高純度胰激肽原酶的製備方法及其藥物製劑的製作方法
2023-08-08 05:14:51 2
專利名稱：高純度胰激肽原酶的製備方法及其藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及高純度胰激肽原酶的製備方法，具體地說涉及採用免疫親和層析法製備的高純度胰激肽原酶。
本發明還涉及採用本發明方法製備的高純度胰激肽原酶及其製劑。
背景技術：
胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又稱為胰激肽釋放酶(PancreaticKallikrein)是一類內切型蛋白水解酶，存在於哺乳動物體內的多種組織，尤以胰臟中含量最為豐富。在體內作用於激肽原，使其釋放出激肽，從而發揮出一系列的藥理作用使微血管擴張，改善外周血液循環；促進前列腺素分泌，擴張小動脈，增加腎血管流量；激活纖溶酶系統，使纖維蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。臨床上主要用於微循環障礙引起的腎病變及眼底供血障礙、高血壓症、腦動脈硬化和腦動脈血栓、冠心病及其它閉塞性周圍血管性疾病的治療。
國家衛生部藥典會一九九八年編制的藥品標準二部第六冊(生化藥品)第一分冊中收載了胰激肽原酶原料藥及其製劑，國家衛生部批准作為生化藥品執行部頒藥品標準。該標準規定胰激肽原酶系自豬胰中提取的蛋白酶，幹品效價每lmg不得少於50單位，比活不得少於300單位/mg蛋白。由於純度較低，只有腸溶片和凍乾粉針劑兩種劑型，供口服和肌內注射給藥。腸溶片有20單位和60單位兩種規格，一次120～240單位，一日360～720單位空腹服用；凍乾粉針劑有10單位、20單位和40單位三種規格，一日10～40單位，一日1次或隔日1次肌內注射。已公布的上海惠海生化製藥廠申請的專利(申請號00119540.9)，用胰蛋白酶抑制劑為配基與瓊脂糖結合親和層析純化獲得的胰激肽原酶單位效價為250～300單位/mg幹品，比活800～1000單位/mg蛋白。日本申請的專利(申請號86104618)，將人尿濃縮後用聚氨基葡聚糖吸附的方法獲得純度為8.2單位/mg的胰激肽原酶粗品，再用抑肽酶—瓊脂糖親和層析獲得828單位/mg蛋白的胰激肽原酶。但是這些產品對其組成未作介紹，也未見成功的產品上市。
針對上述胰激肽原酶製劑，由於純度較低，安全上的限制只能用於口服和肌內注射，使其應用範圍、適應症及其療效受到很大限制。
發明內容
本發明的一個目的在於提供一種高純度胰激肽原酶的製備方法，利用免疫親和層析法製備得到了高純度的胰激肽原酶。
本發明的另一目的在於提供使用本發明方法製備的高純度胰激肽原酶。
本發明的再一目的在於提供含有本發明的高純度胰激肽原酶的藥物。
根據本發明的一方面，製備高純度胰激肽原酶的方法，包括下述步驟1)含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟初步純化、分離，獲得主要成分為胰激肽原酶的活性組分1；2)將所述活性組分1進一步純化，獲得活性組分2；3)以所述活性組分2作為抗原，製備抗胰激肽原酶特異性抗體；4)將所述製備得到的抗胰激肽原酶特異性抗體與親和層析載體結合，製備抗體親和層析柱；5)以所述抗體親和層析柱分離純化步驟1)中的活性組分1，獲得高純度胰激肽原酶。
本發明的方法中，將抗原抗體反應與親和層析技術結合，從含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟中將胰激肽原酶分離純化，製備得到純度高的胰激肽原酶。該方法中，首先需製備獲得針對胰激肽原酶的特異性抗體，再將該特異性抗體與適宜的親和層析載體結合，製備成抗體親和層析柱，利用該抗體親和層析柱可對原料進行純化，製備高純度的胰激肽原酶。
在本發明方法中，針對胰激肽原酶的特異性抗體可以採用多種方法製備，在本發明的一個具體實施方案中，首先以胰激肽原酶為抗原免疫小鼠，獲得含抗胰激肽原酶抗體的小鼠抗血清，同時將該胰激肽原酶與親和層析載體結合，製備成抗原親和層析柱，將小鼠抗血清上抗原親和層析柱，利用結合於親和層析載體上的抗原蛋白與血清中的抗體特異結合，獲得純化的特異性抗體。在本發明的另一個具體實施方案中，可以採用單克隆抗體技術來製備本發明的胰激肽原酶的特異性抗體，將經胰激肽原酶免疫後的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，獲得雜交瘤細胞，篩選分泌胰激肽原酶抗體的雜交瘤細胞建株，由此可獲得穩定的胰激肽原酶的特異性抗體。
將製備獲得的抗胰激肽原酶特異性抗體與適宜的親和層析載體結合，製備成抗體親和層析柱，使用該抗體親和層析柱即可對原料進行分離純化，製備高純度的胰激肽原酶。
在本發明方法中，為了獲得高純度的胰激肽原酶，可以採用對原料進行分步純化的方法，例如，在本發明的一個具體實施方案中，首先將原料胰臟進行透析截留一定分子量的成分，然後將獲得的樣品通過離子交換層析進行初步純化，獲得活性組分1，該活性組分1再經本發明的抗體親和層析柱純化，即可獲得高純度的胰激肽原酶。
用作抗原的胰激肽原酶最好使用純度較高的胰激肽原酶，在本發明方法中，該用作抗原的胰激肽原酶可以通過將上述初步純化的活性組分1進一步經過製備型高效液相色譜(HPLC)的分離而獲得，這樣獲得的胰激肽原酶(活性組分2)可以用作免疫小鼠的抗原和製備抗原親和層析柱的抗原使用。
本發明方法中用作親和層析柱的載體的材料可以使用各種適宜的載體材料，優選的載體材料可以使用多糖基質，例如Sepharose 4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠，在使用前可以先將載體活化，本發明的實施方案中，使用溴化氰作為活化劑，將製備得到的抗原或特異性抗體偶聯到活化了的載體上，即可製備抗原親和層析柱與抗體親和層析柱。
根據本發明的一方面，提供通過本發明方法製備的高純度胰激肽原酶，其具有以下特性比活性為每毫克蛋白800單位以上；高效液相色譜法檢測，為單一組分，主峰面積大於95％，保留時間為7.8±0.5min。
SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量為34～44千道爾頓；胺基酸序列分析，N-末端15個胺基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
根據本發明的再一方面，提供含有本發明高純度胰激肽原酶的藥物製劑，以本發明的高純度胰激肽原酶為藥效成分，添加藥學上可接受的藥用輔料製備得到適於臨床應用各種藥物製劑，這些製劑的劑型包括但不限於片劑、膠囊劑、小容量注射劑、凍乾粉針劑及專供靜脈注射和靜脈滴注用的大輸液或凍幹製劑。例如，注射用胰激肽原酶(凍幹靜脈注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶注射液(靜脈注射用胰激肽原酶)、胰激肽原酶腸溶膠囊以及胰激肽原酶腸溶片等。
本發明採用免疫親和層析技術，從胰臟中提取的激肽原酶純度高，獲得的產品比活高、純度高，不含或僅含少量雜質，使用安全，能達到靜脈給藥的要求。與口服與肌注給藥相比，靜脈給藥可使藥品的有效成分全部直接進入血液，縮短吸收過程並減少損耗，因而藥效迅速，療程縮短，減少患者的痛苦並能節省醫藥費用；尤其適用於急性心腦血管栓塞性疾病的搶救，可以贏得寶貴的救治時間，提高治癒率減少病死率。本發明高純度胰激肽原酶的開發擴大了該品的適應症與使用範圍。
附圖簡要說明
圖1為本發明方法中製備活性組分1的陰離子交換柱層析紫外吸收圖譜；圖2為本發明方法中抗胰激肽原酶特異性抗體純化過程記錄儀圖譜；圖3為本發明方法中製備高純度胰激肽原酶的親和層析流程記錄儀圖譜；圖4為本發明製備的高純度胰激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖5為本發明製備的另一批次的高純度胰激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖6為本發明製備的又一批次的高純度激肽原酶高效液相色譜圖譜；圖7為胰激肽原酶SDS-聚丙烯醯胺凝較電泳圖譜圖中泳道1、2、4、5、6、7、9、10為胰激肽原酶樣品；泳道3、8為分子量標準蛋白質(分子量範圍為14,000～97,400，其組成及分子量為兔磷酸化酶B 97,400，牛血清白蛋白66,200，兔肌動蛋白43,000，牛碳酸酐酶31,000，胰蛋白酶抑制劑20,100，雞蛋清溶菌酶14,400)發明的具體實施方式
高純度胰激肽原酶的製備1、胰激肽原酶粗品的提取新鮮或冷凍的豬胰或牛胰臟稱重後，用水清洗乾淨，置消毒容器內。加1～3倍(W/V)生理鹽水製成勻漿。3000～4000轉/分鐘離心20～40分鐘取上清液。上清液經超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍幹即為胰激肽原酶粗品。
2、離子交換層析初步純化胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩衝液溶解，2500～3500轉/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉澱加少量緩衝液再次溶解，離心取上清。合併兩次上清液，上陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose)，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩衝液平衡洗脫至基線，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩衝液進行梯度洗脫，收集活性峰，得活性組份1。活性組分1的主要成分為胰激肽原酶，具胰激肽原酶活性，根據SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳的主要帶計算的分子量與胰激肽原酶吻合。此流程用280nm紫外檢測儀檢測，並用記錄儀記錄，如圖1所示。
3、用作抗原的胰激肽原酶的製備將離子交換層析收集的活性組分1濃縮，用製備型高效液相色譜分離，收集活性組分，並定性，得胰激肽原酶樣品(活性組分2)。其具胰激肽原酶活性，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳顯示為一條帶，計算的分子量與胰激肽原酶標準品吻合；HPLC檢測為單一組分，保留時間與胰激肽原酶標準品吻合。
4、免疫親和層析製備胰激肽原酶特異性抗體(1)親和層析柱的製備稱2g活化的Sephose-4B，加300ml 1mol/L的HCL充分攪拌使之膨脹，另取30mg胰激肽原酶溶於0.1mol/L Na2CO3(含0.5mol/l NaCL)pH8.3緩衝液中。將上述Sephose-4B與胰激肽原酶溶液混合，在室溫攪拌2h，用0.1mol/LpH8.3Na2CO3(含0.5mol/l NaCL)緩衝液充分洗滌後，再用0.1mol/L Tris-HCL緩衝液(pH8.30)再洗一次，加同一緩衝液，於室溫攪拌過夜。備用。
(2)小鼠抗血清製備用上述活性組分2(50～500μg/ml)與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠(中檢所實驗動物中心)皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在採血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫
(3)製備抗胰激肽原酶特異性抗體取上述免疫小鼠血清，將血清樣品上抗原親和層析柱，用結合在凝膠上的抗原蛋白與樣品中的抗體特異性結合，純化得到特異性抗體。具體步驟為用平衡液(0.02MTris-HCL緩衝液，pH＝7.2)平衡抗原親和層析柱後，將血清樣品上抗原親和層析柱，用平衡液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，用洗脫液(0.02MTris-HCL緩衝液，pH＝7.2，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脫，收集活性組分，如圖2所示。將收集到的活性組分用透析袋(截留分子量為10000，對聚乙二醇濃縮)濃縮後，冷凍乾燥，即為抗胰激肽原酶特異性抗體。
5.單克隆抗體技術製備胰激肽原酶特異性抗體(1)免疫用上述活性組分2(50～500μg/ml)與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫4～6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
(2)細胞融合取經免疫的BALA/c小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按(5～10)∶1的比例混合，加入分子量40000～60000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
(3)特異雜交瘤細胞篩選將接種細胞混合液的細胞培養板置於5％ CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此可獲得穩定的抗體。
6、抗體親和層析柱的製備選擇瓊脂糖4B、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠作為親和層析的載體，用溴化氰活化該載體；取上述由免疫親和層析或單克隆抗體技術製備的抗體100mg溶於20ml硼酸緩衝液中，過濾，濾液加至活化的瓊脂糖4B中，在10℃下攪拌反應18小時，次日裝柱，用10倍柱體積的pH10.2硼酸緩衝液以5～6ml/min流速洗滌柱體，收集流出液，然後再依次用5倍柱體積的pH10.00.1mol/L的乙醇胺溶液及0.1mol/L的硼酸緩衝液(pH8.0)充分洗滌，最後用pH7.4的0.1mol/L磷酸緩衝液洗滌平衡，即得到抗體親和層析柱。該柱可重複使用200次以上，用20％的乙醇可長期保存。
7、胰激肽原酶的製備將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩衝液(0.02MTris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上抗體親和層析柱，用該緩衝液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫(0.02MTris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)。收集各洗脫峰，如圖3所示，鑑定胰激肽原酶活性峰並測定效價，冷凍乾燥後即為胰激肽原酶原料藥。滿足高純度胰激肽原酶的性能評定標準。
下面，通過對具體實施例的詳細描述，詳細說明本發明實施例1免疫抗體親和層析柱的製備用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在採集血清前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成免疫抗體親和層析柱。
實施例2免疫抗體親和層析柱的製備用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成免疫抗體親和層析柱。
實施例3免疫抗體親和層析柱的製備用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。用抗原親和層析柱純化抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成免疫親和層析柱。
實施例4單克隆抗體親和層析柱的製作方法用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用後，將細胞懸液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞懸液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例5單克隆抗體親和層析柱的製作方法用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按7∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例6單克隆抗體親和層析柱的製作方法用高效液相色譜純化並經定性的胰激肽原酶(活性組分2)50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強免疫。
取經免疫的小鼠脾B淋巴細胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用後，將細胞混合液分別接種在多塊96孔細胞培養板孔內。
將接種細胞混合液的細胞培養板置於CO2培養箱內培養。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養基，第5～10天改用HT培養基，10天後改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養基培養。收集細胞分泌液，用酶聯免疫法對單克隆抗體進行篩選及效價測定，將分泌特異性胰激肽原酶抗體的細胞挑選出來傳代培養，建立細胞系，由此獲得穩定的抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的胰激肽原酶抗體偶聯到多糖基質上，從而製成單克隆抗體親和層析柱。
實施例7胰激肽原酶原料藥製備取新鮮豬胰10kg，用水清洗乾淨，置消毒容器內。加1～3倍(W/V)生理鹽水製成勻漿。3000～4000轉/分鐘離心20～40分鐘取上清液。離心上清液經超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍幹即為胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩衝液500ml溶解，2500～3500轉/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉澱加少量緩衝液再次溶解，離心取上清。合併兩次上清液，上陰離子交換層析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩衝液平衡洗脫至基線，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩衝液進行梯度洗脫，收集活性峰(活性組分1)。將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩衝液(0.02M Tris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)200ml溶解，上親和層析柱，用該緩衝液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，用含有洗脫劑(0.02M Tris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)的親和層析洗脫液洗脫。收集各洗脫峰，鑑定胰激肽原酶活性峰並測定效價，冷凍乾燥後即為胰激肽原酶原料藥。
實施例8胰激肽原酶原料藥製備取新鮮牛胰10kg，用水清洗乾淨，置消毒容器內。加3倍(W/V)生理鹽水製成勻漿。3000～4000轉/分鐘離心20～40分鐘取上清液。離心上清液經超濾濃縮，截留分子量10000～50000道爾頓(10～50KD)組分，凍幹即為胰激肽原酶粗品。胰激肽原酶粗品用0.01～0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩衝液500ml溶解，2500～3500轉/分鐘離心5～20分鐘取上清，沉澱加少量緩衝液再次溶解，離心取上清。合併兩次上清液，上陰離子交換層析柱，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩衝液平衡洗脫至基線，用含0.01～0.5mol/LNaCl的上述緩衝液進行梯度洗脫，收集活性峰。將上述離子交換層析得到的活性組分1用親和層析平衡緩衝液200ml(0.02M Tris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl)溶解，上親和層析柱，用該緩衝液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩定的基線後，用含有洗脫劑的親和層析洗脫液(0.02M Tris-HCL緩衝液，pH＝7.8，含0.5M Nacl，7％Arg)洗脫。收集各洗脫峰，鑑定胰激肽原酶活性峰並測定效價，冷凍乾燥後即為胰激肽原酶原料藥。
高純度胰激肽原酶的性能評定1、高純度胰激肽原酶對N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽底物水解速率的測定溶液的配製(1)磷酸鹽緩衝液(pH7.0)稱取磷酸氫二鈉10.9g，磷酸二氫鈉2.3g，加水約700ml使溶解，調pH值至7.0，加水稀釋至1000ml，混勻即得。
(2)0.1mol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.0)稱取三羥甲基氨基甲烷12.114g，加水約800ml溶解，用6mol/L鹽酸溶液調pH值至8.0，加水至1000ml，混勻即得。
(3)胰蛋白酶抑制劑溶液稱取大豆胰蛋白酶抑制劑(Amresco)5mg，加入磷酸鹽緩衝液(pH7.0)溶解並稀釋至10ml，混勻即得。
(4)供試品溶液取供試品(依前述實施例7～8製備的高純度胰激肽原酶，批號為040218、040220和040223，下同)適量，加入磷酸鹽緩衝液(pH7.0)使溶解，製成每1ml含10單位的溶液。量取4.0ml，置10ml量瓶中，加胰蛋白酶抑制劑溶液1ml，再用磷酸鹽緩衝液(pH7.0)稀釋至刻度。
(5)底物溶液取N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽17.7mg，精密稱定，加0.1mol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.0)至100ml，充分混勻，4℃保存。
水解速率測定 量取在30±0.5℃預熱5分鐘的底物溶液2.9ml置1cm比色池中，加供試品溶液0.1ml，混勻，立即計時，在30±0.5℃下，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)在253nm波長處測定4分鐘的吸光度(A4)和6分鐘的吸光度(A6)。另取胰蛋白酶抑制劑1.0ml，加入磷酸鹽緩衝液(pH7.0)稀釋至10ml，量取0.1ml置1cm比色池中，加入30±0.5℃預熱5分鐘的底物溶液2.9ml，混勻為空白，求得A值[(A6-A4)/2]，按下式計算R值(水解速率)。
R值(水解速率)應為0.12～0.17R=A0.0383ab]]>式中a為供試品溶液每1ml中的mg數；b為供試品每1mg的效價單位數。
2、純度檢查(主要用於檢查原料)(1)照高效液相色譜法(中國藥典2000版附錄VI H)測定，應為單一組分。
色譜條件與系統適用性試驗儀器型號SHIMADZU(島津)液相色譜儀；SPD-10A vp檢測器；SCL-10A vp控制器；LC-AT vp輸液泵；FCV-10AL vp溶劑切換器；PGU-14A脫氣機；Class-vp6.10色譜工作站；色譜柱為TSK-2000凝膠色譜柱300×7.5mm，5μm；流動相0.2mol/L磷酸鹽緩衝液(pH6.8)；檢測波長280nm；流速1.0ml/min；檢測溫度25℃；理論板數按胰激肽原酶峰計算應不小於3000。
測定法取供試品用流動相製成每1ml含10單位的溶液，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算，主峰面積應大於95％，保留時間應為7.8±0.5min，結果見圖4～6。
(2)SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上應顯示一條帶(詳見分子量測定)。
3、分子量測定照電泳法(中國藥典2000年版二部附錄V F第五法SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法)測定。
供試品緩衝液取水4.8ml，濃縮膠緩衝液1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸鈉2.0ml，0.5％溴酚藍溶液0.5ml，β-巰基乙醇0.5ml，混勻。
標準蛋白溶液的製備 取分子量測定用標準蛋白(分子量範圍1～10萬)適量，加供試品緩衝液製成每1ml中含1μg蛋白的溶液。臨用前置沸水浴中5min，冷卻。
供試品溶液的製備取供試品適量(按蛋白含量計算)，加供試品緩衝液製成每1μl中含2μg蛋白的溶液，臨用前置沸水浴中5min，冷卻。
測定法照上述電泳法試驗，採用垂直板電泳，每孔加5～10μl供試品溶液或標準蛋白溶液，考馬斯亮藍染色。以標準蛋白分子量的對數為縱坐標，以遷移率為橫坐標進行直線回歸，由回歸方程計算供試品的分子量。
測定結果應為一條帶，分子量應為39000±5000道爾頓，見圖7。
4、序列測定將前述實施例7～8製備的高純度胰激肽原酶經北京大學生命科學院胺基酸序列分析，N-末端15個胺基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
5、效價及比活力測定標準溶液的配製取胰激肽原酶標準品(中國藥品生物製品檢定所)適量，精密稱重，加上述磷酸鹽緩衝液(pH7.0)溶解並製成每1ml中含10單位的溶液。
供試品溶液的製備取供試品適量，精密稱重，加磷酸鹽緩衝液(pH7.0)製成每1ml中約含10單位的溶液。
底物溶液的製備取N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽17.7mg，精密稱定，加0.1mol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.0)至100ml，4℃保存。
測定法量取25±0.5℃水浴中預熱的底物溶液2.5ml置1cm比色池中，精密加入供試品溶液或標準品溶液0.1ml，混勻，立即計時。照紫外分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)，在25±0.5℃於253nm波長處測定，以底物溶液為空白，準確讀取1分鐘的吸光度A1和3分鐘的吸光度A3。標準品和供試品平行測定3次取平均值，計算標準品和供試品的A值(A＝A3-A1)，按下式計算每1mg供試品的效價
蛋白含量取供試品適量，精密稱定，加水製成每1ml中約含0.15mg蛋白的溶液，精密量取供試品1.0ml。照福林酚測定法(見注)測定，計算每1mg供試中的蛋白毫克數。
比活力按下式計算 注福林酚測定法試劑鹼性銅試液取氫氧化鈉10g，硫酸鈉50g，加水400ml使其溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使其溶解，另取硫酸銅0.25g加水30ml使其溶解，將兩液混合作為乙液。
臨用前，合併甲、乙兩液，並加水至500ml。
對照品溶液的製備取牛血清白蛋白對照品，加水製成每1ml中含0.3mg的溶液。
供試品溶液的製備取供試品適量，精密稱定，加水製成每1ml中約含0.15mg蛋白的溶液。
標準曲線的製備精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0ml。再分別加鹼性銅試液1.0ml，搖勻；各加入福林試液(中國藥典2000年版二部附錄XV B，取福林試液貯備液，按1∶15用水稀釋)4.0ml，蓋塞，立即混勻。置55℃水浴中準確反應5min，置冷水浴中10min，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV B)以0號管為空白，在650nm波長處測定吸光度。以對照品溶液濃度與其相對應的吸收度A對照進行直線回歸，求出回歸方程。
測定法精密量取供試品溶液1.0ml，照標準曲線製備項下的方法，自「加入鹼性銅試液」起操作，測得其樣品的吸光度A樣品，從回歸方程計算蛋白的含量，並乘以稀釋倍數，即得。
6、過敏試驗取供試品適量，加0.9％氯化鈉注射液製成每1ml含100單位的溶液作為供試品致敏液與攻擊液。
取體重250-350g豚鼠6隻，間日腹腔注射供試品致敏液0.5ml，連續3次使致敏。然後將動物分成兩組，每組3隻，分別在第一次注射後第14日及第21日靜脈注射供試品攻擊液1.0ml進行攻擊。仔細觀察注射後15min內豚鼠的反應，均不得出現過敏性反應。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、乾嘔或咳嗽3聲等現象中的兩種或兩種以上者；或囉音、抽搐、虛脫或死亡現象之一者，應判為陽性。
7、異常毒性取本品，加0.9％氯化鈉注射液製成每1ml含10單位的溶液，依法檢查(中國藥典2000版二部附錄XI C)，按靜脈法給藥，符合規定。三個批次樣品的檢定結果列表如下 由檢定結果可以得出結論運用免疫親和層析技術，提取的胰激肽原酶純度高，獲得的產品比活高，達到每毫克蛋白800單位以上，經HPLC檢查為單一組分，在SDS—聚丙烯醯胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量測定為34～44KD不含雜質，使用安全，能達到靜脈給藥的要求。
含高純度胰激肽原酶的藥物製劑實施例9注射用胰激肽原酶(凍幹靜脈注射用胰激肽原酶)製劑生產工藝。
首先，在局部百級潔淨區內按配製處方將胰激肽原酶原料藥((按照本發明前述實施例製備，並經各項檢測合格，下同))與磷酸鹽、氯化鈉、右旋糖酐等輔料準確稱量在配液容器內；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻後，使磷酸鹽的濃度為0.03mol/L，氯化鈉濃度為0.9％，右旋糖苷濃度為3％，得到製劑中間體；除菌過濾，其中過濾前後應對除菌過濾系統進行完整性測試。然後，將過濾後的中間體按裝量裝入抗生素瓶，在分裝過程中應進行至少4次裝量檢查，保證每一隻瓶內裝入的藥量準確。最後，將裝入藥品的抗生素瓶碼在凍幹箱各層的隔板上，按照品種凍幹曲線進行速凍至零下20～30℃，維持8小時；然後抽真空，在真空狀態下緩慢升溫至35～40℃，保持一定時間，再降至室溫後取出。壓塞、軋蓋得成品。經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫存放。
實施例10胰激肽原酶注射液(靜脈注射用胰激肽原酶製劑)生產工藝。
首先，在局部百級潔淨區內按配製處方將胰激肽原酶原料藥、磷酸鹽、氯化鈉等輔料準確稱量在配液容器內；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻後，使磷酸鹽的濃度為0.03mol/L，氯化鈉濃度為0.9％，得到製劑中間體；除菌過濾，其中過濾前後應對除菌過濾系統進行完整性測試。然後，將過濾後的中間體按裝量裝入抗生素瓶同時壓塞、軋蓋即得成品，在分裝過程中應進行至少4次裝量檢查，保證每一隻瓶內裝入的藥量準確。最後，經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫存放。
實施例11胰激肽原酶腸溶膠囊製劑生產工藝。
首先，在十萬級潔淨區內將胰激肽酶原料藥與澱粉、乳糖等輔料準確稱量，輔料配比為澱粉乳糖為1∶1，充分混合均勻，得到製劑中間體。然後，取外觀、長度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化時限、熾灼殘渣及微生物學檢查均符合規定的膠囊殼，填充中間體藥粉，得到半成品。最後蓋上膠囊上節、壓平打光，製得成品。經過成品質量檢驗合格後，用玻璃瓶或塑料瓶密閉包裝，入成品庫，放置在陰涼乾燥處，溫度不得超過25℃，相對溼度不得超過45％。
實施例12為胰激肽原酶腸溶片生產工藝。
首先，在十萬級潔淨區內將胰激肽原酶原料藥與澱粉、羧丙基纖維素鈉等輔料準確稱量(澱粉∶羧丙基纖維素鈉＝1∶1)，充分混合均勻，得到製劑中間體。然後，進行制粒與壓片，在壓片過程中隨時注意片劑的外觀，定時抽查藥片的重量差異、硬度和崩解時限。最後，包腸溶衣得到成品。經過成品質量檢驗合格後，進行包裝，入成品庫，貯存在陰涼、通風、乾燥處，注意防止受潮、發黴、變質。
以上對本發明的詳細描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變和變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求所定義的範圍。
權利要求
1.製備高純度胰激肽原酶的方法，包括下述步驟1)將含胰激肽原酶的豬胰或牛胰臟初步純化、分離，獲得主要成分為胰激肽原酶的活性組分1；2)將所述活性組分1進一步純化，獲得活性組分2；3)以所述活性組分2作為抗原，製備抗胰激肽原酶特異性抗體；4)將所述製備得到的抗胰激肽原酶特異性抗體與親和層析載體結合，製備抗體親和層析柱；5)用所述抗體親和層析柱分離純化步驟1)中的活性組分1，獲得高純度胰激肽原酶。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟3)中所述製備抗胰激肽原酶特異性抗體包括下述步驟3a)以所述活性組分2作為抗原，免疫小鼠，製備抗血清；3b)將所述活性組分2與親和層析載體結合，製備抗原親和層析柱；3c)將所述抗血清上抗原親和層析柱，分離得到抗胰激肽原酶特異性抗體。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟3)中所述製備抗胰激肽原酶特異性抗體包括下述步驟3i)以所述活性組分2作為抗原，免疫小鼠，製備免疫小鼠脾細胞；3ii)將所述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，製備融合的雜交瘤細胞；3iii)篩選表達抗胰激肽原酶抗體的雜交瘤細胞，建立細胞株；3iv)培養所述細胞株獲得所述抗胰激肽原酶特異性抗體。
4.權利要求1、2或3所述方法，其特徵在於步驟1)所述豬胰或牛胰臟原料初步純化、分離包括下述步驟1a)將胰臟原料經透析，截留分子量10000～50000道爾頓部分；1b)將上述截留部分經DEAE-Sepharose離子交換柱吸附，以0.01～0.1mol/L Tris-HCl緩衝液平衡洗脫至基線，用含0.01～0.5mol/L NaCl的上述緩衝液進行梯度洗脫，收集活性峰，製備活性組分1。
5.權利要求1、2或3所述方法，其特徵在於所述親和層析載體為Sepharose4B瓊脂糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或羧甲基葡聚糖凝膠。
6.權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於所述步驟2)中進一步純化活性組分1的方法為將活性組分1經製備型高效液相色譜分離，製備胰激肽原酶，即為活性組分2。
7.權利要求1方法製備的高純度胰激肽原酶。
8.權利要求7所述的高純度胰激肽原酶，其特徵在於所述高純度胰激肽原酶具有以下特性比活性為每毫克蛋白800單位以上；高效液相色譜法檢測，單組分圖譜，主峰面積大於95％，保留時間為7.8±0.5min；SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上顯示一條帶，分子量為34～44千道爾頓；胺基酸序列分析，N-末端15個胺基酸序列為Val-Ile-Gly-Gly-Asp-Glu-Cys-Asn-Ile-Asn-Glu-His-Arg-Phe-Leu。
9.一種藥物製劑，含有權利要求7所述高純度胰激肽原酶以及藥學上可接受的藥用輔料。
10.權利要求9所述的藥物製劑，其特徵在於所述藥物製劑為靜脈給藥劑型。
全文摘要
本發明涉及製備高純度胰激肽原酶的方法，將抗原抗體反應與親和層析技術結合，從含胰激肽原酶的胰臟中將胰激肽原酶分離純化，製備得到純度高的胰激肽原酶。本發明還涉及通過本發明方法製備的高純度胰激肽原酶及其藥物製劑，獲得的產品比活高、純度高，不含或僅含少量雜質，使用安全，能達到靜脈給藥的要求。
文檔編號A61K38/48GK1737134SQ200410009460
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月20日 優先權日2004年8月20日
發明者馬驫, 魏化偉, 王天燕 申請人:北京賽生藥業有限公司