傳染性造血器官壞死病病毒的高效pcr檢測方法

2023-07-18 00:25:46 2

專利名稱：傳染性造血器官壞死病病毒的高效pcr檢測方法
技術領域：
本發明涉及傳染性造血器官壞死病病毒的檢測方法。
背景技術：
傳染性造血器官壞死病毒(Infectioushaematopoietic necrosis virus,IHNV),屬彈狀病毒科(Rhabdoviridae),諾拉彈狀病毒屬(Novirhabdovirus), IHNV 是該屬代表種。IHNV病毒粒子形態呈子彈狀，有囊膜包被，對熱、酸、乙醚不穩定。IHNV病毒粒子含有一條線狀、反義、單鏈的RNA，其基因組結構從3'端至5'端依次包含N-P (Ml) -M2-G-NV-L六個基因，分別編碼病毒核蛋白、磷蛋白、基質蛋白、糖蛋白、非結構蛋白和聚合酶蛋白，現基因組測序表明IHNV基因組全長約為llkb。傳染性造血器官壞死病(IHN)是一種魚類急性全身性傳染病，世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須申報的動物疫病，為我國的二類疫病。IHNV主要危害鮭鱒魚類的魚苗及當年幼魚，並且伴隨著基因變異，IHN的宿主在不斷的擴大，更多種類的冷水魚將受到威脅。流行病學調查顯示IHNV的大規模爆發造成的虹鱒大魚死亡率約為20-35%，魚苗階段死亡率可高達100%。我國是一個漁業大國，鮭鱒魚類作為一種大型經濟魚類，在我國水產養殖中佔相當重要的地位。隨著進出口貿易的增加，IHN也被帶入了我國，1990年，遼寧本溪首次報導了 IHN在我國爆發。IHN發病高峰期造成了鮭鱒魚魚苗階段的大規模死亡(高達100% )，使我國鮭鱒魚產量急劇下降。IHN已經發展成為制約我國冷水魚養殖健康可持續發展的關鍵因素。目前我國尚沒有有效的預防和治療IHN的疫苗與藥物問世，為了保護水產養殖業健康發展，需要對流通的鮭鱒魚類進行嚴格檢驗避免病毒流入，以及對已發現該病的養殖場進行疫情控制、防止疫情傳播惡化。目前IHNV檢測方法主要包括核蛋白基因特異性探針原位雜交、免疫組織化學、ELISA方法和核蛋白基因RT-PCR方法等。在這些方法中，PCR被證明是最迅速和最靈敏的方法，但是，研究表明核蛋白基因並不是IHNV基因組中豐度最高的基因，利用其為目標蛋白進行病毒檢測不是敏感性最好的方法，容易在病毒含量低的感染早期及後期攜帶時無法診斷。

發明內容
本發明是要解決現有的檢查傳染性造血器官壞死病毒的PCR方法存在敏感性不高的問題，而提供傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法。傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法，按以下步驟進行:一、根據Genbank資料庫中IHNV聚合酶蛋`白的基因序列(登錄號:L40883)，利用Primer Premier5.0選取聚合酶蛋白的基因保守區段設計一對特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr ；二、取無傳染性造血器官壞死病臨床症狀魚的待檢測病料，置於小型勻漿器內，於冰上研磨3-5min,然後以3000g離心5min,棄去沉澱,上清液經過0.22 μ M —次性濾器過濾除菌，獲得無菌勻漿上清液，再利用MEM培養基將無菌勻漿上清液進行1000倍稀釋，獲得組織濾液；三、培養瓶中EPC細胞傳代長成緻密單層細胞後，吸棄培養液後，用Hanks液洗滌2次，接入ImL步驟二中所得組織濾液，置於15°C培養箱中吸附lh，吸棄組織液，加入5mL細胞培養維持液，15°C恆溫培養，利用倒置顯微鏡每日觀察細胞病變情況，當70% -80%的EPC細胞發生病變崩解後，吸取100 μ L細胞培養液進行病毒的RNA提取，獲得IHNV的RNA ；四、以IHNV的RNA為模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr為特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物；五、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在825bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在825bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測；其中步驟一中特異性引物的上遊引物IHNV-Lf的核苷酸序列:5』-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3』，下遊引物 IHNV-Lr 的核苷酸序列:5』 -CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3』:步驟三中細胞維持液為含·有2% FBS的MEM培養基。本發明傳染性造血器官壞死病病毒的高效檢測方法具有很好的特異性，不與VHSV(病毒性出血性敗血症病毒)存在交叉反應；本發明以聚合酶蛋白作為檢測目標，利用特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr進行的檢測，靈敏度高，其最低檢測限為102，當病毒核酸數量不小於100個拷貝即可以檢測出陽性結果，而現有以核蛋白為檢測目的蛋白並利用IHNV-Nfl/IHNV-Nrl和IHNV-Nf2/IHNV_Nr2為引物進行的巢式PCR方法檢測，靈敏度低，最低檢測限為103，當病毒核酸數量不小於1000個拷貝才可以檢測出陽性結果。本發明傳染性造血器官壞死病病毒的高效檢測方法，操作簡單，準確度高、靈敏且低濃度下敏感性很好，檢測成本相對較低，只通過一輪PCR檢測就可以檢測出不小於IO2的病毒，與現有巢式PCR(2輪PCR)相比更節省時間。


圖1為實施例中PCR擴增結果的電泳圖，其中M:DL2000marker，泳道1:以IHNV的RNA為模板；圖2為實施例中以聚合酶蛋白為目標基因的PCR檢測靈敏度的電泳圖，其中M:DL2000marker, N:陰性對照，泳道1-4 =IO4UO3UO2UOi拷貝數病毒粒子；圖3為實施例中以核蛋白為目標基因的PCR檢測靈敏度的電泳圖，其中M:DL2000marker, N:陰性對照，泳道1-4 =IO4UO3UO2UOi拷貝數病毒粒子；圖4為實施例中以核蛋白為目標基因的巢式PCR檢測靈敏度的電泳圖，其中M:DL2000marker, IO2:102拷貝數病毒為模板的巢式PCR產物；圖5為實施例中PCR特異性檢測的電泳圖，其中M:DL2000marker，N:陰性對照，泳道 1:VHSV，2:1HNV。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一:本實施方式傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法，按以下步驟進行:一、根據Genbank資料庫中IHNV聚合酶蛋白的基因序列(登錄號:L40883)，利用Primer Premier5.0選取IHNV聚合酶蛋白的基因保守區段設計一對特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr ；二、取無傳染性造血器官壞死病臨床症狀魚的待檢測病料，置於小型勻漿器內，於冰上研磨3-5min,然後以3000g離心5min,棄去沉澱,上清液經過0.22 μ M —次性濾器過濾除菌，獲得無菌勻漿上清液，再利用MEM培養基將無菌勻漿上清液進行1000倍稀釋，獲得組織濾液；三、培養瓶中EPC細胞 傳代長成緻密單層細胞後，吸棄培養液後，用Hanks液洗滌2次，接入ImL步驟二中所得組織濾液，置於15°C培養箱中吸附lh，吸棄組織液，加入5mL細胞培養維持液，15°C恆溫培養，利用倒置顯微鏡每日觀察細胞病變情況，當70% -80%的EPC細胞發生病變崩解後，吸取100 μ L細胞培養液進行病毒的RNA提取，獲得IHNV的RNA ；四、以IHNV的RNA為模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr為特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物；五、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在825bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在825bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測；其中步驟一中特異性引物的上遊引物IHNV-Lf的核苷酸序列:5』-CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3』，下遊引物 IHNV-Lr 的核苷酸序列:5』 -CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3』 ；步驟三中細胞維持液為含有2% FBS的MEM培養基。本實施方式中IHNV聚合酶蛋白的基因保守區段的核苷酸序列參見SEQ ID NO:7。本實施方式中鯉魚上皮瘤細胞(EPC)由中國水產科學研究院長江水產研究所魚病組曾令兵教授惠贈。本實施方式中涉及的反應試劑盒和DNAMarker購自TaKaRa公司；涉及的引物由哈爾濱博仕生物公司合成。本實施方式中確定結果為陽性即檢查對象感染了傳染性造血器官壞死病病毒；確定結果為陰性檢查對象沒有感染傳染性造血器官壞死病病毒。本實施方式步驟三中吸取100 μ L細胞培養液進行病毒的RNA提取，獲得IHNV的RNA，過程如下:100 μ L細胞培養液放入無RNA酶的離心管中；IOOOOg離心5min，去除沉澱；加入600 μ LTrizol裂解液，震蕩混勻，IOOOOg離心15min，吸取上清液加入到新的離心管中，加入等體積的異丙醇，反覆顛倒混勻，IOOOOg離心15min，棄盡上清，加入75%的乙醇600 μ L，顛倒洗滌，IOOOOg離心lOmin，棄盡上清，4000離心10s，吸乾管底的液體，室溫乾燥3min ;加入100 μ L的無RNA酶水，將RNA沉澱完全溶解，分裝於_80°C備用。對於具有傳染性造血器官壞死病臨床症狀的魚進行檢測，則直接從組織中提取IHNV核酸，採用本實施方式中的PCR方法進行檢測。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一的不同是步驟四中PCR擴增的反應體系為25 μ L的反應體系，由下列成分組成:
權利要求
1.傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法，其特徵在於它按以下步驟進行: 一、根據Genbank資料庫中IHNV聚合酶蛋白的基因序列(登錄號:L40883)，利用Primer Premier5.0選取IHNV聚合酶蛋白的基因保守區段設計一對特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr ； 二、取無傳染性造血器官壞死病臨床症狀魚的待檢測病料，置於小型勻漿器內，於冰上研磨3-5min,然後以3000g離心5min,棄去沉澱,上清液經過0.22 μ M —次性濾器過濾除菌，獲得無菌勻漿上清液，再利用MEM培養基將無菌勻漿上清液進行1000倍稀釋，獲得組織濾液； 三、培養瓶中EPC細胞傳代長成緻密單層細胞後，吸棄培養液後，用Hanks液洗滌2次，接入ImL步驟二中所得組織濾液，置於15°C培養箱中吸附lh，吸棄組織液，加入5mL細胞培養維持液，15°C恆溫培養，利用倒置顯微鏡每日觀察細胞病變情況，當70% -80%的EPC細胞發生病變崩解後，吸取100 μ L細胞培養液進行病毒的RNA提取，獲得IHNV的RNA ； 四、以IHNV的RNA為模板，IHNV-Lf和IHNV-Lr為特異性引物，進行PCR擴增，獲得擴增產物； 五、PCR擴增產物經凝膠成像系統觀察，若在825bp處有目的片段，則確定結果為陽性，若在825bp處沒有目的片段，則確定結果為陰性，即完成傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測； 其中步驟一中特異性引物的上遊引物IHNV-Lf的核苷酸序列:5』 -CATAGAAATAAAACAAGAGAGACTC-3』，下遊引物 IHNV-Lr 的核苷酸序列:5』 -CCTCGTATTGTGTTTCGGAAATCT-3』: 步驟三中細胞維持液為含有2% FBS的MEM培養基。
2.根據權利要求1所述的傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法，其特徵在於步驟四中PCR擴增的反應體系為25 μ L的反應體系，由下列成分組成:
全文摘要
傳染性造血器官壞死病病毒的高效PCR檢測方法，它涉及傳染性造血器官壞死病病毒的檢測方法。它要解決現有的檢查傳染性造血器官壞死病毒的PCR方法存在敏感性不高的問題。方法一、設計特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr；二、待檢測病料處理後得組織濾液；三、製備IHNV的RNA；四、PCR擴增得擴增產物；五、PCR擴增產物觀察，確定結果即完成。本發明具有很好的特異性，不與VHSV存在交叉反應；本發明以聚合酶蛋白作為檢測目標，利用特異性引物IHNV-Lf和IHNV-Lr進行的檢測，操作簡單，準確度高、靈敏且低濃度下敏感性很好，檢測成本相對較低，與現有巢式PCR(2輪PCR)相比更節省時間。
文檔編號C12Q1/68GK103160620SQ20131012529
公開日2013年6月19日 申請日期2013年4月11日 優先權日2013年4月11日
發明者徐黎明, 盧彤巖, 劉紅柏 申請人:中國水產科學研究院黑龍江水產研究所