前列腺癌的場效應分析方法和試劑盒的製作方法

2023-07-17 16:04:41 3

專利名稱：：前列腺癌的場效應分析方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉皿存在於腫瘤周圍的區域，例如夕卜科手術的邊緣的甲Sit^因的檢查。冃尿墳不田野癌化(fieldcancerization)，也稱為場安她(fieldeffect)，於1950年代首次被提出以用來解釋多發的原發倒中瘤(primaiytumor)的發生和局部復發。，基於下列觀察結果即癌症在多損傷區域中發展，且不正常組織環繞腫瘤周圍，,明腫瘤細KI中瘤前的細胞，於腫瘤附吐的正常組織區域內。評估月中瘤擴散的標準技術是外科切除原發性腫瘤後用光學顯微鏡仔細檢査夕卜禾好術的邊,其鵬織。艦已有的辦，M31標準技術把臨腿織船，並在光學顯微鏡下檢查是否存在腫瘤細胞。準確的治療分期(therapeuticstaging)倉嫩評估腫瘤局部擴散的範圍以及在M^端，如淋巴結處的鄉區域的存在。組織病理學的評tt^幫助確定存活概率的，指標。基於視覺觀察和在光學顯微鏡下對臨近組織和淋巴結區域的形態學評價的標準組織病理學方法已知具有局限性。希望有這樣的方法其倉g^更容易地在早期確定織的擴散，並且能夠更準確地指示腫瘤轉移到臨近和周圍組織的範圍。本發明提供了這樣的方法，所述方法基於檢測樣品中的甲基化標記物(markers)。在高等餓生物中，DNA僅在CpG二蹄酸中的相對於鳥嘌呤的5'胞嘧啶處甲基化。這一修飾在基因^h具有重要的調節效果，特別是當它涉及位於基因啟動子區域的富含CpG的區域(CpG島)時。正常的非甲皿CpG島的異常甲基化是不斷增殖和轉化的細胞中的常見事件，並與特定腫瘤抑制基因或其他與特定人體癌症的好轉有關的基因的轉錄失活相聯繫。當組織病理學信息不明確或者不是很有幫助的時候，或者其能增加組織滴理學信息的細時，檢測諸如,的甲基化割牛倉^^診斷和減預後信息。
發明內容本發明的一個方面是用於表徵前列腺癌的方法，所述方法基於對甲基化Marker的檢測，該甲^fcMarker是在^標準的組織學技;m査時顯示正常的組織馮理學外禾4^術纖(surgicalmargins)附近可險測的。本發明，一種方法，^M方法可用作細胞病理學的輔助手段、高feA群的和接受化，防或化學治療的高危患者的監測。本發明的另一個方面是用於表徵前列腺癌的試劑盒。F^試劑盒包括用於放大和檢測甲基itMarkere的試劑並包含利用夕卜禾樣術纖樣品的用於前列腺癌患者的說明書。在發明的另一^^方面中，患者始終以這樣的方，行治療在該方式中根據腫瘤邊緣(tumormargms)存在或不存在甲基化Markei^來治療患有侵襲性(aggressive)前列腺癌^^和性(indolent)前列JM的患者。在本發明的又一個方面中，砂1^樣術職樣品中檢測來自下列組的一個或多個基因的超甲基化APC、RASSF1A和RARP2。患者有關前列腺癌的情況基於皿檢測徵。超甲基化的檢測，於該疾病的轉移或侵襲性的不良預後的指標。所述,最連同其他指標一^^行。在本發明的另一個方面中，甲基化汰態iKi定量的實時PCR領啶。圖1是顯示具有場鵬的樣品的M與距中央核(centralcore)的距離的函數關係的圖示。對於每種marker,在特定距離展示出甲基化率(任何數量)的樣品前列腺切除術的樣品總數除，所述前列腺切除術的樣品在中間的惡性核(C,)具有甲,率，在後續的核中沒有癌症。圖2是多種場效應的圖示。標準化的甲基化百分率如下計算用相應的Co核(core)得到的甲,率除特定核得到的甲率，再乘以100。對於在例3中顯示甲基化率的樣品，其標準化的甲皿百分率作為距Q)的距離的函數被記錄，其中包括APC(前排)、RARp2(第二、第三和第四排)和RASSF1A(最後兩排)。本發明涉及一種方法，臓方法用於險測雜於原發魁中瘤外部的組織凍理學組織樣品(如腫瘤邊緣樣本)中的突變,苷,列。該情況中的突變，^Markere序列的超甲基化。Bff^MarkereJ^f應其甲基化狀態與前列I^S的狀態相關聯的基因的核酸。術語"腫瘤的"是指直接或間接涉剡中瘤，或引趟中瘤。術語"腫瘤纖"指的是位於可辨認的腫瘤的周圍的組織。砂卜禾#術切除實體腫瘤的情況中，腫瘤纖是與可辨認的腫瘤一起被切離的組織，贓裸眼下通常看棘是正常的。更具體而言，"邊緣"指的是腫瘤的雌、邊界或分界。^ii^通常iWg發性腫瘤外延約lmm至約4mm，但根據原發實體瘤的大小可以延伸得^。核酸'相應"於雜的基因當縫因的甲基化狀^W關前列鵬的信息時，M基因的甲基化狀態代表性與前列腺癌的狀態相聯繫，ff^列是該基因的編碼部分或其互補體、該基因的，性部分互補體、該基因的啟動子或調辦列或其互補體、録該基因存在的序列戱互補體、或該基因的全長序列或其互補體。這樣的核酸在本說明書中稱為Markers。Marker相應於下列基因HIN(SeqIDNo.58)、RASSF1A(SeqIDNo.69)、APC(Promoter=SeqIDNo.64，Gene=SeqroNo.65)、RARp2(SeqIDNo.62)。其Wf關注的序列包括可用作分析對照的組^M基因，如beto-肌動蛋白(S叫ID.No.60和61)和PTGS2(Promoter=Seq.ID.No.66，gene=Seq,ID.No.67)。GSTPl(Seq.ID.No.59)皿關注的基因。檢測超甲基化的試驗包蹄如MSP和限制性內切核酸酶分析難術。啟動子區域是用於檢測這樣的超甲基化分析的特別值得注意的目標。本發明包括測定受試者的組織或其他生物學樣品中的Markers的特定區域的甲基化狀態，其中，與前列腺癌相關的DNA,增和檢測。因為Marker相對應的(即，更少被轉錄)基因編碼的蛋白的水平縮^31常是由定區域如啟動子的超甲基化所致，所以希望判斷皿區域是否被超甲基化。超甲基化區域是與正常組織相比在疾病組織(或被影響以致反映,預後的組織)的樣品中被甲基化到統計學顯l^更高的區域。iJJlMarkei^在腫瘤的,樣品中檢測到的超甲基化^在原發倒巾瘤的外面產生了腫瘤或可能的腫瘤。其也可以表示侵襲性更強的癌，以及可會^k^事實上的轉移，更高的癌。因此，其標明哪些患者需要更為積極的治療，哪些患者可以保守的治療，例如採用觀察等待。基於Marker序列的特定部分的S^核苷酸弓嫩對Miii^諸如PCR等S^擴增DNA特別有用。本發明的一些引物媒針或報導試劑用於檢測Marker基因的表，制序列的甲m。這些是調節核,列的轉錄的核列，並在一些情況中調節核^m列的翻譯。因此，表繼制序列可以包括與啟動子、增強子、轉錄終止子、起始密碼子(即ATG)、內含子的剪離號、維持正確的讀碼框以許可mRNA恰當翻譯和終止密碼子有關的序列。本發明的一種方^括使包含Marker的耙細jWl與核酸結合的試劑,。0i^耙細胞組分是核酸，例如DNA^RNA。B^f^試劑可以包括探針和引物，例如PCR^MSP引物，或其鵬設置以擴增並檢測目標序列的好。例如，臓試劑可以包括化合或鍵合至其自身的報導基因節段的啟動序列(primings叫uences)，例如在Whitcombe等的美國專利6，326,145和6,270，967中描述的，稱為Scorpion試劑或Scorpion報導基因的那些啟動序列(&tbMJi引用的方式而全部引入)。儘管它們並不相同，但術語"引稱，和"啟動序列"在本說明書中可用於指啟動核,列的擴增的分子或M部分。檢測甲基化樣品的一個靈敏的方法包括^使用甲基化敏感的,聚合酶敏反應(PCR)。在艦酶消ttJ)NA後，只有當DINA^被甲靴阻止時才通過切限制性酶切位點側翼的弓嫩鄉行PCR擴增。本發明的方法還可以包括使含有核酸的樣^修飾非甲基化的胞嘧啶的試劑;艦CpG特異的驗苷酸引物擴增樣品中包飢pG的核酸；以及險測甲靴的核酸。雌的{射布是把非甲靴的胞嘧啶轉換成另一個核苷酸，從而將非甲基化的胞嘧啶與甲基化的胞嘧啶區分開來。地，所述試劑^M硫酸氫鈉，將非甲基化的胞嘧啶《,為尿嘧啶，然而，也可以艦其他的飾非甲基化的胞嘧啶而不是甲基ttJ胞嘧啶的試劑。最tt^3E硫自鈉(NaHSQj)^t布，其易於與胞嘧啶的5，6-雙,生m但與甲皿胞嘧啶的反應較差。胞嘧啶與亞硫t酸氫鹽離子鵬以形艦脫氨基作用敏感的磺化胞嘧啶反應中間體，從而產生磺化尿嘧啶。磺酸鹽(酯)基團可以在鹼性斜牛除去，結果形皿嘧啶。尿嘧啶ffiaTaq聚合酶被識別為胸腺嘧啶，因雌行PCR時，最終產品僅在初始模板中出現5-甲基胞嘧啶的位置處包含胞嘧啶。按此方式進行處理，Scorpion報導基因和試劑以及其他的檢測系統類^itk將經f,的樣本與未經飾的樣本區分開來。本發明中用於擴增樣本中包含CpG的核酸的引被f,(例如艦亞硫體鹽)後，倉,明確區分未處理的DNA、甲基化的DNA和非甲基化的DNA。在甲基化特異的PCR(MSPCR)中，用於非甲基ftoNA的引物鵬動序列ttit在3'CG對具前，從而將其與甲基化的DNA中保留的C相區別，互補微設計為反義引物。用於非甲^^JDNA的MSP引物^動序列(primingsequence)通m^ff列中包含相對很少的Cs或Gs，因為C魂TOiOC引物中缺失，而Gs在反向弓嫩中缺失(C被1ii布為U(尿嘧啶)，雜擴增產物中被擴增為T(胸腺嘧啶核鄰。本發明的弓l物是具有足夠長度和適當序列的鎌苷酸，從而1在多態性基因座(polymorphiclocus)的對於大量核酸的特異的聚合啟動。當暴露於適當的探對-或報導基因時，被擴增的序列顯示出甲皿狀態，由皿示診斷信息。的弓l物由八個或更多個能夠弓l發引物延伸產物合成的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,，其基本上與多態性基因座^S補。有助於合成的環境斜牛包括三磷酸核苷和聚合用試劑,例如DNA聚，的，，以皿當的&S和pH。所述弓1物的啟動部分或啟動序列是為具有最大擴增效率而單鏈化，不過也可以^X鏈的。如果為35(鏈，則皿引用恪延伸產物前首先被處理以分離其鏈。所述引物必須足夠長以在，聚合用誘導試劑時啟動延伸產物的合成。弓I物的精確長度取決TO如MS、緩衝劑和核苷離成等因素。寡核苷酸弓l物最tt^包含約1220個核苷酸，盡能們可以包含更多或更少的蹄酸優選按照公知的設計方針或規則。引物經設計以基本互補於將被擴增的基因組基因座的^^，並包，上所述的適當的G或C核苷酸。這意J^0M引物必須充分互補從而在允iWffl聚合用試劑的斜牛下與賂自的麟交。換言之，臓引物應當充分互補去5'和3'側翼序列(s)，以進行雜交和容iW因組基因座擴增。引物用於擴增工藝。也就是說，相對^括的反應步驟的數目來說反應(優選,式反應)產生更大的,因座。在最優的實皿式中,^M^z按指數規律產生更媳的鵬因座。^S樣的反應包括PCR鵬。通常，一個弓嫩互補於基因座的負(-)鏈，而另一個互補於正(+)鏈。核,性使引物退火然後ffiffl齢銣DNA聚合敏(Klenow)的;Ut段和核苷^a行擴增，結果得到新合成的包含+鏈和-鏈的,因座序列。賦反應的產物是不纖的核酸雙鏈體，其末端>^應於^的1#異引物的0所述引物可以艦i頓樹可適當的方法製備,例如包括自動化方法的常規的磷酸三酯和磷酸二酯法。在一個這樣的自動化的實施方式中，二乙基亞磷單體用作起始材料，並可以使用Beaucage等描述的方法合成(TetrahedronLetter^22:1859-1862，1981)。美國專利號4，458,066中描述了用於體像飾的載體上合成鎌苷酸的方法。樹可由夕卜科ii^樣品獲得的核酸樣本(以純磁非純化的形式)均可用作本發明的起始核酸，只要其包含，離想其包含具有IGS因座(例如CpG)的特定的核,列。因此，所述;^法可以使用例如，DNA^RNA，包括信ffiRNA。^DNA或RNA可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。^NA用f^fe的^f牛中，可以使用將模^it轉錄為DNA的最佳的柳減餅。另外，可以艦DNA-RNA雜交體，其中包含各一。還可以OT核酸的混^吻，或者也可以OT皿利用相同或不同的引物在本文中前述的擴增反應中生產的核酸。將被擴增的特定的核,列，即IGS因座，可能是更大分子的1分，或在開始時顯現為不連續的分子從而使特定序列構成全部核酸。包含核酸的樣本可利用各種技術提取，例如由Maniatis等描述的技7^(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.,第280頁，281頁，1982)。如m取的樣品不純，貝陀可以在擴增之前艦一定量的試劑進行處理，所述試劑f,效地打開樣品的細胞、液體、組t喊動物細鵬，並會灘暴露和/或分離核酸的鏈。用於暴露並分離鏈的該溶胞和核酸變性步驟將允wr增更容易艦行。樣品的耙核,列包含兩錯時，其用f鎖fe^前必須分離核酸的鏈。鏈分離可以作為的步驟鄉，也可以與弓嫩延伸/^的合成同時進行。這樣的鏈分離可以515iOT各種適當的，條件，包理的、化學的或酶的方法完成。一種分離核,的物理方^a括加熱核MM其變性。典型的熱變性包括在糹ij8or105匸的溫度範圍內加熱不少於io分鐘。鏈的分離也可以aai來自被稱作解螺旋酶的麟的酶或SlRecA誘導，臓敏ecA具有解螺旋酶活性，並在存在riboATP時己知倉^KDNA變性。適於iliiiM解螺旋酶分離核,的反應^f牛由KuhnHoffmann-BerIing描述(CSH-QuaiititativeBiology,43:63,1978)。在C.Radding中對艦RecA的技術進行了評敏Ann.Rev.Genetics^16:405-437，1982)。這^^術的細節現在也是M周知的。當核酸的互補微分離時，不管核m^來是單鏈還^x鏈，分離的鏈將可以用作合成其他核,的模板。該合允許引物雜交到模板的條件下進行。合繊常發生在水性緩M液中，^ilkpH働7-9，最^8。具有多餘摩爾量(對於基因核酸，通常為引物:微約108:1)的兩種寡核苷酸引tftt^被添加到包含分離的微鏈的緩衝液中。如果本發明的方法用於診斷應用，則互補鏈的量可以不知道，因此相對於互補鏈的量的引物的量不一定能準確地確定。然而，當將被擴增的序列包含在複雜的長鏈核,的混^tl中時，引物的實際添加SM常與互補鏈(模板)的M相比過量(摩爾量)。33較多的摩爾量以改善^^方法的效率。將足夠量的脫氧核糖核苷三磷酸dATP、dC!P、dGTP和dTTPWK與引物一起添加至合成混^t/，所,液加熱到大約9(rcioox:最多io5Ht,皿l到4，。在該加熱階段後，使溶漲冷卻至室溫，就於弓嫩雜交^m的。向冷卻的混合物中加入用於產生引物延伸產物的適宜試劑("聚合用試靴')，並使反1^在本領域公知的^#下發生。聚合用試劑也可以與其他試劑一同加入，只要聚合用試劑具有熱穩定性即可。該合成(或擴增)反應可以在室^M聚合用試劑不再起作用的M下進行。聚合用試劑可以是ffi可倉綑於完成弓l物延伸產物的合成的化激縣統，優選酶。用於該目的的適宜的,括，例如，E.coilDNA聚合胸、E.coUDNA聚合酶l的克列諾片段、T4DNA聚合酶、其他的可利用的DNA聚合酶、聚，突變體、反轉錄酶、和其他酶，包括熱穩定的酶(例如，經受充，高直至導致變性的aSig進行引物延伸的那些酶)。tt^試劑是Taq聚合酶。適宜的SI^通艦當的方式促進核苷酸的結合，從而形成與絲因座核^te:補的引物延伸產物。通常，合^lt在各弓嫩W3'端開始，並沿^l^被5'方向進行，；SS合成結束，以得到不同長度的好。然而，也可以艦這樣的聚合用試抓利用與，方法相同的方法，合5'端開始，並沿另一個方向進行。最tt^，擴增方法利用PCR。也可以OT替代性的擴增方法，只要使用本發明的引物、ffliiPCR擴增的甲基化和非甲基化的基因座倉嫩fflil^^f戈性手段被相iiT增即可。擴增產物使用產物特異性的探針或報導基因被tt^鑑別為甲基化或非甲基化，如授予MulHs等的美國專利4，683,195所描述的，此^iM弓照而鄉引入。用於檢測多核苷酸的探針和報導基因的領域的進展為本領域的技術人員所熟知。可選地，核酸的甲皿模式可以ilii其他技術確認，例如限制性內切酶酶解和DNA印跡分析。可用於險測5'CpG甲皿的甲皿敏感的限制性核酸內切酶的例賴撤mal、SacII、Eagl、Mspl、HpaII、BstUI和BssHlI。在本發明的另一個方面中，^頓甲靴率(methylationratio)。i!5i確定所得到的Marker的擴增的甲基化種類的數量與擴增的參考標記物或擴增的非甲^Marker區域的f[fi之間的比例可以得到甲基化率。當PCR是實時定iPCR時其m乓最多信息。比率^3i確定的或預定的臨皿(cutoffvalue)或閾值時被認為是超甲基化的，並且與沒有趣過臨界值的比率相比其指示更差的復發預後。臨im按照已知的方、法確定，其中所^^方法用於至少兩組樣品具有已知的所關注的條件的樣品(復發或侵襲性)和具有己知的正常割牛的樣品。本發明的參考標記物還可以用作內部對照。所^#考^^物,是在樣品細胞中以^M皿的基因，如Beta肌動蛋白。已確定的或預定的數值(臨界值或閾值)也可以在不使用比率的本發明的方法中被確定並使用。在這種情況下，臨界值由相對於某^值，例如正常樣品或臨床無意義的腫瘤樣品(已知不會發展為臨床相應的狀態或是非錢性的)中的甲基化的數量或程度的甲基化的數量或程度來建立。這些臨界值按照公知的方法建立，正如其，於基於甲皿率方法中的情況一樣。本發明的方法和試劑盒可包括用於多路復用(multiplexing)的步驟和試劑。也就是說，一個以上的Marker可以同HtM測定。有趣的是，GSTP1，對於腫瘤評定來說可能是最有用的Marker，卻微現不能用作用於本發明的目的的外科手術皿feiB物。也就是說，甚至在具有侵襲性或轉鵬的患者的腫瘤雌樣品中也沒有發現該+疏物。在各鄉例中提及的GSTP1弓l物和探針如下SEQIDNO,19(GSTP1蠍(SCORPION):CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCGBHQ-HEG-TGTAGCGGTCGTCGGGGTTGSEQIDNO.20(GSTP1蠍反義引物):GCCCCAATACTAAATCACGACG據發現可用於本發明的方法和試劑盒中的示例性的Marker^APC、RARp2^ASSF1A。可用於檢測這些區域的甲靴的探針在這樣的診斷或預測方法中也是有用的。用於檢測Markere的tti^分子如下^f^。Marke遂因的簡稱連同艦的檢測系統的鄉寫顯示在括號中。反向僅指引物的方向，臓引物經指定而相關於與其f^的，的另一成員的啟動序列。不必相對於基因MDNA反義。SEQDNO.30(RASSF1A蠍)GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACGSEQIDNO.31(RASSF1A蠍反義引物)GCGTTGAAGTCGGGGTTCSEQIDNO.32(RA腦蠍)CGGCGCCCGACGATACCCAAAGCGCCG-BHQ-HEG-AACGCGAGCGATTCGAGTAGSEQIDNO.33(RARB2蠍反義引物)CTTACAAAAAACCTTCCGAATACGSEQIDNO.34(APC蠍.)GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG'-CGAACCAAAACGCTCCCCASEQ13)NO.35(APC蠍反義引物)GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAGSEQIDNO.36(肌動蛋白蠍)GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACGSEQIDNO.37(肌動蛋白蠍反義引物)CGACCCGCACTCCGCAATSEQIDNO.38(fL動蛋白蠍)SEQIDNO.39(肌動蛋白蠍反義引物)AACACACAATAACAAACACAAATTCACSEQIDNO.40(肌動蛋白蠍)CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTG'TGGTTSEQIDNO.41(肌動蛋白蠍反義引物)CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACCSEQIDN0.42(肌動蛋白蠍')CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGmTTSEQIDNO.43(肌動蛋白蠍反義引物)ACATACAACAATCAATAACATAAAACCACSEQIDNO.54(HIN曙l蠍')CGGCGCCCGAACCTCGAAAGCGCCG-BHQ-HEG-GGTTTTAGCGTTTGTTAAGAGSEQl:DNO.55(HIN-1竭反義引物)AACTTCCTACT八CGACCGAC■BHQ=BlackHoleQuencher(BioSearchTechnologies,SanFransisco,CA)HEG-六乙二醇(Hexaethyleneglycol)在本發明的一個雌^"式中，J^VIarkere和方法與組織信息學齢使用。當兩者結合時，組織學的假陰性率略有下降。也就是說，當組織學與本發明的方法和Markere指出患者具W^M的預後或侵襲性的赫時，則情況如此的概率非常高。當僅有組織學未指出患者可能經歷疾病的復發、轉移或侵襲,展時，Markers的超甲基化的陽鵬果則il^a織學的結果是不M的。本發明的試劑盒可以Kg有各種構^件，只要它們都^^含至少一個引物或探針或檢測分刊例如Scorpion報導基因)即可。在一個^式中，臓試劑盒包括用於擴增和檢魏甲^fcMarker片段的試劑。可艦，^M試劑盒包括樣品製備試劑和/皿樣品中提取核酸的製品(例如，管)。在雌的試劑盒中，包括單管(one^tube)MSP所必需的試劑，例如，相應的PCR引物組、熱穩定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)和適當的1t領!H^劑，如水解探針或分子信標(molecularbeacon)。在可選的^i^試劑盒中，檢測試劑是Scorpion報導基因或試劑。還可以艦對雙敬NA特異的頓的她引物或螢光染料，如溴化乙錠。引物雌是能產生高濃度的量。試劑盒中的其他材料可包括適宜的aSZ管或瓶、隔離成分，通常為,(waxbead)，可選的包括鎂；必需的緩衝液和試劑如dNTP;對照核酸和/或ft^J用於MSP反應的另外的緩衝劑、化合物、輔因子、離子組分、蛋白質和酶、聚，等。可選地，臓試劑盒包括核酸提取試劑和材料。在本發明最雌的試劑盒中，還包娜明書，臓說明書規定測定衫卜科手術ii^樣品，行，並指出相對於腫瘤核心最適合獲得,樣品的位置。在本發明的另一賴劑盒中，臓說明書規定進行測定的外禾樣術纖樣品是組織病理學顯示正常的樣品。說明書還指出應當對甲基化陽性結^^t，別的治療，，例如積極的或延長的治療。在本發明的測定中OT的材料理想ife^f^備試劑盒。,的試劑盒可以包括載體工具，所述載體工具被分隔以密閉地容納一個或多個容器，例如小瓶、管等，#^容1^括一個將^^法中]1的隔離元件。例如，^^鄉中的一個可包含雜魏針，0針被豐祝或可以被可檢測地標記。第二容器可以包含細胞溶解緩衝液。試劑盒還可具有容納用於擴增耙核酸序列的核苷酸的容器和/或包含與^I基因分子(如酶、螢光^1"性核素豐示記)結合的報導工具，例如生物素結合蛋白(如抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)的^^器。鄉例各實施例描述了使用來自37例前列腺切除術的樣品對48個損傷的研究和分析。離皿組織樣品也由此產生，各樣品均從核心向外延伸，並按線性排列以相距大約一，分離。第一個核心活檢樣品被證實對於癌為組織學陽性。隨後的,織檢査SBII—個為l4mm，被證實為組織學陰性。測^Markers的甲基化率以說明場效應的大小和空間依賴。^jl例l(樣品採集)離,檢核心取自回顧性收集的根治性前列腺切除術組織的石蠟塊，Bffm織沬自於^￡5年內接^±手術的患者。微的核心活檢樣品(corebiopsy)取自癌損傷的中央，34個離條心由從中鵬損傷增加1mm的距離處的看起來為正常的前列腺Pf逝的組織收集。將直徑1.5111加、厚3-4mm的各活檢核心水平地再次包埋在石蠟塊中。切出切片(5xl0ji)用於甲基化分析，對各核心製備支，&E玻片並謝fM織學評價。例2:樣品製備、DNA分離和亞硫maikf,。為提I50)NA，將來自各核心塊的50n組織(5xl0n切片)在二甲苯中脫石斷10^m),隨後艦100'K乙^fe滌2次(每次5，)。乙麟滌後，將體在50-55。C的爐中培辨敞口)以蒸發倒可殘留的乙醇。脫去石蠟的組織在以500rpm搖動的加熱塊中在56。C的40nl的提取緩衝液(10mMTris^pH8.0;150mMNaCI,2mMEDTA和0.5"/。SDS)和IOnl蛋白酶K(Qiagen)中培養。次日早晨將樣品在7(TC下加熱失活10分沖，並在16000xg下旋轉5分鐘。使50nl的組織溶胞物(或500ng整體甲基似非甲基化基因組對照DNA)進行DNA的亞硫酸氫鈉修飾，使用EZDNA甲M:試劑盒(ZymoResearch)按照製造者的^t行下列培養時間和溫度的修飾。將樣品在以UOOrpm搖動的加熱塊中在70"下培養3小時。婦5^1M^緩衝液中對頻硫MMb理的DNA進行最後的洗脫。樣品在-80t:儲存。修飾的DNA用作定量甲基化特異的PCR的模板。鄉例3:甲靴特異的PCR(MSP)So)rpion探針和引物經設計以擴增所關注的基因的啟動子區域中的甲基化的CpG島。選擇甲^無關區域以用家(housekeeping)基因P-肌動蛋白的擴增。艦DNAmfoWgj^模擬Scorpion微摺疊(probefolding)和擴增子探測。Scorpion探針和引物由ScandinavianGeneSynthesisAB獲，針在5'位置^獨特的螢光染料(FAM、Cy5、Cy3和TexasRed)進行fei3。通過使用甲基化特異的引物對來自亞硫酸氫鹽轉換的細胞系DNA(MCF-7、LNCaP和HCT-116)的針基因的所關注的啟動子序列進行擴增來校準控制縫因。擴增的PCR,在,之後艦標準鵬在TOPOTA克ltM:劑盒(Invitrogeii)中克隆，並轉4fcA;^M桿菌。質御NA被分離、線性化並以2xl07拷貝/5^1的儲#度(stockdilution)在-80。C儲存。對於所有的PCR反應，購自Oiemicon的整體甲基化和非甲基化的基因組DNA(CpG-M和CpG-U)分別用作陽1W照和陰',照。鵬martCyclerII(Cephdd，SunnyvaleCA)進行螢光多重定量MSP測定，其能夠aa^ffi每種基因獨特標記的特異探針而同時檢測一個^^蟲樣品內的4個目標(使用4個螢光通道)。對兩管中的各樣品和對照DNA進行4基因(GSTP1、APC、RARB2、Beta-肌動蛋白)和2基因(RASSF1A、Beta-肌動蛋白)多^MSP。所淑CR反應混^S含500nM的用於皿因的每"^引物和探針、與快速啟新aq聚^SI(Roche)偶聯的5U抗體、1.25mM的緩衝混，(67.0mMTris，pH8.8、6.7mMMgCl2、16.6mM(NH02SO4、lOmM-巰基乙斷中的dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的每一個、以及5fil的在最終^R25jU中的亞硫,謝,的DNA^。熱循環^f牛如下趙5。Cl，，隨皿fi^5。C持續30秒和59"持續30秒的循環40次，並在72。C延伸5分鐘。為了形成^h基因的拷貝數(copy加mber)標準曲線，M31在管中等^^混^^用於旨基因的校準儲液(2xl7拷貝/5Ml)以鵬!)備校準混，。S/K中對該混^tl進行10倍連,釋(2xl62xl02)，並在J^PCR員中複製。用於4個基因中的每一個的Cts(循環閾值)被換算為各樣品中的甲基化基因的拷貝數。齡樣品的數據以甲基化率([基因的甲基化拷貝^/p-肌動蛋白的拷貝數lxl000)表示。分別形^f於4基因和2基因多路復用的標準曲線。通過用中央的惡性核心的甲基化率除各距離處的甲基化率來計#^準甲基化％。用於這些多路飾的Markeis相應於下列基因Multiplex1:GSTP1(Seq.ID.No59)，B-肌動蛋白(S叫ID,No.60/61),APC(Seq，ID，No，64/65)，RA鄧2(Seq.瓜No.62)Mutliplex2:RASSF1A(Seq.ID.No,69)，B-肌動蛋白(Seq.ID.No.60/61)Multiplex3:Hin-1(Seq.ID.No.58)，B-肌動蛋白(Seq.ID.No.60/61)用於BfM測試的引物和探針GSTP1:探針Seq.IDNo.19;引物Seq.IDNo.20頁B-肌動蛋白探針Seq.IDNo.38;引物Seq.IDNo.39APC:探針Seq.IDNo.34;引物Seq.IDNo.35KASSF1A:探針Seq.IDNo.30;引物Seq.IDNo.31Hin-h探針Seq.IDNo.54;引物Seq.IDNo.55下面的表1顯示出用5個基因中的每一個在遠端核心中觀察到的場鵬。M顯示為皿因的甲基化率。結合核心與周圍區域的精確的組織病理學以限定用於場效應的樣品，OT下述標準證鄉傷是否^"場鵬"l.癌損傷(CO)具有對於基因的陽性甲基化率。2.鄉輻射狀的核心(C1-C4)和周圍的組織不具有癌症或高等敬IN的組織學證據。表l:tableseeoriginaldocumentpage17從以上,可知，對於MarkersAPC、RAR卩2、和RASSF1A和HIN-1可以觀察到場效應。頓離惡性核心2mm，且在大多數瞎況下距離楊。、最多3mm處可以觀察到場效應。通3i^測甲皿的Marker產生的信號的強Sa常作為樣品距核心的距離的函數而改變，但不呈線性方式(圖1和2)。這可能是由於癌割牛，多個病灶所致。令人驚i她是，對TCSTP1沒有觀察到場效應。序列表tableseeoriginaldocumentpage18<400〉1ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggat.tttagggcgt462<211〉21<212〉DNA人工<220〉<223〉GSTP1蠍子反義引物2aaaatcccgcgaactcccgcc21<210〉346DNA<213〉人工GSTP1蠍子<221〉modified—base(23)..(23)-BHQ-HEG-3cccgaacgtcgaccgctttcgggcgatttcggggattttagggcgt46<210〉4《211〉21腿人工〈220〉GSTP1蠍子反義引物<400〉4aaaatcccgcgaactcccgcc21544DNA人工GSTP1蠍子modified—base<222〉(22)..(22)-BHQ-HEG-5cggcgggagttcgcgggcgccgactaaatcacgacgccgaccgc446<211〉22DNA<213〉人工<223〉GSTP1蠍子反義引物<400〉6cggtt.agttgcgcggcgatttc22<210〉741腿人工GSTP1蠍子modified—base(19)..(19)<223〉-BHQ-HEG-modified—base(25)..(25)-BHQ-HEG-7cgggagttcgcgggtcccgactaaatcacgacgccgaccgc41822DNA人工<220〉<223〉GSTP1蠍子反義引物8cggttagttgcgcggcgatttc22<210〉950DNA人工〈220〉<223〉GSTP1蠍子modified—base<222〉(27)..(27)<223〉-BHQ-HEG-9gtggttgatgtttggggtatcaaccacaat.cccacaaactcccaccaacc50<210〉1027DNA<213〉人工<223〉GSTP1蠍子反義引物<400〉10gtggtgattttggggattttagggtgt271147<212〉DNA人工<220〉GSTP1蠍子<220〉<221〉modifiedbase(24)..(24)<223〉-BHQ-HEG-<400〉11accccagtggttgatgtttggggtaatcccacaaactcccaccaacc47<210〉1227DNA人工<220〉GSTP1蠍子12gtggtgatt,ttggggattttagggtgt27<210〉1356腿<213〉人工GSTP1蠍子<220〉modified—base(28)..(28)-BHQ-HEG-13ccccacaggttggtgggagtttgtggggcccaatactaaatcacaacaccaaccac561427腿〈213>人工<223〉GSTP1蠍子反義引物<400〉14tggttagttgtgtggtgattttgggga2了1546DNA人工<220〉GSTP1蠍子modified—base(23)..(23)-BHQ-HEG-15ccccgaacgtcgaccgctcggggcgatttcggggattttagggcgt461621DNA<213〉人工<220〉〈223〉GSTP1蠍子反義引物〈400〉16aaaatcccgcgaactcccgcc211753<212〉DNA人工<223〉GSTP1蠍子modified—base(30)..(30)-BHQ-HEG-<400〉17cgcacgccgaacgtcgaccgcaaacgtgcgcgatttcggggattttagggcgt53<210〉18<211〉21<212〉DNA人工GSTP1蠍子反義引物<400〉18aaaatcccgcgaactcccgcc211947<212〉DNA<213〉人工<223〉GSTP1蠍子<220〉modified_base(27)..(27)-BHQ-HEG-19cgcacggcgaactcccgccgacgtgcgtgtagcggtcgtcggggttg472022腿人工<220〉<223〉GSTP1蠍子反義引物20gccccaatactaaatcacgacg222155DNA人工<223〉GSTP1蠍子<220〉modified—base〈222〉(35)..(35)-BHQ—HEG—<400〉21ccgacgcacaaaaaaacaccctaaaatccgtcggggttagttgtgtggtgatttt552220<212〉薩人工GSTP1蠍子反義引物22cacaacaccaaccactcttc202329〈212〉DNA人工<220〉<223〉GSTPlTaqman引物23cgtgatttagtattggggcggagcggggc292425DNA〈213〉人工<223〉GSTPlTaqman引物<400〉24atccccgaaaaacgaaccgcgcgta252526DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTPlTaqman探針25tcggaggtcgcgaggttttcgttgga262648<212〉DNA人工misc_feature<223〉GSTP1蠍子<220〉inodified_base<222〉(27)..(27)-BHQ-HEG-26cggccctaaaaccgctacgagggccggaagcgggtgtgtaagtttcgg482726<212〉DNA人工misc—featureGSTP1蠍子反義引物27acgaaatatacgcaacgaactaacgc2628<211〉44<212〉DNA<213〉人工<220〉<223〉GSTP1蠍子<221〉misc—feature<223〉GSTPI蠍子<221〉modified—base(24)..(24)-BHQ-HEG-28ccggtcgcgaggttttcgaccggccgaaaaacgaaccgcgcgta44<210〉2927<212〉DNA人工GSTP1蠍子'<220〉邁isc一featureGSTP1蠍子反義引物29gggcgggattatttttataaggttcgg27<210〉30<211〉49DNA<213〉人工<220〉RASSFIA蠍子modified—base<222〉(25)..(25)-,-HEG-30gccgcggtttcgttcggttcgcggccccgtacttcgctaactttaaacg49<210〉3118<212〉DNA人工<223〉RASSFIA蠍子反義引物<400〉31gcgttgaagtcggggttc18<210〉3247DNA〈213〉人工<220〉邁isc一featureRARB2蠍子<220〉modified—base<222〉(27)..(27)<223〉-朋Q-HEG-32cggcgcccgacgatacccaaagcgccgaacgcgagcgattcgagtag473324DNA人工RARB2蠍子<220〉misc一featureRARB2蠍子反義引物33cttacaaaaaaccttccgaatacg243444DNA<213〉人工APC蠍子modified—base(25)..(25)-BHQ-HEG-34gccggcgggttttcgacgggccggccgaaccaaaacgctcccca443525DNA<213〉人工<223〉APC蠍子反義引物<400〉35gtcggttacgtgcgtttatatttag25<210〉3644DNA<213〉人工肌動蛋白蠍子<221〉modified—base(22)..(22)-BHQ-HEG-36gcgcccaaccgcacaagggcgcgggtatat.tt,tcgaggggtacg443718DNA人工ACTIN蠍子反義引物37cgacccgcactccgcaat183852DNA人工<220〉肌動蛋白蠍子〈220〉modified—base(27)..(27)<223〉--BHQ-HEG-38ccgcgcatcaccaccccacacgcgcggggagtatataggttggggaagtttg52<210〉39<211〉27DNA人工<220〉ACTIN蠍子反義引物<400〉39aacacacaataacaaacacaaattcac274050<212〉DNA人工<223〉肌動蛋白蠍子<220〉modified_base<222〉(27)..(27)-BHQ-HEG-<400〉40cccggctaaacccaccatccagccggggggagggtagtttagttgtggt.t50<210〉4129DNA人工ACTIN蠍子反義引物<400〉41caaaacaaaaaaactaaatctacacaacc29<210〉42<211〉47<212〉DNA<213〉人工<220〉肌動蛋白蠍子modified_base(26)..(26)-BHQ-HEG-〈400>42ccgcggaacattcaactcaaccgcggggaggaggaaggtaggttttt474329<212〉DNA<213〉人工ACTIN蠍子反義引物43acatacaa.caatcaataacataaaaccac294447〈212〉DNA<213〉人工PTGS2/C0X2蠍子邁odified一base(22)..(22)-BHQ-HEG-<400〉44cacgccgccgtatctaggcgtggtttgtttcgacgtgattttttcga474521<212〉DNA〈213〉人工<220〉PTGS2/COX2反義引物45gcaaaaaatcccctctcccgc21<210〉4645DNA人工PTGS2/C0X2蠍子modified—base<222〉(22)..(22)-朋Q-HEG-<400〉46gccgcgcacaaatttccgcggcgaattggttttcggaagcgttcg454716<212〉脆人工〈223〉PTGS2/C0X2反義引物47cccgaat.tccaccgcc16<210〉48<211〉46<212〉DNA<213〉人工PTGS2/C0X2蠍子<221〉modified—base(23)..(23)-BHQ-HEG-48ggcggaacgcacaaatt.tccgccgaattggtt,ttcggaagcgttcg464916靈人工PTGS2/C0X2反義引物49cccgaattccaccgcc16<210〉5051<212〉DNA人工PTGS2/C0X2蠍子modified_base(30)..(30)-BHQ-HEG-50tgccgccgccgtatctaatggcggcagtttgtttcgacgtgattttttcga515121腿人工<223〉PTGS2/C0X2反義引物邁isc—featurePTGS2/C0X2反義引物51gcaaaaaatcccctctcccgc21<210〉5239DNA<213〉人工<220〉CDHI蠍子<220〉modified—base(19)..(19)-BHQ-HEG-52cgccgaatacgatcggcggttcgttt,tagttcggttcga3953<211〉18<212〉DNA人工CDH1蠍子反義引物<400〉53accgaaaacgccgaacga18<210〉54<211〉46DNA<213〉人工HIN-1蠍子<220〉modified—base<222〉(26)..(26)-BHQ-HEG-54cggcgcccgaacctcgaaagcgccgggttttagcgtttgttaagag46<210〉5520DNA人工HIN-1蠍子反義引物.55肌cttcctactacgaccgac20<210〉562671DNA<213〉人類〈220〉〈221〉iiiisc_feature〈223〉15L01〉gi|l87190|gb|M23892.l|HUML0X15A人序列<400〉56aagatgggtctctaccgcatccgcgtgtccactggggcctcgctctatgcaaccaggtgcagctgtggctggtcggccagcacggggaggcggcgctcggtggcccgcacggggcaaggagacagaactcaaggtggaagt,accggagtactgctgtttgtgaaactgcgcaaacggcacctccttaaggacgacgcctgtggatctctgtgcagggccccggagccggggacgaggtcaggttcccttggtggagggcaacggcgtcctgagcctgcctgaaggcaccggccgcactgtcctcagggcctgttccagaaacaccgggaagaagagctggaagagagaagcggtggggaaactggaaggacgggttaattct.gaatatggctggggccaactccctgtggatgagcgatttctggaagacaagagagttgacttt.gaggtaaggggctggccgacctcgctatcaaagactctctaaatgttctgacttgctagatgacttcaaccgga/ttttctggtgtggtcagagcaagctggctgagactcctggaaggaagatgccttatttgggtaccagtttcttaatggcgcgtgctgaggcgctctgctcacct,tcctgctcgcctagtgttccctccaggctgcaggcccagctggagaaggagctggagggaggcacactgttcgaagcctgctggatgggatcaaggccaacgtcattctctgtagccagcagcacctcta.gtcatgctgaaattgcagcctgatgggaaactcttgcccatggtca.t15-脂氧合酶mRNA，全部編碼cggttccaac60gaagcgactg120tctggggccg180gttctgcaac240ttaccgctgg300gggcgaggac360gaagttgtac420actatatgac480ttcgctggcc540ctggaaggat600gcgcgtgcgg660caaccccgtg720cat.ggaggaa780tgacttctcc840ggctgcccct900ccagctccag960ctgccccgcacaggatccccaccacctccccttttcttgcctacggatcccccaatggcc1020tggcttctggccaaatgctgggtgcgcagctctgacttccagctccatgagctgcagtct1080catcttctgaggggacacttgatggctgaggtcattgttgtggccaccatgaggtgcctg1140ccgtcgatacatcctatcttcaagcttataattccccacctgcgatacaccctggaaatt1200aacgtccgggccaggactgggctggtctctgacatgggaattttcgaccagataatgagc1260actggtgggggaggccacgtgcagctgctcaagcaagctggagccttcctaacctacagc1320tccttctgtccccctgatgacttggccgaccgggggctcctgggagtgaagtcttccttc1380tatgcccaagatgcgctgcggctctgggaaatcatctatcggtatgtggaaggaatcgtg1440agtctccactataagacagacgtggctgtgaaagacgacccagagctgcagacctggtgt1500cgagagatcactgaaatcgggctgcaaggggcccaggaccgagggtttcctgtctcttta1560caggctcgggaccaggtttgccacttt.gtcaccatgtgtatctt.cacctgcaccggccaa1620cacgcctctgtgcacctgggccagctggactggtactcttgggtgcctaatgcaccctgc1680acgatgcggctgcccccgccaaccaccaaggatgcaacgctggagacagtgatggcgaca1740ctgcccaacttccaccaggcttctctccagatgtccatcacttggcagctgggcagacgc1800cagcccgttatggtggctgtgggccagcatgaggaggagtatttttcgggccct,gagcct1860aaggctgtgctgaagaagtt,cagggaggagctggctgccctggataaggaaat.tgagatc1920cggaatgcaaagctggacatgccctacgagtacctgcggcccagcgtggt,ggaaaacagt1980gtggccatctaagcgtcgccaccctttggtt.atttcagcccccatcacccaagccacaag2040ctgacccctt.cgtggttatagccctgccct,cccaagtcccaccctcttcccatgtcccac2100cctccctagaggggcaccttttcatggtctctgcacccagtgaacacattttactctaga2160ggcatcacctgggaccttactcctctttccttccttcctcctttcctatcttccttcctc2220tctctcttcctctttcttcattcagatctatatggcaaatagccacaattatataaatca2280tttcaagactagaatagggggatataatacatattactccacacct.tttatgaatcaaat2340atgatttttttgttgttgttaagacagagtctcactttgacacccaggctggagtgcagt2400ggtgccatcaccacggctcactgcagcctcagcgtcctgggctcaaatgatcctcccacc2460t,cagcctcctgagtagctgggactacaggctcatgccatcatgcccagctaatatttttt2520t.attttcgtggagacggggcctcact,atgttgcctaggctggaaataggattttgaaccc2580aaattgagtttaacaataataaaaagttgttttacgctaaagatggaaaagaactaggac2640tgaactattttaaataaaatattggcaaaag2671〈210〉57〈211〉1193〈212〉腿〈213〉人類<220〉<221〉miscfeature<223〉CDH1〉giI5096041gb|L34545.11HUMECADN人E-f丐粘蛋白基因，5,i山'順啟動子區域和<400〉57tctagaaaaattttttaaaaaattaggccgctcgagcgagagtgcagt.ggctcacgcctg60t.aatccaacacttcaggaggctga.agagggtggatcacctgaggtcaggagtt.ccagacc120agcctggccaacatggtgaaa.ccccgt.ctt.gtactaaaaatacaaaat.tagccggtgtgg180tggcacacgcctgtagtcccagctactcaataggctgagacaggagagtctcttgaaccc240ggcaggcggaggttgcagtgagccgagatcgtgccactgcactccagcctgggcaagaca300gagcgagactccgtctcaaaaaatacaaacaaaacaaacaaacaaaaaattaggctgcta360gctcagtggctcatggctcacacctgaaatcctagcactttgggaggccaaggcaggagg420atcgcttcagcccaggagttcgagaccaggctgggcaatacagggagacacagcgccccc480actgcccctgtccgccccgacttgtctctctacaaaaaggcaaaagaaaaaaaaaattag540cctggcgtggtggtgtgcacctgtactcccagctactagagaggctggggccagaggacc600gcttgagcccaggagtt'cgaggctgcagtgagctgtgatcgcaccactgcactccagctt660gggtgaaagagtgagccccatctccaaaacgaacaaacaaaaaatcccaaaaaacaaaag720aactcagccaagtgtaaaagccctttctgatcccaggtcttagtgagccaccggcggggc780tgggat,tcgaacccagtggaatcagaaccgtgcaggtcccataacccacctagaccctag840caactccaggctagagggtcaccgcgtctatgcgaggccgggtgggcgggccgtcagctc900cgccctggggaggggtccgcgctgctgattggctgtggccggcaggtgaaccctcagcca%0atcagcggtacggggggcggtgctccggggctcacctggctgcagccacgcaccccctct1020cagtggcgtcggaactgcaaagcacctgtgagcttgcggaagtcagttcagactccagcc1080cgctccagcccggcccgacccgaccgcacccggcgcctgccctcgctcggcgtccccggc1140cagccatgggcccttggagccgcagcctctcggcgctgctgctgctgctgcag1193〈210〉58<211〉2635〈212〉DNA<213〉人類〈221〉misc—feature<223〉染色體5(另一個名稱(SCGB3A1))上的Hin-l區域〈220〉misc—feature<223〉這個基因可以在染色體上的179，949，712-179，951，146位置找到所述基因的起始位置在重疊群AC122714.2.1.190024.〉染色體NCBI35:5:179949112:179951746:-l<400〉58atctgtcatacttctgcaggtgacagacgagtgaggacatttagagaaactcaggaacaa60accaggcccatccactggcgtcgaggctagtttcgaagacagaaaaacgccccacttctg120tttgcactgtggctgcctgtggcccggccggggaggcggccgggagtgaggcctgatcgt180ccctggcgcctccacctccccaggcgcagaaggcgcccacgaggacccccagtgcccgac240gttgccacggtctgggatcagaggcagggaccagggagccaggaactgcgccgcccccgc300ccctgccctggcgcgagggaagctcccctcacccgggcccagccctgcaggggggcgcgt360ggggtcagaccgcaaagcgaaggtgcgggccggggtgggcctcgcggagacaaaggccgg420gcctgcctgctctcagagggccccagcgcct,gccaagaggaagtcctcgaggcccgggca480gggaagggggcacgggcttcccagggcccgccggccgcagcaggaagttggccagggcac540ggccgtgagcggagcgggcagggctttctcaggagcgcgggcgaggccggcgctgg鄉g600gcgaggaccgggtataagaagcctcgtggccttgcccgggcagccgcaggttccccgcgc660gccccgagcccccgcgccat.gaagctcgccgccctcctggggct.ctgcgt.ggccctgtcc720tgcagctccggtgagcgccccgggctcctggcgcgcacggtggggcctgaggcctcggcg780cccgctgcgcccccgccgctgcctgcgccgatcgtggatcccaggtccttccagcctcgc840ccggcgcccagagggctccgccaccccggggccccgcgcctgcagcccgcggcctccccc900tctcagggctgtct.ccagcctcgtgccgggatggaggccgcccctggcctggggacaccc960gtctgccccccgtctggagaccggctcctcatcctgcaaggcgcagcgcgagtgtcccct1020cccttgggggcctgtcccggaccctgcacagagttcaccggtcct,tccgccaccctcagg1080ccactccggtgaccctgcagcgtctcctggcggggccgcctccccagacccgcctgt,gtc1140ccgggggctcgcacctggcaggcctcggcgcaggagggaggggcggtcggggagccgggc1200agggcgcgacggttcctgggcgcctcccgcgggggcgcgtcctggacctgccttctgggg1260accccggcgcgcaggcggtgacccctccctgttcgcttgcagctgctgctttcttagtgg1320gctcggccaagcctgtggcccagcctgtcgctgcgctggagtcggcggcggaggccgggg1380ccgggaccctggccaaccccctcggcaccctcaacccgctgaagctcctgctgagcagcc1440tgggcatccccgtgaaccacctcatagagggctcccagaagtgtgtggctgagctgggtc1500cccaggccgtgggggccgtgaaggccctgaaggccctgctggtaaagtgggca,ccccggg1560tgcccttcctgcgcgggcatcccttcccggcca.gcctcaaaactgcaccagaggtgtccc1620ggccctacgtcagggctgtttcccgtcct,gcccctccaagccctgtccctgggagaagcc1680cgggtctccgggtgggaactgggtggggcgcatccgagctgcaggggcggggaaggcgga1740gatggccccgcgcgggtgcgcgtcccccggagacgccagcggaaccgccccgctcccgct1800ccccacagagccggccgctgccgcgcccccgcct,gagttcttggtggcagggct.gggggc1860actcaagctcggcttctgctttccagggggccctgacagtgtttggctgagccgagactg1920gagcatctacacctgaggacaagacgctgcccacccgcgagggctgaaaaccccgccgcg1980gggaggaccgtccatccccttcccccggcccctctcaataaacgtggttaagagcagctc2040gagcctggtattttctcatccaaatgctgatccctgtgggggaccgagagtgccaagt,cc2100cagattttgtgaggggtgctgcgt.ga.gagagggagagagaggccgcgaga.gtctgcaggt2160ggcatagagccagcagtgcaaggtgacagagatggggccagtatcagaggtaaaccggat2220ttggaaacaaaactggcaggtctttctt,cctgttgtgctctgtaactgtttatgaagcat2280aaaaat,tatctactccttgaagactggcgagaatgcaaacgcaccaaagccatttgtt.gc2340taaaatttgaaagtttttattttt.tccctctatacttgtagatttcttcctcggaatggg2400ggaggaatgagggcttcaggaaatccgctgttgggcttgttttccctgcagtttctgctg2460gt,tt'tgtccaaataacctagtgactttgattccttctactctagcggagagaccaccttt2520tgt,caactgatctagtgttggtgggaaggtgcccagggaacccagacatcggtgtccctt2580tcaggggaagcctcccagttgacttccttgctgggatgaataactctgcct.cagg2635〈210〉59<211〉4260〈212〉DNA人類〈221〉inisc—feature<223〉〉gi|341173|gb|M24485.llHUMGSTPIG人(克隆pHGST-pi)穀胱甘肽S-轉移酶pi〈221〉inisc—feature<223〉〉gi|341173|gb|M2448(GSTP1)基因，全部編碼序列<400〉59aacaagagatcaatatctagaataaatggagatctgcaaatcaacagaaagtaggcagca60aagccaaagaaaatagccteaggcacagccactaaaaggaacgtgatcatgtcctttgca120gggacatgggtggagctggaagccgttagcctcagcaaactcacacaggaacagaaaacc180agcgagaccgcatggtctcacttataagtgggagctgaacaatgagaacacatggtcaca240tggcggcgatcaacacacactggtgcctgttgagcggggtgctggggagggagagtacca300ggaagaatagctaagggatactgggct.taatacctgggtgatgggatgatctgtacagca360aaccatcatggcgcacacacctatgtaacaaacctgcacatcctgcacatgtaccccaga420act'tcaaataaaagt.tggacggccaggcgtggtggctcacgcctgtaatcccagcacttt480gggaagccgaggcgtgcagatcacctaaggtcaggagttcgagaccagcccggccaacat540ggtgaaaccccgtctctactaaaaatacaaaaatcagccagatgtggcacgcacctataa600ttccacctactcgggaggctgaagcagaattgcttgaacccgagaggcggaggttgcagt660gagccgccgagatcgcgccactgcactccagcctgggccacagcgtgagactacgtcata720aaataaaataaaataacacaaaataaaataaaataaaataaaataaaataa3^taataaa780ataaaataaaataaaataaaataaaataaaataaagcaatttcctttcctctaagcggcc840tccacccctctcccctgccctgtgaagcgggtgtgcaagctccgggatcgcagcggtctt900agggaat.ttccccccgcgatgtcccggcgcgccagttcgctgcgcacacttcgctgcggt.960cctct.tcctgctgt'ctgtttactccctaggccccgctggggacctgggaaagagggaaag1020gcttccccggccagctgcgcggcgactccggggactccagggcgcccctct.gcggccgac1080gcccggggtgcagcggccgccggggctggggccggcgggagtccgcgggaccctccagaa.1140gagcggccggcgccgtgactcagcactggggcggagcggggcgggaccacccttataagg1200ctcggaggccgcgaggccttcgctggagtttcgccgccgcagtcttcgccaccagtgagt1260acgcgcggcccgctccccggggatggggctcagagctcccagcatggggccaacccgcag1320catcaggcccgggctcccggcagggctcctcgcccacctcgagacccgggacgggggcct1380aggggacccaggacgtccccagtgccgttagcggctttcagggggcccggagcgcctcgg1440ggagggatgggaccccgggggcggg柳ggggggcaggctgcgctcaccgcgccttggca1500tcctcccccgggctccagcaaacttttctttgttcgctgcagtgccgccctacaccgtgg1560tctatttcccagttcgaggtaggagcatgtgtctggcagggaagggaggcaggggctggg1620gctgcagcccacagcccctcgcccacccggagagatccgaacccccttatccctccgtcg1680tgtggcttttaccccgggcctccttcctgttccccgcctctcccgccatgcctgctcccc1740gccccagtgttgtgtgaaatcttcggaggaacctgtttacctgt,tccctccctgcactcc1800tgacccctccccgggttgctgcgaggcggagtcggcccggtccccacatctcgtacttct1860ccctccccgcaggccgctgcgcggccctgcgcatgctgctggcagatcagggccagagct1920ggaaggaggaggtggtgaccgtggagacgtggcaggagggctcactcaaagcctcctgcg1980taagtgaccatgcccgggcaaggggagggggtgctgggcct.tagggggctgtgactagga2040tcgggggacgcccaagctcagtgcccct.ccctgagccatgcctcccccaacagctatacg2100ggcagctccccaagttccaggacggagacctcaccctgtaccagtccaataccatcctgc2160gtcacctgggccgcaccct.tggtgagtcttgaacctccaagtccagggcaggcatgggca2220agcctctgcccccggagcccttttgttt'aaatcagctgccccgcagccctctggagtgga2280ggaaactgagacccactgaggttacgtagttccttgccctgtgccaggctgcctcccaggggcagtctctcatccttccacgcacatcctacagccccctggttggcccatccccagtgagcctgctcccctccacccaaccccagggctggtggacatggtg犯tgacggcgtggaggacaccaactatgtgagcatctgcaccagggtcttcttgtgccctcaccccccttacccctcagggtgcaggggctgggtcagctctgggcccctgcacccttattgcctgggacatcaaccaaggacagagacctccagcaactggtggttggagtagccagaggtggaggaggatttgtcttagctgaggaaaatatgcagacacagagcaggcagcgtgtgtgcgcgtgcgtgtgcgtgtgtgtcgggtgggtaaggagatagagatggtgaacccactggtttggagtctcctaaggggctgtgtctgaatgtgaggtctagaaggatcaa,tcatctggtgagagaacccagcaaggaggcagctgaagtggacaggatttggtact.attgcccaaggtcaagcctgggtgcctgcaa2340tgtcaggtgagctctgagcacctgctgtgt2400cttcccctcctcccaggctggggctcacag2460ctgtgtgttgatcaggcgcccagtcacgcg2520ctatgggaaggaccagcaggaggcagccct2580cctccgctgcaaatacatctccctcatcta2640tgggcactgggggctgaacaaagaaagggg2700aggtggcttgggctgaccccttcttgggtc2760aggggcccaggggcctgggacaagacacaa2820agccaagtaacgggtcatgggggcgagtgc2880tctgatct,cctggggtggcgagggcttcct2940gccagtttctggatggaggtgctggcactt3000acatttggggacctgggaccagttcagcag3060tgtgtgcgtgtgtgtgtgtacgcttgcatt3120gcgggcagtaggcccaggtcccgaaggcct3180caatgggggccattgagaagtctgaacagg3240cctccagagaagccagctct,aaagcttttg3300tggacaggcagaatggaatagagatgagt,t3360gcctggtt.gtggggagcaagcagaggagaa3420tctgggactctggtgtctggcctggggcagacgggggtgtctcaggggctgggagggatg3480agagtaggatgatacatggtggtgtctggcaggaggcgggcaaggatgactatgtgaagg3540cactgcccgggcaactgaagccttttgagaccctgctgtcccagaaccagggaggcaaga3600ccttcattgtgggagaccaggtgagcatctggccccatgctgttccttcctcgccaccct3660ctgcttccagatggacacaggtgtgagccatttgtttagcaaagcagagcagacctaggg3720gatgggcttaggccctctgcccccaattcctccagcctgctcccgctggctgagtcccta3780gcccccctgccctgcagatctccttcgctgactacaacctgctggacttgctgctgatcc3840atgaggtcctagcccctggctgcctggatgcgttccccctgctctcagcatatgtggggc3900gcctcagtgcccggcccaagctcaaggccttcctggcctcccctgagtacgtgaacctcc3960ccatcaatggcaacgggaaacagtgagggttggggggactctgagcgggaggcagagtt,t4020gccttcctt'tctccaggaccaataaaatttctaagagagctactatgagcactgtgtttc4080ctgggacggggcttaggggttctcagcctcgaggtcggtgggagggcagagcagaggact4140agaaaacagctcctccagcacagtcagtggcttcctggagccctcagcctggctgtgttt4200actgaacctcacaaactagaagaggaagaaaaaaaaagagagagagaaacaaagagaaat4260602011〈213>人類<220〉miscfeature〈223〉B-肌動蛋白〉giI283371embIY00474.llHSACTBPR人beta-肌動蛋白基因5'側翼區，CPG島1656至1955〈400〉60gagctctgtctcttggccagctgaatggaggcccagcggcaacacaggtcctgcctgggg60atcaggtctgctctgcaccccaccttgctgcctggagccgcccacctgacaacctctcat'120ccctgctctgtagat.ccggtcccatccccactgcccaccccacccccccagcactccacc180cagttcaa,cgttccacgaacccccagaaccagccctcatcaacaggcagcaagaagggcc240ccccgcccatcgccccacaacgccagccgggtgaactgtagcgttggcaggtcctgaggc300agctgaaagatacaaggccagggacaggacagtcccatccccaggaggcagggagtatac360aggctggggaagtttgcccttgcgtggggtggtgatggaggaggctcagcaagtcttctg420gactgtgaacctgtgtctgccactgtgtgctgggtggtggtcatctttcccaccaggctg480tggcctct.gcaaccttcaagggaggagcaggtcccattggctgagcacagcct'tgtacgt540gaact.gaacaagcagcctccttcctggccacaggttccatgtccttatatggactcatct600ttgcctatt,gcgacacacactcaatgaacacctactacgcgctgcaaagagccccgcagg660cctgaggtgcccccacctcaccactcttcctatttttgtgtaaaaatccagcttcttgtc720accacctccaaggagggggaggaggaggaaggcaggttcctctaggctgagccgaatgcc780cctctgt,ggtcccacgccactgatcgctgcatgcccaccacctgggtacacacagtctgt840gattcccggagcagaacggaccctgcccacccggtcttgtgtgctactcagtggacagac900ccaaggcaagaaagggtgacaaggacagggtcttcccaggctggctttgagttcctagca%0ccgccccgccc(:caatcctctgtggcacatggagtcttggtccccagagtcccccagcgg1020cctccagatggtctgggagggcagttcagctgtggctgcgcatagcagacatacaacgga1080cggtgggcccagacccaggctgtgtagacccagcccccccgccccgcagtgcctaggtca1140ccca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|人類前列腺素-內過氧化場合酶2(前列腺素G/H合酶和環氧化酶)(PTGS2)，邁RNA67caattgtcatacgacttgcagtgagcgtcaggagcacgtccaggaactcctcagcagcgc60ctccttcagctccacagccagacgccctcagacagcaaagcctacccccgcgccgcgccc120tgcccgccgctcggatgctcgcccgcgccctgctgctgtgcgcggtcctggcgctcagcc180atacagcaaatccttgctgttcccacccatgtcaaaa.ccgaggtgtatgtatgagtgtgg240gatt.tgaccagtataagtgcgattgtacccggacaggat.t.ctatgga.gaaaactgctcaa30069006960702070807140720072607273caccggaatttttgacaagaataaaattatttctgaaacccactccaaacacagtgcact360acatacttacccacttcaagggattttggaacgttgtgaataacattcccttccttcgaa420atgcaa,ttatgagttatgtcttgacatccagatcacatttgattgacagtccaccaactt化Oacaatgctgactatggctacaaaagctgggaagcctt'ctctaacctctcctattatacta540gagcccttcctcctgtgcctgatgattgcccgactcccttgggtgtcaaaggtaaaaagc600agcttcctgattcaaatgagattgtggaaaaattgcttctaagaagaaagttcatccctg660atccccagggctcaaacatgatgtttgcattctttgcccagcacttcacgcatcagtttt720tcaagacagatcataagcgagggccagctttcaccaacgggctgggccatggggtggact780taaatcatatttacggtgaaactctggctagacagcgtaaactgcgccttttcaaggatg840gaaaaatgaaatatcagataattgatggagagatgtatcctcccacagtcaaagatactc900aggcagagatgatctaccctcctcaagtccctgagcatctacggtttgctgtggggcagg960aggtctttggtctggtgcctggtctgatgatgtatgccacaatctggctgcgggaacaca1020acagagtatgcgatgtgcttaaacaggagcatcctgaatggggtgatgagcagttgttcc1080agacaagcaggctaatactgataggagagactattaagattgt.gattgaagattatgtgc1140aacacttgagtggctatcacttcaaactgaaatttgacccagaactacttttcaacaaac1200aattccagtaccaaaatcgtattgctgctgaatttaacaccctctatcactggcatcccc1260ttctgcctgacacctttcaaattcatgaccagaaatacaactatcaacagtttatctaca1320acaactctatattgct.ggaacatggaattacccagtttgtt.gaatcattcaccaggcaaa1380t.tgctggcagggttgctggtggt,aggaatgttccacccgcagtacagaaagtatcacagg1440cttccattgaccaga.gcaggcagatgaaataccagt.cttttaatgagtaccgcaaacgct1500ttatgctgaagccctatgaatcatttgaagaacttacaggagaaaaggaaatgtctgcag1560agttggaagcactctatggtgacatcgatgctgtggagctgtatcctgcccttctggtag1620aaaagcctcggccagatgccatctttggtgaaaccatggtagaagttggagcaccattct1680ccttgaaaggacttatgggtaatgttatatgttctcctgcctactggaagccaagcactt1740ttggtggagaagtgggttttcaaatcatcaacactgcctcaattcagtctctcatctgca1800ataacgtgaagggctgtccctttacttcattcagtgttccagatccagagctcattaaaa1860cagtcaccatcaatgcaagttcttcccgctccggactagatgatatcaatcccacagtac1920t.actaaaagaacgttcgactgaactgtagaagtctaatgatcatatttattt,atttatat1980gaaccatgtctattaatttaattatttaataatatttatattaaactccttatgttactt2040aacatctt.ctgtaacagaagtcagtactcctgttgcgga,gaaaggagtcatacttgtgaa2100gacttttatgtcactactctaaagattttgctgttgctgttaagtttggaaaacagtttt2160tattctgttttataaaccagagagaaatgagttttgacgtctttttacttgaatttcaac2220ttatattat.aagaacgaaagtaaagatgtttgaatacttaaacactatcacaagatggca2280aaatgctgaaagtt.tttacactgtcgatgtttccaatgcatcttccatgatgcattagaa2340gtaactaatgtttgaaattttaa.agtacttttggttatttt.tctgtcatcaaacaaaaac2400aggtatcagtgcattattaaatgaatatttaaattagacattaccagtaatttcat.gtct2460actttttaaaatcagcaa.tgaaacaataatttgaaatttctaaattcatagggt.agaatc2520acctgtaaaagct'tgttt,ga.tttcttaaagttatt,aaacttgtacatataccaaaaagaa.2580gctgtcttggatttaaatctgtaaaatcagatgaaattttactacaattgcttgttaaaa2640tattttataagtgatgttcctttttcaccaagagtataaacctttttagtgtgactgtta2700aaacttccttttaaatcaaaatgccaaatttattaaggtggtggagccactgcagtgtta2760tctcaaaataagaatattttgttgagatattccagaatttgtttatatggctggtaacat2820gtaaaatctatatcagcaaaagggtctacctttaaaataagcaataacaaagaagaaaac2880caaattattgttcaaatttaggtttaaacttttgaagcaaacttttttttatccttgtgc2940actgcaggcctggtactcagattttgctatgaggttaatgaagtaccaagctgtgcttga3000ataacgatatgttttctcagattttctgttgtacagtttaatttagcagtccatatcaca3060ttgcaaaagtagcaatgacctcataaaatacctcttcaaaatgcttaaattcatttcaca3120cattaattttatctcagtcttgaagccaattcagtaggtgcattggaatcaagcctggct,3180acct'gcatgctgttccttttcttttcttcttttagccattttgctaagagacacagtctt3240ctcatcacttcgtttctcctattttgttttactagttttaagatcagagttcactttctt3300tggactctgcctatattttcttacctgaacttttgcaagttttcaggtaaacctcagctc3360aggactgctatttagctcct,cttaagaagattaaaagagaaaaaaaaaggcccttttaaa3420aatagtatacacttattttaagtgaaaagcagagaattttatttata.gctaattttagct3480a/tctgtaaccaagatggat.gcaaagaggctagtgcctcagagagaactgtacggggtttg3540tgactggaaaaagttacgttcccattctaattaatgccctt,tcttatttaaaaacaaaac3600caaatgatatctaagtagt.tctcagcaataataataatgacgataatacttcttttccac3660atctcattgtcactgacatt,t,aa.tggt.actgtatattacttaattta.tt.ga.agattatta3720t,t.tatgtcttattaggacactatggtt.ataaactgtgtttaagcctacaat.cattgattt3780ttttttgttatgtcacaatcagtatattttctttggggttacctctctgaatattatgta3840aacaat,ccaaagaaatgattgtattaagatttgtgaataaatttttagaaatctgattgg3900catattgagatatttaaggttgaatgtttgtccttaggata.ggcctatgt.gctagcccac3960aaa.gaatattgtctcattagcctgaa.tgtgccataagactgaccttttaa.aatgttttga4020ggga.tctgtggatgctt.cgttaatttgttcagccacaatttattgagaaaatattctgtg4080tcaagcact.gtgggttttaatatttttaaat.caaacgctgattacagataettagtettta4140ta.taaataattgaaaaaaattttcttttgggaagagggagaaa.atgaaataaatatcatt4200aaagataactcaggagaatcttctttacaattttacgtttagaatgtttaaggttaagaa4260agaaatagtcaatatgcttgtataaaacactgttcactgttttttttaaaaaaaaaactt4320gatttgttattaacattgatctgctgaca.aaacctgggaatttgggttgtgt,at.gcgaat4380gtt.tcagtgcctcagacaaatgt.gtatttaacttatgtaaaagataagtctggaaataaa4440tgtctgtttatttttgtactattta4465<210〉68腿人類<220〉<21〉misc_feature<223〉14—3-3—Sigma〉gi|45238846|ref|NM—006142.31人類stratifin(SFN),mRNA<220〉<221〉miscfeature〈400〉68gagagacacagagtccggcattggtcccaggcagcagttagcccgccgcccgcctgtgtg60tccccagagccatggagagagccagtctgatccagaaggccaagctggcagagcaggccg120aacgctatgaggacatggcagccttcatgaaaggcgccgtggagaagggcgaggagctct180cctgcgaagagcgaaacctgctctcagtagcctataagaacgtggtgggcggccagaggg240ctgcctggagggtgctgtccagtattgagcagaaaagcaacgaggagggctcggaggaga300aggggcccgaggtgcgtgagtaccgggagaaggtggagactgagctccagggcgtgtgcg360acaccgtgctgggcctgctggacagccacctcatcaaggaggccggggacgccgagagcc420gggtcttctacctgaagatgaagggtgactactaccgctacctggccgaggtggccaccg480gt.gacgacaagaagcgcatcattgactcagcccggtcagcctaccaggaggccatggaca540tcagcaagaaggagatgccgcccaccaaccccatccgcctgggcctggccctgaactttt600ccgtcttccactacgagatcgccaacagccccgaggaggccatctctctggccaagacca660ctttcgacgaggccatggctgatctgcacaccctcagcgaggactcctacaaagacagca720ccctcatcatgcagctgctgcgagacaacctgacactgtggacggccgacaacgccgggg780aagaggggggcgaggctccccaggagccccagagctgagtgttgcccgccaccgccccgc840cctgccccctccagtcccccaccctgccgagaggactagtatggggtgggaggccccacc900cttctcccctaggcgctgt,tcttgct'ccaaagggctccgtggagagggactggcagagct960gaggccacctggggctggggatcccactcttcttgcagctgttgagcgcacctaaccact,1020ggt,catgcccccacccctgct.ctccgcacccgct.tcctcccgaccccaggaccaggctac1080ttctcccctcctcttgcctccctectgcccctgctgcctctgatcgtaggaattgaggag1140tgtcccgccttgtggctgagaactggacagtggcaggggctggagatgggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgccagtgcaagaccgagattgagggaaagcatgtctgctgggtgtgaccatgtttcctctcaataaagttcccctgtgacactcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa691968DNA〈213〉人類misc_featuregi|257776781ref|NM—007182.41人類Ras相關(RalGDS/AF-6)域家族1(RASSF1)，轉隸物變體A,邁RNA<400〉69tctcctcagctccttcccgccgcccagtctggatcctgggggaggcgctgaagtcggggc60ccgccctgtggccccgcccggcccgcgcttgct鄰cgcccaaagccagcgaagcacgggc120ccaaccgggccatgtcgggggagcctgagct.cattgagctgcgggagctggcacccgctg180ggcgcgctgggaagggccgcacccggctggagcgtgccaacgcgctgcgcatcgcgcggg240gcaccgcgtgcaaccccacacggcagctggtccctggccgtggccaccgctt.ccagcccg300cggggcccgccacgcacacgtggt.gcgacct.ctgtggcgacttcatctggggcgtcgtgc360gcaaaggcctgcagtgcgcgcattgcaagttcacctgccactaccgctgccgcgcgctcg420tctgcctggactgttgcgggccccgggacctgggctgggaacccgcggtggagcggga.ca4801200126013201336cgaacgtggacgagcctgtggagtgggagacacctgacctttctcaagctgagattgagc540agaagatcaaggagtacaatgcccagatcaacagcaacctcttcatgagcttgaacaagg600acggttcttacacaggcttcatcaaggttcagctgaagctggtgcgccctgtctctgtgc660cctccagcaagaagccaccctccttgcaggatgcccggcggggcccaggacggggcacaa720gtgtcaggcgccgcactt,ccttttacctgcccaaggatgctgtcaagcacctgcatgtgc780tgtcacgcacaagggcacgtgaagtcattgaggccctgctgcgaaagttcttggtggtgg840atgacccccgcaagtttgcactctttgagcgcgctgagcgtcacggccaagtgtacttgc900ggaagctgttggatgatgagcagcccctgcggctgcggctcctggcagggcccagtgaca960aggccctgagctttgtcctgaaggaaaatgactctggggaggtgaactgggacgccttca1020gcatgcctgaactacataacttcctacgtatcctgcagcgggaggaggaggagcacctcc1080gccagatcctgcagaagtactcctattgccgccagaagatccaagaggccctgcacgcct1140gcccccttgggtgacctcttgtacccccaggtggaaggcagacagcaggcagcgccaagt1200gcgtgccgtgtgagtgtgacagggccagtggggcctgtggaatgagtgtgcatggaggccctcctgtgctgggggaatgagcccagagaacagcgaagtagcttgctccctgtgtccacc1320tgtgggtgtagccaggtatggctctgcacccctctgccctcattactgggccttagtggg1380ccagggctgccctgagaagctgctccaggcctgcagcaggagtggtgcagacagaagtct1440cctcaatttt.tgt'ctcagaagtgaaaatct.tgga,gaccctgcaaacagaacagggtcatg1500t.ttgcaggggtgacggccctca.tctatgaggaaaggt.tttggatcttgaatgtggt.ctca1560ggatat,cctta,tcagagctaagggtgggt.gctcagaataaggcaggcattgaggaagagt1620cttggtttctctctacagtgccaactcctcacacaccctgaggtcagggagtgctggctc1680acagtacagcatgtgccttaatgcttcatatgaggaggatgtccctgggccagggtctgt1740gtgaatgtgggcactggcccaggttcataccttatttgctaatcaaagccagggtctctc1800cctcaggtgttttttatgaagtgcgtgaatgtatgtaatgtgtggtggcctcagctgaat1860gcctcctgtggggaaaggggttggggtgacagtcatcatcagggcctggggcctgagaga1920attggctcaataaagatttcaagatcctca1968權利要求1、一種用於表徵患者前列腺癌的方法，所述方法包括取得原發性前列腺腫瘤外部的組織樣品，其中，所述樣品沒有顯示出腫瘤病理學的形態特徵；在所述樣品中確定Marker的存在或數量；以及如果所述Marker的數量或存在超過了預定值，則評定所述癌為侵襲性的。2、如權利要求l臓的方法，其中，如果mMarker的數量蹄在沒有超過預定働鵬^M鑑定為溫和性的。3、如權利要求l臓的t法，其中，^Marke魂自由APC、RASSF1A、R卿2和fflN-l艦的組。4、一種用行表徵前列腺癌的分析的試劑盒，0f^試劑盒包括Marker試劑。5、如權利要求4所述的試劑盒，其中，所^Marker是用於選自由APC、RASSF1A、RARJ32和HTN-1組成的組的基因。6、如權利要求4臓的試劑盒，其中，^^試劑包括由S叫IDNo.34和35組成的組的成員。7、如權利要求6臓的試劑盒，其中PCR啟動試齊謹本上由S叫IDNo.34和35構成。8、如權利要求4臓的試劑盒，其中，ff^試布泡括由Seq.IDNo.30和31組成的組的成員。9、如權利要救臓的試劑盒，其中，PCR啟動試齊JS本上由Seq.IDNo.30抑1構成。10、如權利要求4臓的試劑盒，其中，ff^試劑包括由S叫K)No.32和33組成的組的成員。11、如權利要求10職的試劑盒，其中，PCR啟動試劑基本上由Seq.IDNo.32和33構成。12、如權利要求4臓的試劑盒，其中，0^試劑包括由8叫101\0.54和55組成的組的成員。13、如權利要求12臓的試劑盒，其中，PCR啟動試劑基本上由S叫IDNo.54和55構成。14、如權利要求4臓的試劑盒，0f^試劑盒還包括用於擴增和檢測組鵬^ii基因之存在的^C劑。15、女嫩利要求im的方法，0M方法還包括確定甲皿率辯I漸是否所述甲基化率^il臨界值。16、女trfe利要求i皿的方法，用於治療監測。17、如權利要求4臓的試劑盒，其中，^Markers基本上由用於RASSF1A和，型^iS因的Markere構成。18、女敗利要求17臓的試劑盒，其中，臓^M^ii基因是B-肌動蛋白。19、如權利要求4臓的試劑盒，其中，fft&Markei^本上由用於Hin-l和^M敬基因的Marker構成。全文摘要本發明涉及前列腺癌的場效應分析方法和試劑盒。本發明一方面提供了一種用於表徵患者前列腺癌的方法，所述方法包括取得原發性前列腺腫瘤外部的組織樣品，其中，所述樣品沒有顯示出腫瘤病理學的形態特徵；在所述樣品中確定Marker的存在或數量；以及如果所述Marker的數量或存在超過了預定值，則評定所述癌為侵襲性的。本發明另一方面提供了一種用於進行表徵前列腺癌的分析的試劑盒，所述試劑盒包括Marker試劑。文檔編號C12Q1/68GK101270388SQ20071030615公開日2008年9月24日申請日期2007年10月31日優先權日2006年10月31日發明者A·馬祖姆達,J·梅羅特拉,J·瓦戈,K·格雷,S·瓦德申請人:維裡德克斯有限責任公司