項1的多肽，任選的一種或多種免疫佐劑，和藥學可接受的賦型劑。
所述保守性變異多肽，或其活性片段是指保留與此多肽相同的生物學功能或活性的多肽。
本發明的多肽可以合成，或獲取編碼這些多肽的基因，構建該基因的表達載體，利用基因重組技術生產本發明的重組多肽。本發明的多肽的合成例如可以用Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)化學固相(solid phase)合成方法在cGMP條件下進行，由多肽合成儀完成。這個過程包括一系列的偶聯和去保護(deprotection/coupling)過程，直到設計序列完成為止。合成完畢後，多肽被從固相樹脂上切割下來，再由高壓液相柱層析分離純化。
圖1顯示了在16肽合成程序中，Fmoc被用來保護α-氨基基團，Fmoc與α-氨基形成的鍵可以用鹼如哌啶(piperidine)來去保護。
圖2顯示了固相多肽合成程序，圖中1、接上樹脂，2、去保護，3、偶聯，4、重複去保護和偶聯過程，5、切割和去保護，6、肽+樹脂。
本發明研究了16肽對乳腺癌病人的效果，結果發現，16肽對患者有很強的T細胞免疫效應，對病人有緩解痛苦，延長帶瘤生存時間的效果。
本發明研究了24肽與16肽對T細胞的激活能力和對γ-幹擾素生成的影響，結果發現24肽與16肽均具有T細胞激活能力和促進γ-幹擾素分泌的作用，其中24肽的作用優於16肽。
本發明研究了24肽的抗腫瘤效果，結果發現24肽顯示出了極其有效的抗腫瘤免疫性。小鼠經24肽(50微克和5微克)皮下注射免疫後，即便小鼠受到多次腫瘤細胞的攻擊，仍然不會長出腫瘤，而注射16肽的小鼠則長出多個腫瘤，空白對照組則長出更多的腫瘤。這一結果表明24肽能預防腫瘤的發生，而且比16肽更具有預防腫瘤功能。
本發明還研究了25肽的抗腫瘤效果。25肽形成了又一個T細胞抗原表位，使之比24肽更有細胞免疫的功能。結果發現，25肽對小鼠T細胞活性和γ-幹擾素分泌的影響超過了24肽，25肽在激活人類T細胞方面也優於24肽。
本發明此外進行了25肽的毒理試驗，結果發現25肽無明顯的副作用和毒性反應，是安全的。
本發明還進行了25肽的一期和二期臨床試驗，結果表明，本發明的多肽成功地激活了細胞免疫體系，而對體液免疫無明顯影響，這是別的抗腫瘤治療性疫苗等腫瘤免疫療法所罕見的，而且療效與劑量成正相關，與對照組比，病人的生存期明顯增加。如聖地牙哥區域，對照組的平均生存期為7.4個月，而試驗組的平均生存期18.3個月。
本發明的多肽可以單獨給藥，或以組合物的形式給藥。本發明的疫苗組合物可以包括本發明的多肽，任選的一種或多種免疫佐劑，以及常用的賦型劑。
免疫佐劑為本領域常用的那些，例如胞壁醯肽，細菌溶解產物，弗氏佐劑等。賦型劑也是本領域的常用的那些，這些賦型劑對本領域的技術人員來說是公知的。
本發明的多肽適合以注射方式給藥，尤其適合以皮下注射方式給藥。多肽的一次給藥量通常為5-2000ug，通常每星期或每個月給藥一次。
本發明的多肽可以用於預防腫瘤，尤其上皮細胞或腺細胞來源的腫瘤的發生，也可以用於治療腫瘤，適宜於腫瘤的早期、中期、晚期中的任何一期。本發明的多肽也可以與其它腫瘤治療方式，例如化療、放療、手術等結合使用。
實施例實施例1、16肽的合成多肽的合成過程主要由多肽合成儀完成。肽的合成步驟主要是先保護氨基、羧基和側鏈，再接肽，其胺基酸序列如序列3所示。
本發明的多肽的合成例如可以用Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)化學固相(solid phase)合成方法在cGMP條件下進行，由多肽合成儀完成。這個過程包括一系列的偶聯和去保護(coupling/deprotection)過程，直到設計序列完成為止。在這一程序中，Fmoc被用來保護α-氨基基團。Fmoc與α-氨基形成的鍵可以用鹼如哌啶(piperidine)來去保護(見圖1)。
固相合成主要是在不溶的高分子樹脂(Polymer)上進行反應(見圖2)，樹脂的活性基團羥基(-OH)與Fmoc保護的胺基酸的羧基作用，形成了穩定的酯鍵，把要合成的肽掛到了樹脂上。再用哌啶處理去掉Fmoc保護基團，去保護後的固相胺基酸的氨基再與下一個Fmoc保護的胺基酸結合形成肽鍵，以此類推，直到設計多肽序列完成。合成完畢後，多肽被從固相樹脂上用三氟乙酸切割下來，再由反向高壓液相柱層析分離純化。
實施例2、24肽的合成24肽的合成過程與16肽相似。在16肽的基礎上，按照已有的序列，通過混合酸酐法等方法接上一個胺基酸形成17肽或接上二肽形成18肽，再接上二肽形成20肽，依次類推最終形成24肽。所得肽的序列如序列2所示。
實施例3、25肽的合成25肽的合成過程與16肽、24肽合成過程和方法完全一致。可按所提供的序列和接肽的方法進行合成。所得肽的序列如序列1所示。
本發明多肽的效果試驗一、16肽一期臨床試驗結果16肽的一期臨床的試驗對象為乳腺癌病人。試驗在兩個地方進行，一個是加拿大的埃曼特(Edmonton)，另一個為美國的聖地牙哥(San Diego)。在加拿大有16位病人參加了，在美國有14位病人參加。兩地的試驗結果表明，16肽是一種能被病人生理接受、無明顯副作用的抗癌藥。
經過16肽治療，在聖地牙哥，16個病人中13人有較強的T細胞免疫反應，佔參加試驗病人的78.5％，其中7位病人有很強的T細胞免疫效應(高CTL)，佔參加試驗病人總數的44％；在埃曼特，14位病人中也有11位有較強的T細胞免疫效應，也佔了參加試驗病人的78.5％，其中高CTL效應有6位，佔參加病人的42.8％。重要的是，這些CTL效應給病人減輕了痛苦，延長了他們的生命。綜合兩地的試驗結果，高CTL的病人的平均生命比低CTL的病人延長近兩倍，從11.4個月到38.2個月，試驗結束時仍健在的病人比例從9.1％提高到了46.2％，效果十分明顯。具體試驗結果請看表1。
表1 16肽臨床一期結果
二、24肽與16肽對T細胞的激活能力和對γ-幹擾素生成的影響分別用5微克及50微克24肽和16肽注射小鼠後，觀察小鼠所產生的T細胞免疫效應。檢測指標為以MUC1為抗原的特異T細胞的激活程度，表2中的結果表明，24肽對T細胞的激活至少優於16肽3到5倍。
表2 24肽與16肽對T細胞的激活能力的比較
γ-幹擾素是細胞免疫系統的產物，γ-幹擾素產生的高低，標誌著T細胞免疫系統的活性，即活性越高，γ-幹擾素的水平也越高。表3展示了小鼠在注射24肽和16肽之後，γ-幹擾素的水平差異。24肽注射後產生的γ-幹擾素高出16肽一百多倍。這些結果表明24肽比16肽更有臨床潛力。
表3 24肽與16肽對γ-幹擾素分泌的影響
三、24肽的抗腫瘤效果在小鼠肺癌腫瘤模型中，24肽顯示出了極其有效的抗腫瘤免疫性。小鼠經24肽(50微克和5微克)皮下注射免疫後，即便小鼠受到多次腫瘤細胞的攻擊，仍然不會長出腫瘤(見表4)，而注射16肽的小鼠則長出多個腫瘤，空白對照組(PBS)則長出更多的腫瘤。這一結果表明24肽能預防腫瘤的發生，而且比16肽更具有預防腫瘤功能。
表4 24肽的抗腫瘤效果
當小鼠預先誘發腫瘤，再以24肽注射治療(見表5)，實驗結果表明24肽可以延長小鼠的生命。治療組小鼠在63天後還100％成活，但對照組的小鼠只有20％的成活率。經治療的小鼠生命的延續，是24肽腫瘤效果的體現。
表5 24肽可延長小鼠的生命
注在第6天，第18天，第36天分三次對小鼠進行皮下注射24肽藥物疫苗，小鼠腫瘤為乳腺癌細胞接種所至。
四、25肽的抗腫瘤效果如前所述，我們在24肽的基礎上再加了一個經生物信息學篩選的胺基酸，雖然只增加了一個胺基酸，但這一胺基酸的加入卻增加了新的T細胞抗原表位，從而增加了整個多肽激活T細胞的免疫原性。在小鼠模型中，25肽在激發T細胞免疫和對γ-幹擾素的影響都超過了24肽。表6表明了不同劑量的25肽對小鼠T細胞免疫活性和γ-幹擾素分泌的影響。此實驗證明400微克計量不管是在T細胞免激活還是在γ-幹擾素分泌水平方面都明顯好於40微克的劑量，但T細胞激活和幹擾素分泌對劑量的敏感程度不同，表明劑量選擇的必要性。
表6 25肽對小鼠T細胞活性和γ-幹擾素分泌的影響
25肽在激活人類T細胞方面，也有類似的優越性(見表7)。10微克的25肽所產生的T細胞活性為21000 CPM，而10微克的24肽所激活的T細胞活性則只有8000 CPM，25肽的作用為24肽的2.5倍。從表7還可以看出，人體T細胞激活活性與25肽的劑量成比例，說明適當的增加劑量是提高免疫活性的一種手段。
表7 多肽對人T細胞刺激作用
五、25肽的毒理實驗25肽的重複注射毒理實驗是在C57BL/6J小鼠上進行、按美國食品及醫藥管理局的有關規定操作的。結果表明，不同劑量的25肽每星期注射小鼠，連續注射8個星期，沒有發現任何毒性反應及其它副作用。同時，我們還用狗進行了類似的實驗，也無明顯的副作用和毒性反應。因此，25肽MUC1多肽抗腫瘤疫苗是安全的。
六、注射方式對臨床效果的影響不同的注射方式往往對臨床結果影響很大。25肽用不同的注射方式所產生的效果也不相同。我們用100微克和200微克25肽用C57/B6小鼠進行了靜脈、腹腔、及皮下注射，把分離到的T淋巴毒性細胞與癌細胞以不同的細胞比例進行混合，然後比較T細胞對帶有MUC1抗原的癌細胞的殺傷力(見表8)。結果表明皮下注射所產生的T淋巴細胞對腫瘤細胞最有殺傷力，說明皮下注射在所研究的三種注射方式中對細胞免疫系統最具效果和特異性。
表8 注射方式對細胞免疫系統的影響
七、25肽的臨床一期試驗25肽的臨床一期試驗是以肺癌為目標，共選擇病人16人，皮下注射。以第一次注射為第1個星期計算，注射時間分別為第1、3、5、和第10個星期，共注射4次。注射的劑量分別為20微克和200微克。病人分組情況如下三個病人為A組，注射劑量為20微克；另三個病人為B組，注射劑量為200微克；剩下的十位病人為C組，用隨機組合方式，一半的病人注射20微克，另一半病人注射200微克。這樣組合的最終結果為8個病人接受20微克的劑量，另8個病人接受200微克的劑量。
試驗結果表明，25肽對病人無明顯不良副作用。
16個病人中，其中12人被檢測到MUC1特異的T淋巴毒性細胞(CTL)，其中12人中的5人，有很強的MUC1專一CTL活性，更為吃驚的是，這些有效強CTL活性的病人，幾乎檢測不到抗MUC1多肽的抗體，說明25肽脂質劑型成功地激活了細胞免疫體系，這是別的抗腫瘤治療性疫苗等腫瘤免疫療法所罕見的。
如將16位病人按劑量分配計算生存時間，200微克劑量的明顯高於低劑量的20微克(見表9)，從20微克的平均生存期5.5月提高到200微克的14.6個月。從這一結果也可以引申，劑量高於200微克或許更有臨床效果。
表9 25肽臨床一期病人生存狀況
*Kaplan-Meier計算法八、25肽的臨床二期試驗介於以下三種原因對二期臨床的劑量和注射頻率進行了調整1)臨床前和臨床一期結果表明，劑量越大效果越好；2)多家實驗室近來證明強烈且持久的CTL效應需要大劑量的T細胞表位抗原；3)T細胞對癌細胞的抑制和殺傷作用，需要有T細胞抗原的長期和重複激活。調整後的二期臨床劑量為每針1000微克，注射頻率增加到每星期一次，共注射8次。
二期臨床共徵集肺癌病人166人(含IIa和IIb)，為多中心雙盲臨床設計。目前，臨床試驗已基本完成，初步結果表明1)1000微克對MUC1特異的CTL激活在病人中的百分比明顯高於一期的20微克和200微克，聖地牙哥區域有近87％的病人有MUC1特異的CTL產生。其中，近50％的病人MUC1特異的CTL活性較高。
2)與對照組比，病人的生存期明顯增加。如聖地牙哥區域，對照組的平均生存期為7.4個月，而試驗組的平均生存期18.3個月。
SEQUENCE LISTING110梅州宸溪藥業有限公司120可用作治療性抗腫瘤疫苗的多肽130
1603170PatentIn version 3.1210121125212PRT213人工合成4001Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg1 5 10 15Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro20 25210221124212PRT213人工合成4002Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg1 5 10 15Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro20210321116
212PRT213人工合成4003Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg1 5 10 1權利要求
1.一種多肽，其胺基酸序列如序列表中序列1所示，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或與之具有60％以上，尤其70％以上，更尤其90％以上的一致性的多肽。
2.權利要求1的多肽的活性片段，其胺基酸序列如序列表中序列2所示。
3.權利要求1的多肽的活性片段，其胺基酸序列如序列表中序列3所示。
4.權利要求1的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
5.權利要求4的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
6.權利要求2的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
7.權利要求6的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
8.權利要求3的多肽在製備治療腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤的藥物(包括治療性疫苗)中的用途。
9.權利要求8的用途，其中所述腺細胞或上皮細胞來源的腫瘤為乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌或肺癌。
10.一種疫苗組合物，包括權利要求1的多肽，任選的一種或多種免疫佐劑，和藥學可接受的賦型劑。
全文摘要
本發明涉及一種多肽，具體說是粘蛋白MUC1來源的多肽，及其在製備治療腫瘤的藥物(疫苗)中的用途。
文檔編號A61K39/00GK1611512SQ200310102299
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月31日 優先權日2003年10月31日
發明者郭宏亮 申請人:梅州宸溪藥業有限公司