利用卡那黴素抗性基因啟動子表達的重組克雷伯氏菌及其應用的製作方法

2023-07-17 17:30:56

專利名稱：利用卡那黴素抗性基因啟動子表達的重組克雷伯氏菌及其應用的製作方法
技術領域：
利用卡那黴素抗性基因啟動子表達的重組克雷伯氏菌及其應用，涉及卡那
黴素抗性基因啟動子在提高克雷伯氏菌1，3-丙二醇產量中的應用，屬於基因工程
技術領域。
背景技術：
1,3-丙二醇(1,3-Propanediol, 1，3-PD)是一種重要的化工原料，作為醫藥和 有機合成的中間體用於食品、化妝品和製藥等行業，1,3-丙二醇最重要的用途就 是作為合成新型聚酯如聚對苯二甲酸-l，3-丙二醇酯(PTT)的單體，因而1,3-PD 在紡織、地毯以及工程塑料領域也具有非常廣闊的應用前景。1,3-丙二醇生產主 要採用化學方法，但因環境汙染、石油資源緊張等，使其進一步發展受到限制。 歐美國家積極開展用腸道細菌和梭狀芽孢將甘油轉化為1，3-PD的研究，Dupont 公司開發的由葡萄糖合成1，3-PD，進而合成PTT的工藝，被授予2003年美國總 統綠色化學獎。
目前，應用自然菌株發酵生產l，3-丙二醇得到了廣泛的關注，其能以甘油作 為唯一的碳源和能源發酵生產1，3-PD。自然菌株主要集中在克雷伯氏桿菌屬、 弗氏檸檬桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬。人們對克雷伯氏菌研究較早，對其代謝途 徑認識比較清楚，有研究表明，克雷伯氏菌以甘油為底物生產1,3-PD，經過以 下兩步反應，即甘油在甘油脫水酶(GDHt)的作用下生成中間產物3-羥基丙醛； 3-羥基丙醛在1,3-丙二醇氧化還原酶(PD0R)的催化下生成1，3-PD。
從目前研究的現狀看，克雷伯氏桿菌(《/AwW/a.^發酵甘油的底物轉化率、 產物濃度和生產強度都比較高，因此是一種有希望實現工業化的方法。然而相 比化學法合成1,3-PD的價格，微生物發酵法目前沒有明顯的成本優勢，其主要 的原因是發酵液中產品的濃度和發酵強度低，從而使生產成本相對較高，為取 得更大的經濟效益尚存障礙，因此，為進一步降低生產成本，開發提高1，3-PD 發酵液中產品濃度及生產強度的克雷伯氏基因工程菌成為研究的重點。如利用 分子生物學技術將甘油合成1，3-PD關鍵酶基因轉入克雷伯氏菌內，增強甘油合 成1,3-PD代謝流通量，從而提高克雷伯氏菌的生產強度；或將葡萄糖合成甘油 關鍵酶基因導入克雷伯氏菌中，擴大克雷伯氏菌的底物利用範圍，即能以廉價 的碳水化合物如葡萄糖為底物直接生產1，3-PD，以降低生產成本，提高產品的 競爭力。
然而，構建一種高效的表達系統是利用途徑工程改造克雷伯氏菌的前提和
基礎。本發明將利用分子生物學技術構建了一種新型表達載體，該載體能在克 雷伯氏菌中複製和啟動外源基因的表達。為進一步利用代謝工程手段改造克雷 伯氏菌，開發更具生產潛力的克雷伯氏基因工程菌打下堅實的基礎。

發明內容
本發明的目的是構建一種新型的表達載體為進一步對克雷伯氏菌進行改造 奠定基礎。本發明的新型表達載體能在克雷伯氏菌中複製和啟動外源基因的表 達。為進一步利用代謝工程手段改造克雷伯氏菌，開發更具生產潛力的克雷伯 氏基因工程菌打下堅實的基礎。
本發明的技術方案 一株提高l,3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類 命名為克雷伯氏桿菌(A7A^//asp.) pETPkarwZ/z"T，已保藏於中國典型培養物 保藏中心，保藏編號為CCTCCNO: M208134。
所述的重組克雷伯氏桿菌，其構建所用的表達載體pETPkan-^aT，採用卡 那黴素抗性基因啟動子屍b"。
所述的重組克雷伯氏桿菌，其擴增了來自克雷伯氏桿菌l， 3-丙二醇氧化還 原酶的基因WaT。
所述的重組克雷伯氏桿菌，達到克雷伯氏桿菌自身的1， 3-丙二醇氧化還原 酶加強表達，來提高發酵法生產l， 3-丙二醇的產量。
所述重組克雷伯氏桿菌的構建方法，將來自克雷伯氏桿菌l， 3-丙二醇氧化 還原酶的基因WaT，構建克雷伯氏桿菌表達載體pETPkan-W"T;將該表達載體 pETPkarwZ/7aT轉入克雷伯氏桿菌中，獲得了重組克雷伯氏桿菌(iC/e6wW/a sp.) pETPkan-^aT;
(1)質粒pETPkan的構建
以質粒pET28a為模板，進行PCR擴增，所用引物如下 P1: 5 ，-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3' P2: 5 ，-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3' PCR方法如下50|iL反應體系中加入1Ommol/L的引物Pl和P2各1.5^iL， 2mmol/L的dNTP 5pL， 10xExTaq Buffer 5fiL， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5|iL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50pL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54TM分鐘、72'C延伸2分鐘，循環30次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收0.5 kb的目標片段；純化好的目標片段經Bg/ II和五coR I 雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pET28a經過^w H I和￡coR I雙 酶切，用PCR片段膠回收試劑盒純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段， 連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那 黴素的LB瓊脂平板，37"C培養過夜；提取質粒，分別用Bg/II和&oRI雙酶切，
瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20%甘油的LB中，冷 凍保存於-80。C;重組質粒命名為pETPkan，陽性重組子命名為JM109/pETPkan;
(2) 質粒pETPkan-CMcds的構建
以質粒pACYCDuet為模板進行PCR擴增氯黴素編碼結構基因CMcds，所 用引物如下
P3: 5 ，-cgc gaa ttc ATG GAG AAA AAA ATC ACT GG-3' P4: 5 ，-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3'
PCR方法如下50pL反應體系中加入10mmol/L的引物P3和P4各1.5pL， 2mmol/L的dNTP 5pL， 10xExTaq Buffer 5pL， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5pL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50pL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54'C1分鐘、72'C延伸2分鐘，循環35次；
用試劑盒回收0.7 kb的目標片段；純化好的目標片段經I和///"d III 雙酶切，回收；同時提取質粒pETPkan，並用五coR I和歷"d III雙酶切，回收 純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連接產物轉化大腸桿菌JM109感 受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那黴素和25 |_ig/mL氯黴素的LB瓊 脂平板，37"C培養過夜；提取質粒，分別用五coR I和/Z/mi ni雙酶切，瓊脂糖 凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20X甘油的LB中，冷凍保存 於-80°C ; 重組質粒命名為pETPkan-CMcds ，陽性重組子命名為 JM109/pETPkan-CMcds 。
(3) 質粒pETPkan-CMcds轉化克雷伯氏菌
質粒pETPkan-CMcds用氯化鈣法轉化克雷伯氏菌感受態細胞，轉化物塗布 於含有50 )ig/mL卡那黴素和25 |ig/mL氯黴素LB瓊脂平板，37'C培養過夜； 發現有大量單菌落生成；
(4) 質粒pETPkan-^^T的構建
以克雷伯氏菌染色體DNA為模板，進行PCR擴增1， 3-丙二醇氧化還原酶 編碼基因^。T，引物序列如下
P5: 5，-ACCG0447TCATGAGCTATCGTATGTTTG-3, P6: 5，-ACC G^GC77TC AGA ATG CCT GGC G-3，
PCR方法如下50(iL反應體系中加入1Ommol/L的引物P5和P6各1.5pL， 2mmol/L的dNTP 5^L， 10xExTaq Buffer 5^L， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5pL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50(iL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54TM.5分鐘、72'C延伸2分鐘，循環35次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收1.2kb的目標片段；純化好的目標片段經&oRI和歷"din 雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pETPkan經過￡coR I和///wd III雙
酶切，用PCR片段膠回收試劑盒純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，
連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那 黴素的LB瓊脂平板，37"C培養過夜；提取質粒，分別用￡coR I和///"d III雙 酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20%甘油的LB 中，冷凍保存於-8(TC;重組質粒命名為pETPkan-^2"T，陽性重組子命名為 JM109/pETPkan-c/Z^T;
(5 )重組克雷伯氏桿菌pETPkan-WaT的構建
取一支冷凍保存的JM109/ pETPkarwZ/^T，接種於20mL含50嗎/mL卡那 黴素的LB培養基中，37'C培養過夜，提取質粒pETPkan-W"T，用氯化鈣法轉 化克雷伯氏桿菌感受態細胞，轉化物塗布於含有50 )ig/mL卡那黴素LB瓊脂平 板，37'C培養過夜；有大量單菌落生成，即為重組克雷伯氏桿菌pETPkan-^zT。
用所述重組克雷伯氏桿菌發酵生產l， 3-丙二醇的方法
出發菌株重組克雷伯氏桿菌pETPkaiw/Z^T;
培養基組成種子培養基以g/L計蛋白腖10，酵母膏5，氯化鈉10;
發酵培養基以g/L計甘油50，酵母膏5， KH2P045， (NH4)2S040.1 ，檸檬 酸4，微量元素溶液60mL，維生素B12的添加量為發酵培養基中維生素B12 終濃度15mg/L，初始pH7.0;
所述微量元素溶液每升含有0.68 g ZnCl2, 2.0 g MnCl2'4H20, 60 mg H3B03, 0.47 g CoCl2.6H20, 5 mg Na2Mo04-2H20, 17 g CuCl2-2H20, 5.4 g FeCl3.6H20, 10 ml HC1 (37%);
培養條件從新鮮的LB培養基斜面上挑取一環菌株接入裝液量為50 mL 的250 mL搖瓶中，於旋轉式搖床中37 °C、 140 r/min培養20 h得到種子液， 按照5%接種量接入裝液量為50 mL發酵培養基的250mL搖瓶中，發酵30h。
由於克雷伯氏菌對卡那黴素和氯黴素較為敏感，因此選用其作為篩選標記。 首先，利用常規的原核表達載體pET28a轉化克雷伯氏菌得到陽性轉化子，其次， PCR擴增獲得氯黴素抗性結構基因CMcds，插入pET28a多克隆位點即T7啟動 子下遊，構建了重組載體pET28a-CMcds，具備氯黴素抗性，將pET28a-CMcds 轉入克雷伯氏菌中，重組克雷伯氏菌對氯黴素仍然敏感。進一步PCR擴增獲得 卡那黴素抗性基因啟動子Pkan，構建了新型載體pETPkan,並將CMcds置於Pkan 下遊，構建了重組載體pETPkan-CMcds，重組大腸桿菌JM109/pETPkan-CMcds 不經過誘導直接具備氯黴素抗性，同時將質粒pETPkan-CMcds導入克雷伯氏菌 中，重組克雷伯氏菌具備氯黴素抗性。
載體pET28a是一種常用的原核表達載體，帶有卡那黴素抗性基因Kan、 ori 等元件，本發明選擇的宿主克雷伯氏菌，其具有氨苄抗性但對卡那黴素較為敏 感，故優先選擇pET28a作為原始出發質粒。
本發明並沒有選用載體pET28a上的T7啟動子，因為克雷伯氏菌本身不能 合成T7聚合酶，故T7啟動子在其體內不能啟動外源基因的表達，由於pET28a 轉入克雷伯氏後使其具備卡那抗性，說明該質粒能在其中複製且卡那啟動子能 成功啟動基因的表達，本發明選用了來源於表達載體pET28a上卡那黴素抗性基 因(Kan)的啟動子，該啟動子是組成型的啟動子，可以不需要誘導直接啟動目 的基因的表達。
為分析Pkan在克雷伯氏菌中的功能，且其對氯黴素較為敏感，故將氯黴素 抗性結構基因置於Pkan下遊，
帶有異源基因的游離型表達載體可以通過CaCl2法、原生質體融合法或電穿 孔法轉化宿主系統。成功轉化的細胞，即含有本發明構建的游離型表達載體的 細胞，可以通過本領域熟知的方法加以鑑定，如收集細胞，裂解後提取質粒， 然後進行酶切和PCR鑑定。
本發明選擇的宿主系統是克雷伯氏菌(A7e&zW/a.;wewmo"/M)，其能以甘油 作為唯一的碳源和能源發酵生產1,3-PD，國內外對其認識較早，研究較多。為 進一步降低生產成本，提高克雷伯氏菌的發酵強度和生產能力，開發具有競爭 力的克雷伯氏基因工程菌，因此本發明選擇克雷伯氏菌作為宿主，構建適用於 其的新型表達系統，為基因工程改造克雷伯氏菌打下基礎。
本發明的有益效果由於克雷伯氏菌對氨苄黴素具有一定的抗性，利用載 體pET28a轉化克雷伯氏菌獲得成功，保證該載體能在其中進行複製以及卡那黴 素抗性基因得到表達；由於克雷伯氏菌不能合成T7聚合酶，故原核生物中常用 T7強表達啟動子在其中不能啟動外源基因的表達，由於卡那黴素抗性基因在其 中能正常表達，說明卡那黴素抗性基因啟動子Pkan能正常轉錄，且不受誘導屬 組成型表達。通過PCR擴增獲得了Pkan，構建了新型載體pETPkan,有利於外源 基因在克雷伯氏菌中的組成型表達。
利用氯黴素抗性平板檢測本發明構建的新型載體在克雷伯氏菌中的表達情 況，即驗證Pkan在克雷伯氏菌中啟動外源基因的表達情況。構建了重組表達載 體pETPkan-CMcds，導入克雷伯氏菌中，重組克雷伯氏菌具有較高的氯黴素抗 性。
3-羥基丙醛(3-HPA)是1，3-PD合成途徑中間代謝產物，當3-HPA含量過高 時，會影響菌體的生長以及中斷1,3-PD的合成。因此，利用新型構建的表達載 體過量表達編碼PDOR基因WaT，以期降低發酵過程中3-HPA對細胞的毒性。 進一步構建了克雷伯氏基因工程菌iQ /pETPkan -WaT，發現PDOR酶活與對照 相比有顯著提高，甘油生成1，3-PD途徑中的中間代謝產物3-HPA含量明顯降低。 證明Pkan能在克雷伯氏菌中啟動外源基因的有效表達，且屬組成型表達不需 IPTG誘導，成功構建了適用於克雷伯氏菌的新型表達系統。


圖1質粒pET28a-CMcds。 圖2質粒pETPkan。 圖3質粒pETPkan-CMcds。 圖4質粒pETPkan-^zaT。
圖5重組質粒酶切驗證 Lane 1 DNA分子量標準；Lane 2載體pET28a 五coRI酶切；Lane3載體pET28a-CMcds/五coR I禾B /f/milll雙酶切；Lane4載 體pETPkanBglII和五coRI雙酶切；Lane 5載體pETPkan五coRI酶切；Lane 6載體pETPkan-CMcds/5coRI禾B ///"dill雙酶切；Lane7載體pETPkaiw/ZzaT /五coRI和///"dill雙酶切；Lane8DNA分子量標準。
圖6重組克雷伯氏菌和對照菌株發酵過程中3-HPA含量的變化 A^p/pETPkan-a^aT(A)禾口 AT./ "ewmom'ae( ▲)。
圖7重組克雷伯氏菌和對照菌株發酵過程中甘油和1,3-丙二醇含量的變化 及生長曲線 Kp/pETPkan-(i/^T甘油含量(口)和AT./wewmow'ae甘油含量(固)； K.;VpETPkaiw//wT 1,3-丙二醇含量(A)和〖pwewmo"&e 1，3-丙二醇含量(A); 《.; /pETPkan-d/zaT生長曲線(o)和A:.p"ewmom'ae生長曲線("。 生物材料樣品保藏
一株提高1，3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類命名為克雷伯氏桿菌 (《/e&/e//asp.)pETPkan-^aT，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日期 2008年9月22日，保藏編號為CCTCCNO: M208134。
具體實施例方式
實施例l:質粒pETPkan的構建
以質粒pET28a為模板，進行PCR擴增，所用引物如下 Pl: 5，-cgcagatct GTA TCT C AG TTC GGT GTA GG-3' P2: 5'-cgcgaattc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3' PCR方法如下50nL反應體系中加入10mol/L的引物P1和P2各1.5|iL， 2mmol/L的dNTP5^iL， 10xExTaq Buffer 5foL， 5U/^L的ExTaq DNA聚合酶0.5pL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50(iL; PCR條件為95X:變性5分鐘，54°C 1分鐘， 72'C延伸2分鐘，94'C變性1分鐘，循環30次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收約0.5kb的目標片段；純化好的目標片段經5g/II和&oRI 雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pET28a經過萬amH I和五coR I雙 酶切，用PCR片段膠回收試劑盒純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段， 連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那 黴素的LB瓊脂平板，37"C培養過夜；提取質粒，分別用Bg/II和￡coRI雙酶切，
瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20X甘油的LB中，冷 凍保存於-80。C;重組質粒命名為pETPkan，陽性重組子命名為JM109/pETPkan。 實施例2:質粒pETPkan-CMcds的構建
取一支冷凍保存的BL21/pET28a-CMcds，接種於20mL含50 ^g/mL卡那黴 素的LB培養基中37'C培養過夜，提取質粒pET28a-CMcds，用￡coR I和歷"d III 進行雙酶切，膠回收試劑盒回收約為0.7kb大小的目的片段，同時提取質粒 pETPkan，並用五coR I和i7/"d III雙酶切，回收純化。用丁4連接酶連接兩酶切 純化好的片段，連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有 50pg/mL卡那黴素和25 pg/mL氯黴素的LB瓊脂平板，37'C培養過夜；提取質 粒，分別用&oRI和/^'"dlII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重 組子保存在含有20%甘油的LB中，冷凍保存於-80'C;重組質粒命名為 pETPkan-CMcds，陽性重組子命名為JM109/pETPkan-CMcds。
實施例3:質粒pETPkan-CMcds轉化克雷伯氏菌
質粒pETPkan-CMcds轉化克雷伯氏菌感受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那黴素和25 pg/mL氯黴素LB瓊脂平板，37"C培養過夜；發現有大量 單菌落生成。
實施例4:質粒pETPkaiw/ZzflT的構建
以克雷伯氏菌染色體DNA為模板，進行PCR擴增，引物序列如下 P5: 5，-ACCGG^7TCATGAGCTATCGTATGTTTG-3' P6: 5，-ACC GA4GCT7TC AGAATG CCT GGC G-3，
pcr方法如下50mL反應體系中加入1Ommol/l的引物P5和P6各1.5pL， 2mmol/L的dNTP5^iL， 10xExTaq Buffer 5|iL， 5U/|iL的ExTaq DNA聚合酶0.5|xL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50pL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54"C1.5分鐘、72"C延伸2分鐘，循環35次；
通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收約1.2kb的目標片段；純化好的目標片段經五coRI和/Z/mi m雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pETPkan經過五coRI和/Z/"dm 雙酶切，用PCR片段膠回收試劑盒純化;用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段， 連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 (ig/mL卡那 黴素的LB瓊脂平板，37。C培養過夜；提取質粒，分別用I和歷mi III雙 酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20%甘油的LB 中，冷凍保存於-80。C;重組質粒命名為pETPkan-WflT，陽性重組子命名為 扁09/pETPkan-fcT o
實施例5:克雷伯氏基因工程菌Kp/pETPkan-cZ/^T的構建
取一支冷凍保存的JM109/ pETPkaiw/ZzaT，接種於20mL含50 pg/mL卡那
黴素的LB培養基中37'C培養過夜，提取質粒pETPkan-^^T，轉化克雷伯氏菌 感受態細胞，轉化物塗布於含有50pg/mL卡那黴素LB瓊脂平板，37'C培養過 夜；發現有大量單菌落生成。
實施例6:克雷伯氏基因工程菌PDOR酶活、3-HPA和1，3-PD檢測 PDOR酶活性根據25"C下NAD+還原成NADH的速率來測定。總反應體積 2mL含0.6mMNAD， 30mM (NH4)2S04， 100mM 1,3-PD， K2C03-KHC03緩衝液 (pH9.0)，加入酶液起始反應，340nm下測定三分鐘吸光值的變化。酶活單位定 義為l國際單位(1U)等於每分種還原liimol底物或生成lpmol產物的酶量。
3-羥基丙醛(3-HPA)含量採用比色法測定。3-HPA在濃酸條件下脫水生成 丙烯醛，後者與色氨酸試劑反應生成紫色物質，在560nm有最大光吸收。由於 難以獲得3-HPA純品，以丙烯醛代替作為標準品，因為lmol 3-HPA脫水生成 lmol丙烯醛。檢測系統中含lmL樣品，0.75mL色氨酸試劑及3mL37。/。的濃鹽 酸，在37"C水浴20min顯色。560nm檢測吸光值，根據丙烯醛的標準曲線計算 出發酵液中3-羥基丙醛的濃度。色氨酸試劑配製D,L-色氨酸2.04g、濃鹽酸 4.16ml以蒸餾水定容至1L。
發酵液中1，3-丙二醇及甘油的含量採用氣相色譜測定。安捷倫1490型氣相 色譜儀，2m不鏽鋼柱((p3 mm)，國產高分子微球GDX-401 (110目)為固定 相。柱溫250 °C，進樣溫度260'C，檢測溫度260 °C ，氮氣作為載氣，使 用氫火焰檢測器，進樣5pL， 1,3-丙二醇的保留時間為2.6 min，用外標法計算 發酵液中1，3-丙二醇的含量。
實施例7:用所述重組克雷伯氏桿菌發酵生產1,3-丙二醇 發酵條件如上本發明的技術方案所述。結果測得重組克雷伯氏菌的PDOR 酶活力為1.64U/mg，對照為0.85U/mg;同時檢測中間產物3-羥基丙醛(3-HPA) 的含量明顯降低；在甘油發酵生成1,3-丙二醇的過程中，對照3-HPA的最大值 為8.2 mmol/L，重組克雷伯氏菌的3-HPA的最大值為2.9 mmol/L,重組菌1,3-PD 的產量與對照相比提高16.9%，分別為33.2 g/L和28.4 g/L，且重組菌生長情 況比對照要好。
權利要求
1、一株提高1，3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類命名為克雷伯氏桿菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 208134。
2、 根據權利要求l所述的重組克雷伯氏桿菌，其特徵是構建所用的表達載 體pETPkan-WaT，採用卡那黴素抗性基因啟動子屍&"。
3、 根據權利要求l所述的重組克雷伯氏桿菌，其特徵是擴增了來自克雷伯 氏桿菌1， 3-丙二醇氧化還原酶的基因WflT。
4、 根據權利要求l所述的重組克雷伯氏桿菌，其特徵是達到克雷伯氏桿菌 自身的1， 3-丙二醇氧化還原酶加強表達，來提高發酵法生產1， 3-丙二醇的產
5、 權利要求l所述重組克雷伯氏桿菌的構建方法，其特徵是將來自克雷伯 氏桿菌1， 3-丙二醇氧化還原酶的基因d/z"T，構建克雷伯氏桿菌表達載體 pETPkarwZ/^T;將該表達載體pETPkaiw/ZzaT轉入克雷伯氏桿菌中，獲得了重組 克雷伯氏桿菌(尺/eZwW/asp.) pETPkarwf/^T;(1) 質粒pETPkan的構建以質粒pET28a為模板，進行PCR擴增，所用引物如下 Pl: 5，-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3' P2: 5，-cgcgaattc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3' PCR方法如下50pL反應體系中加入1Ommol/L的引物P1和P2各1.5jiL， 2mmol/L的dNTP 5(oL， 10xExTaq Buffer 5pL， 5U/pL的ExTaq DNA聚合酶0.5jnL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊50pL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54'C1分鐘、72t:延伸2分鐘，循環30次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收0.5 kb的目標片段；純化好的目標片段經Bg/ II和￡coR I 雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pET28a經過^mH I和五coR I雙 酶切，用PCR片段回收試劑盒純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連 接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 ng/mL卡那黴 素的LB瓊脂平板，37'C培養過夜；提取質粒，分別用5g/II和五②RI雙酶切， 瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20X甘油的LB中，冷 凍保存於-80。C;重組質粒命名為pETPkan，陽性重組子命名為JM109/pETPkan;(2) 質粒pETPkan-CMcds的構建以質粒pACYCDuet為模板進行PCR擴增氯黴素編碼結構基因CMcds，所 用引物如下 P3: 5 ， -cgc gaa ttc ATG GAG AAA AAA ATC ACT GG-3' P4: 5'-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3'PCR方法如下50joL反應體系中加入10mmol/L的引物P3和P4各1.5|iL， 2mmol/L的dNTP 5pL， 10xExTaq Buffer 5jliL， 5U/jiL的ExTaq DNA聚合酶0.5|iiL， 模板1嗎，加雙蒸水補齊5(HiL; PCR條件為95。C變性5分鐘；94。C變性l分 鍾、54'C1分鐘、72'C延伸2分鐘，循環35次；用試劑盒回收0.7 kb的目標片段；純化好的目標片段經五coR I和歷"d III 雙酶切，回收；同時提取質粒pETPkan，並用I和///"d III雙酶切，回收 純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連接產物轉化大腸桿菌JM109感 受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那黴素和25 |ig/mL氯黴素的LB瓊 脂平板，37T:培養過夜；提取質粒，分別用&oR I和/f/ml ni雙酶切，瓊脂糖 凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20X甘油的lb中，冷凍保存 於-80°C ;重組質粒命名為pETPkan-CMcds ，陽性重組子命名為 扁09/pETPkan-CMcds;(3) 質粒pETPkan-CMcds轉化克雷伯氏菌質粒pETPkan-CMcds用氯化鈣法轉化克雷伯氏菌感受態細胞，轉化物塗布 於含有50ixg/mL卡那黴素和25 |ig/mL氯黴素的LB瓊脂平板，37'C培養過夜； 發現有大量單菌落生成；(4) 質粒pETPkan-d/zaT的構建以克雷伯氏菌染色體DNA為模板，進行PCR擴增1， 3-丙二醇氧化還原酶 編碼基因d/^T，引物序列如下P5: 5 ，-ACCGG^rrCATGAGCTATCGTATGTTTG-3 ， P6: 5，-ACC GA4GC77TC AGA ATG CCT GGC G國3'PCR方法如下50jnL反應體系中加入1Ommol/L的引物P5和P6各1.5pL， 2mmol/l的dNTP 5jjL， 10xExTaq Buffer 5f^l， 5U/|iL的ExTaq dna聚合酶0.5pL， 模板lpg，加雙蒸水補齊50^iL; PCR條件為95"C變性5分鐘；94'C變性1分 鍾、54'C1.5分鐘、72。C延伸2分鐘，循環35次；通過瓊脂糖凝膠電泳分析純化反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR 片段回收試劑盒回收1.2 kb的目標片段；純化好的目標片段經五coR I和歷"d III 雙酶切，用PCR片段回收試劑盒回收；載體pETPkan經過￡coR I和///"d III雙 酶切，用PCR片段回收試劑盒純化；用T4連接酶連接兩酶切純化好的片段，連 接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化物塗布於含有50 jLig/mL卡那黴 素的LB瓊脂平板，37"C培養過夜；提取質粒，分別用五"R I和//&d III雙酶 切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，陽性重組子保存在含有20X甘油的lb中， 冷凍保存於-80。C;重組質粒命名為pETPkan-^^T，陽性重組子命名為 JM109/pETPkan-幽T;(5)重組克雷伯氏桿菌pETPkan-WaT的構建取一支冷凍保存的JM109/ pETPkaiwtt"T，接種於20mL含50 ng/mL卡那 黴素的LB培養基中，37。C培養過夜，提取質粒pETPkan-^wT，用氯化鈣法轉 化克雷伯氏桿菌感受態細胞，轉化物塗布於含有50 pg/mL卡那黴素LB瓊脂平 板，37。C培養過夜；有大量單菌落生成，即為重組克雷伯氏桿菌pETPkan-WaT。
6、用權利要求1所述重組克雷伯氏桿菌發酵生產1， 3-丙二醇的方法，其 特徵是出發菌株重組克雷伯氏桿菌pETPkarw^aT;培養基組成種子培養基以g/L計蛋白腖10，酵母膏5，氯化鈉10;發酵培養基以g/L計甘油50，酵母膏5， KH2P045， (NH4)2SO40.1 ，檸檬 酸4，微量元素溶液60mL，維生素B12的添加量為發酵培養基中維生素B12 終濃度15mg/L，初始pH7.0;所述微量元素溶液每升含有0.68 g ZnCl2, 2.0 g MnCl2'4H20， 60 mg H3B03, 0.47 g CoCl2.6H20, 5 mg Na2Mo04'2H20, 17 g CuCl2.2H20, 5.4 g FeCl3'6H20和質 量濃度37%的HC110 mL;培養條件從新鮮的LB培養基斜面上挑取一環菌株接入裝液量為50 mL 的250 mL搖瓶中，於旋轉式搖床中37。C、 140 r/min培養20h得到種子液， 按照5%接種量接入裝液量為50 mL發酵培養基的250mL搖瓶中，發酵30 h。
全文摘要
利用卡那黴素抗性基因啟動子表達的重組克雷伯氏菌及其應用，屬於基因工程技術領域。本發明提供一株提高1，3-丙二醇產量的重組克雷伯氏桿菌，其分類命名為克雷伯氏桿菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 208134。將來自克雷伯氏桿菌1，3-丙二醇氧化還原酶的基因dhaT，構建克雷伯氏桿菌表達載體pETPkan-dhaT；將該表達載體轉入克雷伯氏桿菌中，獲得了重組克雷伯氏桿菌pETPkan-dhaT；加強dhaT基因的表達，得到的重組克雷伯氏菌在以甘油為底物的發酵過程中，中間產物3-羥基丙醛積累量明顯降低，1，3-丙二醇產量比對照提高16.9％；為構建高產1，3-丙二醇或利用葡萄糖為底物產1，3-丙二醇克雷伯氏基因工程菌打下基礎。
文檔編號C12N1/21GK101381697SQ20081015513
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月23日 優先權日2008年10月23日
發明者方慧英, 楊套偉, 諸葛健, 諸葛斌, 饒志明, 正 馬 申請人:江南大學