一種LAMP法檢測HPV常見亞型的引物組及檢測體系的製作方法
2023-08-08 10:58:51 1
本發明涉及分子檢測技術領域，具體地說，是一種lamp法檢測hpv常見亞型的引物組及檢測體。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)是一種雙鏈環狀dna病毒，可特異性感染人類生殖器官的皮膚及黏膜，導致尖銳溼疣(condylomaacuminatum,ca)及鱗狀上皮內損傷(sils)。鱗狀上皮內損傷可以進一步病變為宮頸癌。目前已發現hpv病毒有100餘種病毒亞型，按照其是否能夠導致宮頸癌，將其分為兩大類型。與宮頸癌及其他外生殖器癌密切相關的，能夠用引起宮頸上皮內高度病變的為高危型(highrisktypes)，主要包括hpv16、18、33、35、39、45等。主要與尖銳溼疣相關，引起其他宮頸上皮內低度病變的為低危型(lowrisktypes)，主要包括hpv6、11、40、42、43、44等。hpv基因分型檢測對於尖銳溼疣患者的治療及hpv感染人群的宮頸癌篩查和癌前病變的早期篩查，具有重要的臨床意義。
針對hpv檢測有很多種方法，主要包括hpv-dna檢測，hpv-rna檢測，hpv抗體檢測，hpv相關蛋白檢測等等。其中針對hpv–dna的檢測是目前臨床應用最為廣泛的，根據其方法不同可以分為多種亞型混合檢測和各種亞型獨立檢測，以螢光定量pcr法為代表，因其能同時檢測多種hpv亞型，特異性及靈敏度都較高，可以同時對多種亞型進行定性及定量測試。環介導等溫核酸擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是針對目的基因的6個特異性部位設計4條引物，利用同時具有鏈置換活性和dna聚合酶活性的bstdna聚合酶，在恆定溫度條件下，高效擴增目的基因的核酸擴增技術。
中國專利201610333820.1公開了一種非診斷、治療目的的快速篩查多種hpv亞型的引物和方法，引物為f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4或與上述引物對的核苷酸互補序列，該方法不需要探針和飽和螢光染料即可通過熔解曲線分析方法鑑定多種hpv亞型，降低了人工和試劑成本。中國專利200810025867.7公開了一種dna微陣列晶片，特別是涉及人乳頭瘤病毒(hpv)高危和低危亞型分型dna微陣列晶片，該晶片採用固相載體基片，配合hpv各亞型的寡核苷酸探針，製備成dna微陣列晶片，可以高靈敏度、高特異性的一次性同時檢測多個樣本的hpv高危和低危型亞型，可以廣泛應用於hpv病毒感染定性和分型檢測。然而現有技術中，關於本發明檢測hpv常見亞型的引物組及檢測體系，目前還未見報導。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是針對現有技術中的不足，提供一種用於檢測hpv常見亞型的引物組。
本發明的第二個目的是針對現有技術中的不足，提供如上所述引物組的用途。
本發明的第三個目的是針對現有技術中的不足，提供一種用於檢測hpv常見亞型的試劑盒。
本發明的第四個目的是針對現有技術中的不足，提供一種lamp法檢測hpv常見亞型的檢測體系。
為實現上述第一個目的，本發明採取的技術方案是：
一種用於檢測hpv常見亞型的引物組，所述引物組由下列核苷酸序列對組成：
進一步，所述hpv常見亞型為hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44。
為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是：
如上所述的引物組在製備hpv常見亞型檢測試劑中的應用，所述hpv常見亞型為hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44。
如上所述的引物組在製備hpv常見亞型檢測試劑盒中的應用，所述hpv常見亞型為hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44。
為實現上述第三個目的，本發明採取的技術方案是：
一種用於檢測hpv常見亞型的試劑盒，所述的試劑盒包含如上所述的引物組，所述hpv常見亞型為hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44。
進一步，所述的試劑盒包含以下檢測組分：
進一步，所述試劑盒還包括記載有如下方法的載體：反應條件：65℃60min，95℃10min。
為實現上述第四個目的，本發明採取的技術方案是：
一種lamp法檢測hpv常見亞型的檢測體系，所述hpv常見亞型為hpv6、hpv11、hpv16、hpv42、hpv43和hpv44；所述檢測體系包括如上所述的引物組及檢測組分。
本發明優點在於：
1、本發明針對尖銳溼疣患者常見的6種亞型，設計得到了多套合適的lamp引物組，並通過實驗篩選獲得了seqno.1-24所述的引物序列，該引物序列特異性十分優異，且靈敏度高，顯著優於其它引物，可用於hpv常見亞型的分型檢測。
2、本發明的檢測體系中，所述引物濃度經過實驗對比，最終確認為fip，bip引物濃度為40umol/l，f3，b3引物濃度為5umol/l，該條件下具有擴增效率高的優點。
3、本發明的檢測體系中，所述dntps選用10mm濃度，該濃度下可顯著提高擴增效率。
4、本發明針對尖銳溼疣及常見皮膚疣體感染的hpv的6種亞型(6.11.16.42.43.44型)設計並驗證了各自的lamp引物及反應體系。使用上述反應體系可以有效擴增模板中的特定hpv亞型dna，通過驗證該體系的特異性及靈敏度，與現有的方法比較，本發明的lamp體系靈敏度均優於目前臨床使用的方法。本發明的檢測體系可為臨床提供一種簡單，快速，判讀方便，特異性高，靈敏度高的hpv分型檢測方法。
附圖說明
附圖1為hpv6型lamp引物設計示意圖。
附圖2為lamp反應後反應管指示劑顏色示意圖。
附圖3為loopamp實時濁度測定儀結果畫面。
附圖4為lamp產物電泳結果示意圖。
附圖5為lamp特異性實驗顯色劑及電泳結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施方式，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明記載的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1
1材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1樣本相關資料
從上海市第十人民醫院和上海市第十人民醫院分院2014年7月至2016年10月間門診及住院病人中選取627份均確認為生殖器疣體症狀的病史。年齡，性別無統計學差異，排除各類其他皮膚炎症性感染。選取病人樣本均在手術或藥物治療之前。病人手術切除的疣體，皮膚表面取得的脫落皮屑或是生殖道拭子等進行洗脫並保存於3mlhpv樣本保存液中。
1.1.2hpv分型樣本收集
以上624份樣本均使用透景流式螢光雜交法檢測樣本中hpv感染及分型情況。挑選出單一hpv-6，hpv-11，hpv-16，hpv-42，hpv-43，hpv-44的樣本。根據其最終螢光讀數挑選出模板濃度較高的樣本。篩選後獲得hpv-6型30例，hpv-11陽性30例，hpv-16陽性22例，hpv-42陽性20例，hpv-43陽性30例，hpv-44陽性20例，總計152例。以上樣本取保存液，使用qiagenblood&tissuekit進行再次抽提dna，並使用朗報脫氧核糖核酸擴增試劑盒(環介導等溫擴增法)進行lamp擴增，確認實驗設計的引物效率及lamp體系是否工作。
1.1.3尖銳溼疣石蠟包埋塊樣本收集
取40例(n＝1-40)明確病理診斷為尖銳溼疣的組織石蠟包埋塊，除外其他類型的疣體及各類良惡性皮膚病變。經由tiangen石蠟包埋組織dna快速提取試劑盒抽提取得dna作為模板。
1.2.1lamp相關設備
abi-7500螢光定量pcr儀(賽默飛世爾科技)；
vortex-2漩渦混合器；
bioermb-102震蕩型恆溫金屬浴；
effendorfcentrifuge5424r高速冷凍離心機。
1.2.2pcr對照方法相關設備
luminnex200流式點陣儀(透景生物)
loopamp實時濁度測定儀(榮研生物)
1.2.3核酸電泳相關設備
tanoneps300電泳儀(天能)
tanon1600凝膠成像分析儀(天能)
ja2103電子分析天平
1.3試劑與試劑盒
試劑盒
人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒流式螢光法(透景生物)
loopamp朗報脫氧核糖核酸擴增試劑盒環介導等溫擴增法(榮研生物)
dna提取相關
tiangen石蠟包埋組織快速提取試劑盒(天根)
dneasyblood&tissuekit(qiagen)
lamp反應體系
bstdna聚合酶8000u/ml(biolabs)
dntpsmixture溶液10mm(上海生工生物科技)
羥基萘酚藍(hnb)3mol/l(榮研生物)
1:1000稀釋，最終使用hnb濃度為3mmol/l
核酸電泳相關試劑
agaroseregular(takara)
10xloadingbuffer(takara)
50xtaeconcentratesolution(上海生工生物科技)
sybrgreen核苷酸染料(上海生工生物科技)
dnamarker-d2000bbi(上海生工生物科技)
實驗用純水
milli-q超純水儀
1.4基因模板提取
1.4.1透景試劑盒提取
(1)輕微振蕩懸浮起保存液中的脫落細胞，取50ul樣品於1.5ml離心管中，如果有顆粒狀物體(疣體)用槍頭搗碎，確保有一部分取入離心管。
(2)12000pm離心3分鐘，小心取上清並丟棄。
(3)加入200核酸提取緩衝液，振蕩混勻，將離心管放入金屬衡溫浴100℃10min。
(4)12000rpm離心5分鐘，移取上清至一新的離心管內備用。
1.4.2qiagen試劑盒抽提dna
(1)輕微振蕩懸浮起保存液中的脫落細胞，取50ul樣品於1.5ml離心管中，如果有顆粒狀物體(疣體)用槍頭搗碎。
(2)加入180ulbufferatl，20ulproteinasek,振蕩混勻後置於56℃水浴10分鐘。
(3)加入200ulbufferal漩渦儀振蕩混勻後置於56℃水浴10分鐘。
(4)加入200ul無水乙醇並振蕩混勻後，加入濾過柱，高速離心8000rpm1分鐘，棄去收集管中液體。
(5)濾過柱中加入500ulbufferaw1，高速離心8000rpm1分鐘，棄去收集管中液體。
(6)濾過柱中加入500ulbufferaw2，高速離心14000rpm3分鐘，棄去收集管中液體。
(7)更換新的無菌收集管後，加入200ulbufferae室溫(15-25℃)靜置一分鐘，高速離心8000rpm1分鐘。並重複該步驟一次。取得dna模板溶液保存於-20℃備用。
1.4.3石蠟包埋組織dna模板抽提
(1)取石蠟切片(5-10um厚，1cm2面積)5-8張，置於無菌離心管中。
(2)加入500ul裂解液gl，50ul裂解液gp劇烈渦旋10秒。98℃金屬浴30分鐘以上，直至樣本完全溶解。
(3)12000rpm高速離心5分鐘。吸取中間層水相清液，再加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻後靜置3分鐘。混合液加入濾過柱cr2，高速離心8000rpm2分鐘，棄去收集管中液體。
(4)在濾過柱中加入500ul緩衝液gd，高速離心8000rpm1分鐘，棄去收集管中液體。
(5)在濾過柱中加入600ul漂洗液pw，高速離心8000rpm1分鐘，棄去收集管中液體。並重複此步驟一次。
(6)濾過柱高速離心12000rpm2分鐘，棄去收集管中液體，開蓋置於室溫2-5分鐘。
(7)更換新的無菌收集管後，加入100ulddh2o，室溫靜置2-5分鐘。高速離心12000rpm2分鐘。取得dna模板溶液保存於-20℃備用。
1.5lmap引物設計與合成
首先根據genebank中已知的hpv6,11,16,42,43,44六種亞型的已知序列，進行對比和同源性分析，並查閱相關文獻確定其保守序列。本實驗引物主要針對的保守區域處於hpv的e6，e7，l1這三個區域。實驗中hpv-6和hpv-11型目的基因位於各自的e6區域，hpv-16型目的基因位於e7區域，hpv-42型，hpv-43型，hpv-44型位於各自的l1區域。
使用目的基因序列如下hpv-6(hg793938.1)；hpv-11(ku298879.1)；hpv-16(kp313775.1)；hpv-42(ku298897.1)；hpv-43(he962401.1)；hpv-44(he963128.1)。設計f3，b3，fip，bip四個一組的引物數套。如圖1所示，設計的hpv6型引物設計位點及四條引物的區域。
lamp因其環狀引物特徵，其f1c段和b1c段的tm值要比其他幾條引物高5℃左右，這樣的引物組f1c和b1c更容易匹配形成環狀結構。環狀結構的引物對於引物間隔也有最優反應條件，要求f2的5』端至b2的5』端距離為120-180bp，f2的5』端至f1c的3』端，也就是末端的莖環結構長度為40-60bp。f2的5』端至f3的3』端長度為0-20bp。另外，引物中gc含量儘量控制在40-60％，並計算3』和5』末端的安定性。再對引物二級結構進行篩選，並進行預實驗，篩選擴增效率最高的引物，最終選取六個亞型的環狀引物。如表1。
表1hpv亞型環狀引物及設計位點表
按照上表由上海生工生物工程股份有限公司合成引物，獲得引物的初始濃度為100umol/l。使用ddh2o進行稀釋，本實驗使用的fip，bip引物濃度為40umol/l，f3，b3引物濃度為5umol/l。
1.6透景流式螢光法操作
按照透景人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒流式螢光法操作，其pcr擴增體系如表2。
表2流式螢光法pcr體系
以上體系進入abi7500螢光定量pcr儀進行擴增，設置循環如下：①95℃，退火5分鐘。②95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，5次預循環。③95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，擴增35個循環。④72℃3分鐘，終止反應。
取pcr反應產物3ul，加入雜交反應板，每孔加入微球雜交液22ul，振蕩混勻。使用封口膜封住反應板。在pcr儀中進行雜交反應，99℃變性5分鐘，48℃雜交30分鐘。然後每孔加入75ul鏈黴親和素-藻紅蛋白(sa-pe)，48℃孵育15分鐘後，進入luminnex200流式點陣儀讀數。實驗使用humanβ-globin做為陽性內對照，其讀數大於150代表實驗有效，低於150代表未獲得人類細胞基因模板，或者是試劑儀器出現問題。
1.7loopamp朗報環介導等溫擴增法主要操作
按照朗報環介導等溫擴增法試劑盒說明書建立pcr擴增體系如表3。
表3朗報環介導等溫擴增pcr體系
反應體系加入反應試管後進入loopamp實時濁度測定儀在65℃下恆溫擴增50分鐘，95℃下恆溫2分鐘，使酶滅活以終止反應。實時濁度記錄的擴增曲線圖可直接讀取結果，但終點濁度值與初始模板量之間沒有相關性。僅以濁度上升和hnb顏色發生變化來判斷lamp循環有無產生。因lamp反應容易出現假陽性，每次試驗均加入對照反應組，對照反應組使用引物溶液dna(pmdna)代替試驗設計的4條引物。每次試驗均需對照組為陰性，來證明試驗結果有效，未發生汙染。
1.8自建lamp體系擴增主要過程
實驗使用newenglandbiolabsbstdna聚合酶，濃度為8000u/ml，恆溫反應最佳溫度為65℃。bst酶兼具鏈置換活性和dna聚合酶活性，可以介導完成lamp環狀擴增反應。4條環狀引物中fip，bip引物濃度為40umol/l，f3，b3引物濃度為5umol/l。bst配套的mgso4濃度為100mm,dntps濃度為10mm。顯色劑羥基萘酚藍(hnb)濃度為3mmol/l。建立反應體系如表4。
表4實驗設計的lamp擴增體系
因為amp反應靈敏度很高，混入極其微量的dna模板就可能導致假陽性的產生。故試劑配置和加樣均在超淨工作檯內進行，在檢測反應產物時，在配置世界和加樣操作的房間以外的其他房間進行。所有試劑配置均置於冰上進行操作，再經由滅菌傳遞倉傳遞至另一房間進行加樣。使用過的房間和設備均需進行紫外消毒後再進行後續實驗。
反應體系加入pcr反應管後，進入abi-7500pcr儀進行擴增，設定循環為65℃60min95℃10min。之後可直接根據顯色劑hnb顏色判斷有無lamp循環產生。反應產物經傳遞倉送至另一間實驗室內進行核酸電泳。
1.9瓊脂糖核酸電泳
lamp擴增產物在2％的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓120v，電泳20分鐘。loadingbuffer中添加sybrgreen進行核酸染色，電泳後放入tanon1600凝膠成像分析紫外下成像。lamp反應最終產物中包含循環數不等的目的基因正反銜接序列以及循環數不等的莖環狀反應中間產物。因此電泳後會生成一條連續，在末端形成梯狀的特異性條帶，明顯區別於普通pcr產物結果。而未能產生lamp擴增的樣本則因為其引物濃度較高，大多出現明顯得引物二聚體。
1.10尖銳溼疣樣本hpv分型檢測
保存的627例尖銳溼疣患者病變組織dna模板使用透景人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒流式螢光法試劑盒，經流式螢光法測定標本包含的hpv亞型情況。共包括(hpv6，11,16,18,26,31,33,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,55,56,58,59,61,66,68,81,82和83)27種。結果螢光讀數高於150的為陽性，低於150為陰性。實驗使用humanβ-globin作為陽性內參，其讀數低於150則表示pcr體系內無足夠人細胞來源dna，實驗無效。
根據實驗結果計算尖銳溼疣患者人群中hpv的感染率，在感染hpv的標本中計算各個分型的分布情況，以及單一和混合感染例數及其hpv亞型。將所得的結果使用spss12.0進行統計學分析。按照感染情況分組使用二項式分布(95％)計算陰性，陽性的預期值。將樣本按照年齡分為≤25歲,26–30歲,31–40歲,41–50歲,51–60歲和≥60歲共計6個組，分析年齡段hpv亞型感染情況，使用p檢驗分析其是否具有統計學意義。取p<0.05做為判斷標準。
1.11loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒驗證
由透景流式螢光雜交法篩選獲得的單一陽性樣本總數152例。其中包括hpv-6型30例，hpv-11陽性30例，hpv-16陽性22例，hpv-42陽性20例，hpv-43陽性30例，hpv-44陽性20例。按照loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒操作說明分別檢測其hpv分型情況。結果判斷以loopamp實時濁度測定儀出現陽性上升峰和hnb顏色轉變為藍色來判讀，均符合陽性特徵為陽性結果。同時加入陰性對照，以陰性對照正常為實驗有效的前提。
1.12自建lamp體系檢測hpv分型情況
以上164例樣本dna使用自建體系進行lamp擴增，分別檢測其hpv分型情況。產物進行瓊脂糖核酸電泳，判斷標準為hnb轉變為藍色，核酸電泳出現特異性條帶為陽性。每批實驗均加入陰性對照，以陰性對照正常為實驗有效的前提。
1.13自建lamp體系特異性驗證
從實驗數據中挑選出確認為單一感染hpv6.11.16.42.43.44型的dna模板保存液各5支。每支各吸取2ul，混合成7種亞型的陽性模板混合液，放置於-20℃冰箱備用。使用七排八聯管，每排第一反應管為陰性對照，其餘各組分布加入實驗設計的hpv-6,11，16,42,43,44型環狀引物及其他lamp反應組分。然後從第一排起分別加入預混的hpv6.11.16.42.43.44型陽性混合dna模板。按照實驗設計步驟進行lamp擴增後，由顯色劑hnb顏色變化和電泳結果判斷6種亞型的特異性。並對反應產物進行瓊脂糖核酸電泳，驗證其是否產生特異性條帶。
1.14自建lamp體系靈敏度驗證
根據透景流式螢光雜交法結果，在保存的樣本dna中選取兩組初始dna模板。選取的樣本均為單一型hpv感染。高濃度組選取各個亞型中微球螢光值較高的模板dna10個，低濃度組選取各個亞型中微球螢光值較低的模板dna10個。混合後獲得高低濃度兩組模板dna各7個，分別含有各自亞型的dna。
將高濃度組dna模板進行1:10稀釋8次，每組亞型獲得10-1至10-8梯度濃度模板8個。低濃度組進行以下稀釋，每組獲得1:5,1:10,1:20,1:30,1:50,1:80,1:100響應稀釋濃度的dna模板8個。以上dna模板依次編號後放置於-20℃冰箱備用。
兩組模板分別按照實驗設計體系進行lamp擴增和流式螢光雜交法檢測hpv分型基因，lamp產物進行電泳，以是否出現特異性條帶判斷陰陽性。以結果對比來比較實驗設計體系lamp擴增方法和現臨床使用檢測方法的靈敏度差異。
1.15尖銳溼疣病理樣本lamp驗證
40例(n＝1-40)明確病理診斷為尖銳溼疣的組織石蠟包埋塊，排除其他類型的疣體及各類良惡性皮膚病變。經由tiangen石蠟包埋組織dna快速提取試劑盒抽提取得dna作為模板，放置於-20℃冰箱備用。
40例樣本dna分別進行流式螢光雜交法與lamp擴增，lamp產物通過電泳確認是否產生特異性條帶，結果進行對比。觀察兩種方法測得的hpv感染的差異。
2結果與分析
2.1尖銳溼疣樣本hpv分型檢測
627例尖銳溼疣患者樣本中hpv亞型經流式螢光雜交法檢測，其中367例為陽性，感染亞型情況見表5。
表5：367例hpv陽性樣本中hpv亞型的分布
2.1.1尖銳溼疣中hpv感染率
627例樣本中男性為251例(40.35％)，女性為376例(59.95％)，性別分布無統計學意義。總體年齡分布為33.99±10.14歲，經流式螢光雜交法檢測，其中367例為陽性，存在hpv感染，年齡分布為32.98±7.29歲。246例為陰性，未測得hpvdna存在，年齡分布為35.42±10.14歲。hpv陽性率在性別上無統計學差異(p＝0.170)。在所有的陽性結果中，高危型感染率為58.58％，低危型感染率為73.02％。男性感染者中，有124例為hpv低危型感染(124/145＝85.52％),66例為hpv高危型感染(66/145＝45.52％)。女性感染者中，有144例為hpv低危型感染(144/222＝64.86％),149例為hpv高危型感染(149/222＝67.12％)。男性感染者中，有58例為兩種以上hpv亞型混合感染(58/145＝40％),在女性群體中則為103例(103/222＝46.4％)。見表6。
表6按性別分組hpv陽性分布
2.1.2hpv亞型分布情況
在所有的hpv陽性結果中最多的5種亞型如下，hpv-6型(158/367＝43.05％),hpv-52(48/367＝13.08％),hpv-11(46/367＝12.53％),hpv-16(45/367＝12.26％),hpv-59(29/367＝7.9％)。在單一亞型感染(n＝206)中，最多的五種亞型是hpv-6型(83/206＝40.29％),hpv-11(28/206＝13.59％),hpv-16(14/206＝6.8％),hpv-52(12/206＝5.86％),hpv-51(7/206＝3.40％)。共有161例兩種以上hpv亞型混合感染情況，92例屬於兩種hpv亞型感染(92/367＝25.07％)，69例則是3種或更多亞型混合感染。單一感染的男性和女性群體中，hpv陽性最高的亞型都是hpv-6，分別是30.51％(36/118)和53.41％(47/88)。而在兩種亞型混合感染的群體中，男性出現最多的陽性組合是hpv-6，hpv-52(4/62＝6.45％)和hpv-42,hpv-52(4/62＝6.45％)。女性群體最高的陽性組合是hpv-6,hpv-16和hpv-6,hpv-4，百分比均為3.33％(2/30)。三種或更多hpv亞型混合感染在女性組裡有40例(40/220＝18.18％)，男性組為29例(29/147＝19.73％)。所有三種以上亞型感染的情況，其感染的亞型組合在本實驗中均只出現一次，無統計價值。取95％可信區間，使用二項式分布計算陽性，陰性預期值，所得結果顯示本實驗所有結果均處於預期值範圍內。見表7。
表7按性別分組的hpv亞型感染分布
2.1.3年齡組hpv陽性分布
將樣本按照年齡分為≤25歲,26–30歲,31–40歲,41–50歲,51–60歲和≥60歲共計6個組。大多病人集中於50歲及以下，超過50的病人例數較少。hpv陽性率最高的兩組為，≤25組陽性率61.32％(65/106)，26-30歲組陽性率69.01％(118/171)。見表8。
表8按年齡分組的hpv陽性結果分布
按年齡組別對陽性率進行p檢驗。取95％可信區間，p<0.05。結果顯示年齡組別間有一定的差異。特別是29-30歲組和41-50歲組之間有明顯統計學差異，p<0.001。見表9。
表9按年齡分組的hpv陽性率p檢驗結果
2.2自建lamp體系與loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒結果
2.2.1結果判斷
按照loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒操作說明由loopamp實時濁度測定儀實時測定濁度變化，出現明顯上升峰為陽性，並可觀察到反應管顏色由淡紫色轉變為淡藍色。結果示意如圖2和圖3所示。圖2中左起第一管為陰性對照，第1，2，4，6，7號反應管未變色為陰性結果，第3，5號反應管hnb轉變為藍色，判斷為陽性反應。圖3中a組a5藍色，a7黃色，a8棕色，b組b3淺綠色樣本濁度線出現明顯上升峰，判讀為陽性結果，該濁度系統不能設置基線，故其餘反應孔中雜波無法去除，但均無明顯上升峰段，結果為陰性。
自建lamp體系中顯色劑系統和loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒一致，反應管顯色反應和圖2一致。再使用瓊脂糖核酸電泳來確認產物是否出現lamp特異性條帶，結果見圖4。如圖所示，lamp反應最終產物中包含循環數不等的目的基因正反銜接序列以及循環數不等的莖環狀反應中間產物，故陽性條帶為特異性連續條帶，末端可出現明顯梯狀結構。圖4中第一條電泳道為dl2000dnamarker，第二條電泳道為陰性對照，第4.6,9,12.13.14條電泳道出現明顯連續梯狀特異性條帶，結果為陽性。陰性對照和其餘電泳道因為引物濃度較高故顯示出明顯的引物二聚體，未見特異性條帶，判讀為陰性。
2.2.2loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒與自建lamp體系結果對比
使用兩種lamp體系檢測7種hpv亞型，結果見表10。loopamp試劑盒體系陽性率最高的亞型為hpv-6型，30例中陽性為27例，陽性率90％，陽性率最低的的亞型為hpv-18型，12例中5例為陽性，陽性率41.6％(18亞型的數據已刪除)。兩種方法的陽性符合率較高，最高為hpv-18，12例均符合，符合率100％，最低為hpv-42型，20例中3例不符合，符合率85％。結果上看自建lamp體系的陽性率略低於loopamp試劑盒體系。6組亞型中僅有42型自建體系陽性率高於loopamp試劑盒體系。
表10loopamp與自建lamp體系結果對照表
2.3lamp體系特異性實驗
6組亞型特異性實驗所得的結果中，所有的陰性對照孔均顯示為藍色，其電泳結果也均顯示無特異性條帶，表示實驗未發生汙染，結果可靠。每組均在引物和模板匹配的反應管位置出現hnb的顏色變化，其核酸電泳結果也出現了明顯的特異性條帶。當模板加入其它引物組的反應體系中，則經恆溫擴增後，顯色劑hnb依然為淡紫色，核酸電泳結果只顯示引物二聚體，未見梯狀連續的特異性條帶。見圖5。
2.4lamp體系靈敏度驗證
低濃度組初始的微球螢光讀數在200-300左右。稀釋後使用流式螢光雜交法檢測，hpv-6型，hpv-16型，hpv-42型和hpv43型均在稀釋至1:10的濃度無法測出hpv基因，hpv-11型1:5稀釋就沒有測出hpvdna，hpv-44則在1:15稀釋度上無法測得陽性。而使用lamp擴增的體系，均至少在1:50稀釋度上依然出現陽性。見表11。
表11低濃度組靈敏度實驗結果表
(t表示流式螢光雜交法l表示自建lamp擴增體系)
高濃度組初始的微球螢光讀數在2000左右。稀釋後使用流式螢光雜交法檢測，hpv-6型，hpv-11型，hpv-42型稀釋至10-4濃度無法測出hpv基因，hpv-16，hpv-43型10-5稀釋就沒有測出hpvdna，hpv-44和hpv-44型則在10-3濃度上無法測得陽性。而使用lamp擴增的體系，最低的陽性稀釋度是hpv-16型，在10-6稀釋度下依然為陽性，而hpv-6，hpv-42，hpv-43，hpv-44型則在10-5稀釋度上顯示為陽性。hpv-11型最低可測得hpv陽性的稀釋度為10-4。見表12。
表12高濃度組靈敏度實驗結果表
(t表示流式螢光雜交法l表示自建lamp擴增體系)
2.5lamp檢測尖銳溼疣病理切片結果
40例樣本(n＝1-40)經過lamp檢測共測得hpv陽性反應30例，其中hpv6型18例，11型7例，16型1例，42型1例，43型2例，44型2例。其中有一例為43.44型混合陽性。
40例樣本(n＝1-40)經普通pcr擴增後，使用透景流式螢光雜交系統檢測hpv分型情況，結果有38例與lamp體系一致，其中no.22號樣本lamp方法為陰性，流式螢光法測得hpv6型陽性，no.30號樣本，lamp法為hpv6型陽性，流式螢光法為hpv6型，44型混合陽性。總體符合率為(38/40)90％。見表13。
表13lamp與流式螢光雜交法檢測結果表
3討論
3.1lamp體系的優化
lamp體系的特異性和靈敏度很大程度上是由設計的環狀引物決定的。現有文獻報到的lamp研究使用的引物各不相同。本發明設計的基因位點均事先經過序列對比，選取保留序列，設計得到的f3，b3也回溯至genebank匹配其目的基因，確保其特異性可以進行後續實驗。
本發明在試驗初始每種亞型都設計了至少5條引物，經過預試驗篩選出特異性最高，擴增效率最高的引物來繼續接下去的實驗
本發明的檢測體系中，引物濃度經過實驗對比，最終確認為fip，bip引物濃度為40umol/l，f3，b3引物濃度為5umol/l，該條件下擴增具有效率高的優點。
根據預試驗，dntps選用10mm濃度，會明顯提高擴增效率。在60-65℃的溫度範圍內，bst酶均能有效完成鏈置擴增反應。改變mg2+濃度對於實驗影響不大。反應體系中添加甜菜鹼可以提高反應的特異性和擴增效率。本實驗中發現是否添加甜菜鹼對於反應無明顯影響。
3.2lamp體系與其他方法的對比
本發明通過目前臨床使用的流式螢光雜交法方法確認了152例6種hpv亞型單一感染的dna樣本。使用loopamp脫氧核糖核酸環介導等溫擴增法和實驗設計的lamp擴增體系分別進行檢測，結果顯示符合度最高的為hpv-6型，符合率為90％。其餘亞型基本都在80％以上，上述結果表明所設計的lamp引物可以正確匹配目的基因，並誘導發生鏈置換擴增反應。lamp體系可以有效的檢測出相應的hpv亞型。而與loopamp脫氧核糖核酸環介導等溫擴增法結果的符合度較高，也說明了實驗建立的體系可以在一定程度上達到該試劑盒使用的環介導等溫擴增效率。
3.3lamp實驗的方法學評價
在特異性實驗中，本發明的6組引物體系均表現出了較好的特異性結果。未在型別間產生交叉汙染，特異性較高。引物也均經過blast同源比較，確保其匹配序列的正確。特異性實驗表明，最後的lamp反應和實驗設計理論相一致，得到了預期的實驗效果。
在靈敏度實驗中，所有lamp實驗組的靈敏度均高於現在使用的流式螢光雜交法。在低濃度組中有4個亞型在稀釋100倍後依然沒有達到最低可以檢測到的靈敏度，而在高濃度組實驗中，lamp擴增的可檢測到的濃度比傳統pcr法高10-103不等，其中44型最高，可比傳統pcr多稀釋1000倍的濃度下測得陽性，43型和11型最低，在多稀釋10倍的情況下可以測得陽性。lamp擴增靈敏度高的同時也給實驗帶來了更多的幹擾，假陽性的出現率也明顯高於傳統pcr方法。通過優化實驗步驟，規範實驗操作來降低假陽性的幹擾，是lamp實驗的最大課題。相對於傳統pcr法，本發明的lamp擴增更靈敏，方便，直觀，特異性也更高。對於各類病原體dna的檢測提供了另一種思路。
3.4尖銳溼疣病理樣本lamp驗證
使用自建lamp體系檢測40例病理確診為尖銳溼疣的石蠟切片，所得結果為6型(18/40)45％，11型(7/40)17.5％，44型.43型為(2/40)5％,42型.16型為(1/40)2.5％。所得結果符合尖銳溼疣患者hpv感染情況的預期。
lamp結果與r流式螢光雜交法的符合率為(38/40)95％。說明自建體系中引物能夠有效結合目的基因位點，bst酶及其他反應體系能夠有效完成lamp環狀擴增反應。顯色劑系統和電泳系統高度符合，表明目測體系可以有效工作，簡單迅速的顯示lmap反應是否完成。自建體系中的引物經試驗表明設計針對的目的基因，可以特異性的代表hpv相應分型，並有效的和目的基因相結合，引發lamp反應。
4結論
(1)本發明對尖銳溼疣患者病變部位感染的hpv基因型分布進行了調查。分析了不同性別，年齡群組中hpv分型感染的具體情況。綜合感染亞型類別，數量等情況，為尖銳溼疣患者hpv感染情況的預估和針對治療，以及潛在宮頸癌的防治提供了參考依據。
(2)本發明對lamp反應體系中的影響因素進行了研究。討論了各個組分的濃度和組成對檢測結果的影響。最終得出lamp反應體系如下：總反應體系為25ul，包括bst酶1ul，hnb1ul，濃度為3umol/l，dntp3.5ul10mm，buffer2.5ul，mgso41.5ul，4條引物各1ul，其中f3，b3濃度為5umol/l，fip，bip濃度為40umoml/l，ddh2o9.5ul，dna模板2ul。反應條件：65℃60min95℃10min。
(3)本發明針對尖銳溼疣及常見皮膚疣體感染的hpv的6種亞型(6.11.16.42.43.44型)設計並驗證了各自的lamp引物。使用上述反應體系可以有效擴增模板中的特定hpv亞型dna。驗證了該體系的特異性及靈敏度，並和現有方法和商品化環介導等溫擴增試劑盒進行了比較，獲得了滿意的結果。並最後使用病理確診的石蠟包埋組織提取的dna進行了驗證。
實施例2
使用目的基因序列如下hpv-6(hg793938.1)；hpv-11(ku298879.1)；hpv-16(kp313775.1)；hpv-42(ku298897.1)；hpv-43(he962401.1)；hpv-44(he963128.1)。設計f3，b3，fip，bip四個一組的引物數套。
由透景流式螢光雜交法篩選獲得的單一陽性樣本總數164例。其中包括hpv-6型30例，hpv-11陽性30例，hpv-16陽性22例，hpv-42陽性20例，hpv-43陽性30例，hpv-44陽性20例。按照loopamp脫氧核糖核酸擴增試劑盒操作說明分別檢測不同引物組hpv分型情況。結果判斷以loopamp實時濁度測定儀出現陽性上升峰和hnb顏色轉變為藍色來判讀，均符合陽性特徵為陽性結果。同時加入陰性對照，以陰性對照正常為實驗有效的前提。統計陽性樣本數目，結果如下表所示：
表14不同引物組陽性擴增樣本數
註：表中加粗字體部分對應的引物為最後篩選獲得的引物組(即表1中記載的引物序列)。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護範圍。
sequencelisting
上海市第十人民醫院
一種lamp法檢測hpv常見亞型的引物組及檢測體系
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