基於G₄DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法

2023-08-08 19:25:36

專利名稱：基於G4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種基因鑑別檢測試劑的製備方法，具體的說，涉及基於(^4DNA酶顯色 的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法。該試劑不但能夠快速鑑別檢測豬瘟病毒，區分豬 瘟強毒和疫苗毒，而且還適用於其它病原微生物核酸的鑑別檢測，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
核酸是決定遺傳性質的關鍵物質，每一種生物都有自己特定的核酸序列，各種各 樣的生物性狀最終都能在特定核酸序列中找到根源。因此，核酸分析技術在病原微生物的 鑑定診斷，分型和耐藥性檢測，疾病診斷與預後，SNP檢測等領域有著廣泛的應用，並發揮著 重要的作用。
這其中對核酸突變的檢測正佔據越來越重要的地位，因為在人類疾病中相當一部 分是由於各種致病菌和病毒侵染所引起的，科學家發明了很多針對這些病原體的藥物，用 來治療感染性疾病。在這些藥物的廣泛應用拯救了許多患者的生命的同時，細菌和病毒耐 藥性問題也相伴而生。由於細菌和病毒固有的選擇和適應性，再加上抗感染藥物的不恰當 使用，造成當前細菌和病毒耐藥性問題成為一個非常棘手的問題。這些細菌和病毒的耐藥 性很大部分是由於藥物作用靶蛋白的編碼基因發生突變所引起的，這些突變通常為單鹼基 突變，即可造成蛋白質中某個胺基酸的改變，進而藥物分子不能與突變蛋白相互作用。比 如，HIV是一種逆轉錄病毒，其複製過程突變率高，在抗病毒治療過程中，很容易產生耐藥性 突變，目前抑制HIV逆轉錄酶、蛋白酶、整合酶和包膜蛋白的多種藥物均發現有多種相應的 耐藥基因突變。
一個簡便高效的單核苷酸鑑別檢測體系在感染性疾病治療過程中有重要價值。它 能幫助醫生及時了解病人體內耐藥性菌株、毒株的情況，適時採取有針對性的治療方案。另 外人體基因組中包含大量的單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphisms, SNPs)，其中一部分SNPs與很多疾病易感性相關，對這些位點的檢測技術是實現個性化醫 療的關鍵技術之一。單鹼基突變的檢測和SNPs的檢測技術上是一致的，都是確定一段DNA 序列中的某個特定位置鹼基種類。
DNA 酶(DNAzyme)逐漸受到人們重視(Rich, Α.; Zhang, S. Timeline: Z-DNA: the long road to biological function, Nat. Rev. Genet. 2003, 4, 566-572.)。它 能夠催化雙氧水氧化2，2』 -聯氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)[2，2-azinobis (3-e thylbenzothiozoline)- 6-sulfonic acid, ABTS]等過氧化物酶顯色底物，生成有顏色的 物質，並且DNA過氧化物酶能夠作為催化標籤融入各種檢測探針中，實現用肉眼檢測目標 物。DNA過氧化物酶是Dipankar Sen課題組發現的，它是G-四鏈體DNA與高氯鐵血紅素 (Hemin)形成的複合物。DNA過氧化物酶作為催化標籤有著自己獨特的優勢，例如DNA過 氧化物酶可以在檢測體系中由G-四鏈體與Hemin原位組裝形成，不需要額外的製備純化步 驟；它是一種DNA序列，可在合成過程中直接加入核酸探針序列中，或者通過鹼基對互補與 探針相連，省去額外的標記步驟；DNA序列穩定，有活性的結構很容易在溶液中形成，這樣在運輸存儲過程中不需要特殊的條件。
豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)和口蹄疫一樣，是豬的一種高度致死性接觸 性傳染病。目前，全世界仍有50多個國家和地區存在CSF。世界動物衛生組織(OIE) 2005 年出版的《陸生動物衛生法典》中將CSF列為必須報告疫病之一。我國是CSF高發國家，也 將CSF列為「一類動物疫病」。豬瘟的防控成為養豬業的重要一環。在我國主要採用對豬只 進行豬瘟兔化弱毒株疫苗，即C株疫苗進行常規免疫來對豬瘟進行防控。由於C株疫苗也 是一種病毒，那麼在生產實踐中存在如何區分豬只是感染了野毒還是接種了疫苗的問題， 因此豬瘟野毒和C株之間的鑑別判斷就顯得十分重要。
常見的豬瘟鑑別檢測方法主要包括病毒的分離和生物學試驗、免疫螢光技術、核 酸測序、螢光定量PCR等，但這些方法在應用過程中普遍存在著明顯的不足，諸如周期長， 操作繁瑣，特異性和敏感性差，不規範，不適用於大批量檢測，這給豬瘟的鑑別檢測帶來了 巨大困難。因此，如何快速、準確對豬瘟病毒進行鑑別檢測是目前面臨的主要難題之一。發明內容
本發明的目的在於解決現有技術的不足，提供一種基於G4DNA酶顯色的可視化基 因鑑別檢測方法，該試劑不但能夠快速定性檢測豬瘟病毒，而且還適用於病原微生物核酸 的鑑別檢測，方便、快捷、經濟實惠。
本發明利用DNA過氧化物酶序列為G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，很容易 拆分、組裝的特性，將DNA過氧化物酶序列分成了兩個部分，採用3 1拆分的模式構建 探針，即一條探針中含有3段序列，另外一條只含有一段序列，也就是說將序列 d (GGGTAGGGCGGGTTGGG)不對稱分為d (GGGTAGGGCGGG)和d (TGGG)分別與兩條結合序列的3』 和5』端融合形成探針ftx)bL和ftx)bR，這兩條結合序列與靶DNA的部分序列互補。當不存在 靶DNA時，探針呈游離狀態，分成兩個部分的DNA過氧化物酶序列不能組裝成G-四鏈體結 構，不能表現出過氧化物酶活性，故體系中沒有信號的變化。在靶單鏈DNA存在的情況下， 在變性與退火過程中，探針與模板特異性結合，兩拆分部分相互靠近從而組裝成G-四鏈體 結構，與Hemin結合後表現出過氧化物酶活性，在顯色體系的條件下釋放肉眼可見的綠光。 這樣可以通過體系中DNA過氧化物酶催化的顏色反應檢測靶DNA。
為了實現區分豬瘟病毒石門強毒和豬瘟C株疫苗毒的目的，本發明將下遊探針 I^robR作為豬瘟強毒核苷酸的檢測探針，採用競爭策略實現對單核苷酸突變的檢測。即檢測 體系中不僅有與靶DNA序列(豬瘟強毒的cDNA)互補的探針ftObLJrobR，還包括競爭序列 ProbC,競爭序列為靶DNA突變體(豬瘟C株疫苗毒)的互補區，只有在探針ftx)bR的互補區 與靶DNA (豬瘟強毒的cDNA)相應區域完全匹配的體系中才能組裝成有活性的DNA過氧化 物酶，結合Hemin後成為有活性的DNA過氧化物酶，催化雙氧水氧化ABTS2_生成綠色ABTS。 如果靶DNA發生突變，則競爭序列ProbC會競爭結合到靶DNA的突變體(豬瘟C株疫苗毒) 序列上，探針的互補區就不能結合到靶DNA (豬瘟強毒的cDNA)的突變體相應區域， 因而不能與ProbL組裝成有活性的DNA過氧化物酶，也不會完成後續的顯色反應形成綠色， 從而實現區分豬瘟病毒石門強毒和豬瘟C株疫苗毒的目的。若反應產物變成肉眼可見的綠 色，則判為陽性，即檢出豬瘟石門強毒，不變色為陰性，即檢出豬瘟C株疫苗毒或無豬瘟病 毒存在。5
通常從樣品中獲得的核酸量不足以直接用於分析，因此，在用(y)NA酶進行顯色反 應之前必需對被檢測的核酸進行基因擴增。其次，由於(^4DNA酶顯色反應時只有一條PCR產 物可以與探針雜交，而其對應的互補鏈由於PCR雙鏈的自身退火，會干擾所需要的雜交反 應，降低雜交信號，因此需要複製出單鏈。本發明選擇了經濟實用的不對稱PCR技術來達成 上述目的。使用利用濃度有明顯差異的特異性上、下遊引物進行不對稱PCR擴增；如果目標 基因是RNA，則應加上反轉錄的步驟。不對稱PCR進行完成後，可以直接加入(y)NA酶反應 液、探針等試劑，直接進行下一步的顯色反應，從而實現了檢測的方便、快捷。
本發明是通過採用如下的技術方案來實現發明目的的。
基於G4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特徵在於包括如下 步驟A、目標基因的製備選取經豬瘟病毒感染後的細胞，經-70°C凍融3次，每次10-30分鐘後，取200 μ 1加 RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3_5分鐘， 於4°C 12000g/min離心10-15分鐘，上清液轉移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫沉 澱10-20分鐘，再於40C 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇於4°C 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉澱在室溫下自然晾乾，加DEPC處理過的水20 μ 1得 到目標基因RNA;所述75%乙醇採用無菌雙蒸水按體積比配製而成。
B、cDNA 的製備採用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20ymol/L)*dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)1 μ 1 (10 μ mol/L)，65°C孵育 5 分鐘，再 迅速置冰上5分鐘，然後加逆轉錄反應緩衝液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT (二硫蘇糖醇)2μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆轉錄酶1μ 1，於42°C反應50分鐘、75°C反應10分 鍾，即得到cDNA ；所述基因提取試劑盒選自hvitrogen公司生產的產品。
所述反向引物W3 (_)的序列是 5』 GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3』。
所述逆轉錄反應緩衝液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris_HCl(Tris-鹽酸)， 375 mmol/L KCl (氯化鉀)，15 mmol/L MgCl2 (氯化鎂)。
C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應，循環條件 為95°C預變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個 循環；最後72°C延伸10分鐘，得到PCR產物；所述100 μ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3 ( + )2 μ 1 (0. 4_4 μ mol/L)和反向 引物 W3 (_)2 μ 1 (20Mmol/L)，PCR 溶液 10μ 1 (10Xbuffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及餘量的無菌雙蒸水。
所述不對稱PCR反應體系中的正向引物W3( + )序列是5』-gcgcgggtaacccgggat-3』 ，反向引物 W3 (_)序列是5』 - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3』。
Dj4DNA酶顯色反應分別取QDNA酶顯色反應緩衝液20 μ 1、上遊探針ftx)blL 2 μ 1(20 μ mol/L)、下遊探針ProblR 2μ 1 (2(^11101/1)，競爭性探針1^0131〇6μ 1 (20 μ mol/L)，加無菌雙蒸水補足為 91 μ 1，加入至步驟C所得的含有100 μ 1不對稱PCR反應液的200 μ 1 PCR管中，95°C變性 5 min ；30°C 退火 3min，加入 Hemin 底物 0. 5 μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8 μ 1 (50 mmol/L) ATBS和0. 5 μ 1 (lmol/L)H202顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現。結果判定反 應產物變成肉眼可見的綠色判為陽性，即樣品含有豬瘟石門強毒基因，不變色為陰性，即樣 品含有豬瘟C株疫苗基因或無豬瘟病毒基因存在。
所述(^4DNA酶顯色反應緩衝液的組成包括100 mmol/L的4_羥乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesPlfonic acid,HEPES)10 μ 1,2 mol/L 的氣化 鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
所述上遊探針 ProblL 的序列是 5』_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 ProbL0
所述下遊探針ProblR 的序列是 5』-tgggtaattttttatttatttaggt_3'。
所述競爭性探針 ProblC 的序歹Ij是 5』 cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3』。
所述上、下遊探針的組成為(^4DNA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，該序 列又被拆分為兩個部分，一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，形成3 1 拆分模式，上、下遊探針分別帶有拆分的G-四鏈體DNA序列。
在本發明的基本原理是利用檢測體系中不僅有與靶DNA (豬瘟石門毒的cDNA)序列互補的探針ftObLJrobR， 還包括競爭序列ftx)bC，競爭序列為靶DNA突變體(豬瘟C株疫苗毒的cDNA)的互補區，只有 在探針ftx)bR的互補區與靶DNA (豬瘟石門毒的cDNA)相應區域完全匹配的體系中才能組 裝成有活性的DNA過氧化物酶，結合Hemin後成為有活性的DNA過氧化物酶，催化雙氧水氧 化ABTS2-生成綠色ABTS。如果靶DNA是豬瘟C株疫苗毒的cDNA，則競爭序列ftx)blC會競 爭結合到靶DNA的突變體(豬瘟C株疫苗毒的cDNA)序列上，探針ftx)blR的互補區就不能 結合到靶DNA的突變體(豬瘟C株疫苗毒的cDNA)相應區域，因而不能與ftx)blL組裝成有 活性的DNA過氧化物酶，也不會完成後續的顯色反應形成綠色，從而實現區分豬瘟病毒石 門強毒和豬瘟C株疫苗毒的目的。
與現有技術相比，本發明的有益技術效果表現在1、檢測速度快，整個檢測過程共需2-3小時，而(^4DNA酶顯色步驟僅需15分鐘；2、檢測方法精確穩定、重現性好；3、檢測步驟簡單，操作簡便，只需1人即可完成整個檢測過程，一次可檢測1-95個樣 品，減少了人力資源的浪費；4、可肉眼直接觀察顯色反應，結果直觀；5、無需特殊的昂貴儀器，試劑便宜，檢測成本低廉，利於推廣。


圖1為本發明對經豬瘟石門強毒感染後的H(-15細胞、豬瘟C株疫苗毒感染的牛 睪丸細胞、空白的H(-15細胞以及無菌雙蒸水進行檢測的G4DNA酶顯色反應結果；圖2為本發明對經豬瘟石門強毒感染後的H(-15細胞、C株感染的牛睪丸細胞、空白 的H(-15細胞以及無菌雙蒸水進行檢測後利用紫外-可見分光光度計(UV-2550 UV-visspectrophotometer (島津公司產品))分析(^4DNA酶顯色反應的光吸收結果(吸收波長為 419nm)。
具體實施方式
基於G4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特徵在於包括如下 步驟A、目標基因的提取選取經豬瘟病毒感染後的細胞，經-70°C凍融3次，每次10-30分鐘後，取200 μ 1加 RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3_5分鐘， 於4°C 12000g/min離心10-15分鐘，上清液轉移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫沉 澱10-20分鐘，再於40C 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇於4°C 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉澱在室溫下自然晾乾，加DEPC處理過的水20 μ 1得 到目標基因RNA;所述75%乙醇採用無菌雙蒸水按體積比配製而成。
B、cDNA 的製備採用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20ymol/L)*dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)1 μ 1 (10 μ mol/L)，65°C孵育 5 分鐘，再 迅速置冰上5分鐘，然後加逆轉錄反應緩衝液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT (二硫蘇糖醇)2μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆轉錄酶1μ 1，於42°C反應50分鐘、75°C反應10分 鍾，即得到cDNA ；所述基因提取試劑盒選自hvitrogen公司生產的產品。
所述反向引物W3 (_)的序列是 5』 GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3』。
所述逆轉錄反應緩衝液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris_HCl(Tris-鹽酸)， 375 mmol/L KCl (氯化鉀)，15 mmol/L MgCl2 (氯化鎂)。
C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應，循環條件 為95°C預變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個循 環；最後72°C延伸10分鐘，得到PCR產物；所述100 μ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4_4Mmol/L)和反向 引物 W3 (_)2 μ 1 (20 μ mol/L),PCR 10 μ 1 (10Xbuffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及餘量的無菌雙蒸水。
所述不對稱PCR反應體系中的正向引物W3( + )序列是5』-gcgcgggtaacccgggat-3』 ，反向引物 W3 (_)序列是5』 - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3』。
D、G4DNA酶顯色反應分別取G4DNA酶顯色反應緩衝液20 μ 1、上遊探針ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)、下遊探 針ProblR 2μ 1 (2(^11101/1)，競爭性探針1^0131〇6μ 1 (20 μ mol/L)，加無菌雙蒸水補足 為91 μ 1，加入至步驟C所得的含有100 μ 1不對稱PCR反應液的200 μ 1 PCR管中，95°C變 性 5 min ；300C 退火:3min，加入 Hemin 底物 0. 5 μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8 μ 1 (50 mmol/L) ATBS和0. 5 μ 1 (1 mol/L) H2O2顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現。
所述(^4DNA酶顯色反應緩衝液的組成包括100 mmol/L的4_羥乙基哌嗪乙磺酸 (4- (2-hydroxyethyl) piperazine-l-ethanesM-lfonic acid, HEPES) 10 μ 1, 2 mol/L 白勺氣 化鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
所述上遊探針 ProblL 的序列是 5』_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 ProbL0
所述下遊探針ProblR 的序列是 5』-tgggtaattttttatttatttaggt_3'。
所述競爭性探針 ProblC 的序歹Ij是 5』 cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3』。
所述上、下遊探針的組成為(^4DNA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，該序 列又被拆分為兩個部分，一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，形成3 1 拆分模式，上、下遊探針分別帶有拆分的G-四鏈體DNA序列。
權利要求
1.基於G4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特徵在於包括如下 步驟A、目標基因的提取選取經豬瘟病毒感染後的細胞，經_70°C凍融3次，每次10-30分鐘後，取200μ1加RNA 裂解液Iml混勻，室溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3_5分鐘，於4°C 12000g/ min離心10-15分鐘，上清液轉移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫沉澱10-20分鐘， 再於4°C 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇於4°C 7500g/min離心 5分鐘，棄上清，RNA沉澱在室溫下自然晾乾，加DEPC處理過的水20 μ 1得到目標基因RNA ；B、cDNA的製備採用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10μ1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20ymol/L)*dNTPs 1μ 1 (10 μ mol/L)，65°C孵育 5 分鐘，再迅速置冰上 5 分鐘， 然後加逆轉錄反應緩衝液4μ 1 (5Xbuffer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT 2μ 1 (0. lmol/L), MMLV逆轉錄酶1 μ 1，於42°C反應50分鐘、75°C反應10分鐘，即得到cDNA ；C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應，循環條件 為95°C預變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個循 環；最後72°C延伸10分鐘，得到PCR產物；D、(^4DNA酶顯色反應分別取G4DNA酶顯色反應緩衝液20 μ 1、上遊探針ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)、下遊探 針ProblR 2μ 1 (2(^11101/1)，競爭性探針1^0131〇6μ 1 (20 μ mol/L)，加無菌雙蒸水補足 為91 μ 1，加入至步驟C所得的含有100 μ 1不對稱PCR反應液的200 μ 1 PCR管中，95°C變 性 5 min ；300C 退火:3min，加入 Hemin 底物 0. 5 μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8 μ 1 (50 mmol/L)ATBS和0·5μ 1 (1 mol/L) H2O2顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現。
2.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟B所述反向引物W3 (-)的序列是5』 GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3'。
3.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的製備方法，其特徵在 於步驟B所述逆轉錄反應緩衝液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris-HCl，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl20
4.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟C所述100 μ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3(+》μ 1(0. 4-4ymol/ L)和反向引物 W3 (-) 2μ 1 (2(^11101/1)，？0 溶液1(^1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2.5mmol/L)，dNIPs 溶液 2μ 1 (10mmol/L), Taq DNA 聚合酶 2 μ 1 (2U)以及餘量的無菌雙 蒸水。
5.如權利要求1或5所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法， 其特徵在於所述不對稱PCR體系中的正向引物W3 (+ )序列是5』-gcgcgggtaacccgggat-3』 ，反向引物 W3 (_)序列是5』 - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3』。
6.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟D所述(^4DNA酶顯色反應緩衝液的組成包括100 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙 磺酸10μ 1，2 mol/L的氯化鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
7.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟D所述上遊探針ProblL的序列是5』-tgggtaattttttatttatttaggt_3』。
8.如權利要求1所述基於G4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方 法，其特徵在於步驟D所述下遊探針ftx)blR的序列是5』_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 。
9.如權利要求1所述基於(^4DNA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟D所述競爭性探針ProblC的序歹Ij是5』 cgcctaattttcttttttcttttttatttatt3ο
10.如權利要求1所述基於(y)NA酶顯色的可視化基因鑑別檢測試劑的製備方法，其特 徵在於步驟D所述上、下遊探針的組成為(y)NA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列， 該序列又被拆分為兩個部分一個部分包含3段序列，另一部分包含1段G你序列，拆 分模式是3:1。
全文摘要
本發明涉及一種基於G4DNA酶顯色的可視化豬瘟病毒鑑別檢測試劑的製備方法，包括選取病毒感染的細胞，經凍融裂解後，採用基因提取試劑盒提取目標基因RNA，經逆轉錄、滅活MMLV逆轉錄酶後得到cDNA；將cDNA加入不對稱PCR體系，經變性、退火及延伸擴增50-100個循環得到不對稱PCR產物；將上、下遊探針，競爭性探針和不對稱PCR產物加入到G4DNA酶顯色反應緩衝液中，經變性、退火後再加入Hemin、ATBS和H2O2進行顯色反應，觀察有無肉眼可見的綠色出現，可以區分豬瘟強毒和疫苗C株。本發明檢測速度快、精確穩定、重現性好、檢測步驟簡單、操作簡便、可肉眼直接觀察顯色反應，結果直觀、成本低廉。
文檔編號G01N21/78GK102041317SQ201010555428
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者王毅, 魯小璐 申請人:成都巨星豬業有限公司, 王毅