用於調控微脈管狀況的方法和試劑盒的製作方法

2023-07-17 15:43:36

專利名稱：用於調控微脈管狀況的方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及施用藥用化合物以便調控小血管狀況的領域。
背景技術：
人體和其他脊椎動物體內的循環系統包括心臟，它將血液泵送到身體中，和血管系統，它是一系列的管，向身體的所有部位輸送血液。血液通過動脈離開心臟，動脈在高壓下將血液輸送到身體的組織。血液通過靜脈從組織中返回心臟。動脈可反覆地細分成逐漸變細的管，並最終形成小動脈。小動脈通向毛細血管，毛細血管是薄壁結構，在組織內通過它發生氧氣交換。來自毛細血管的血液進入小的靜脈結構，被稱作小靜脈，這些小靜脈一再地匯合成靜脈，由它將血液送回心臟。總之，小動脈，毛細血管，和小靜脈被稱作″微脈管″。
與微脈管的其他部分不同，小動脈在它們的壁上具有平滑肌纖維。這些纖維根據需要通過收縮和擴張調節流入並且通過微脈管的血液。這樣，由小動脈控制血液在身體中的分布，並且將全身血液體積和動脈血液保持在生理學極限內。
休克是組織灌注的逐漸的、廣泛的減少，它是由於有效循環的血液體積減少所導致的，引起了毛細血管中氧氣輸送和交換的減少。如果不治療的話，休克通常是致命的。
休克可能因為多種原因而產生，因此可將休克分成若干類型。由於血液體積減少所導致的休克被稱為血量減少性休克，例如，由於出血或微脈管淤血而造成的血液體積減少。由於心臟衰竭不能適當地將血液泵送到身體中而導致的休克，被稱為心原性休克。還可以將休克劃分為血管原性休克，它是由於血液在組織中的不良分布所導致的，如由於急性血管舒張，而沒有血管內體積的同時增加，導致了組織灌注不足。血管原性休克被認為是膿毒症，過敏性反應，和神經性損傷所導致的休克。不過，無論導致休克的原因如何，如果不處理的話，休克可能導致嚴重的併發症，包括心肌衰弱，急性呼吸窘迫，腎衰竭，彌散性血管內凝血，以及死亡。
休克是通過診斷並且糾正(如果可能的話)造成休克的潛在原因進行治療的，如通過控制出血或重新起搏心臟，治療休克的影響，如吸氧，並且糾正酸鹼平衡紊亂，以及通過支持生命機能，如通過給予流體，以便保持血壓和心臟功能。用於治療休克的藥物包括變力性藥物，用於提高心臟收縮的強度，能穩定膜的皮質激素，能導致血管收縮並因此有助於保持動脈血壓的血管加壓藥，和麻醉劑，用於緩解與休克相關的疼痛和焦慮。
不過，即使採取所述治療，由於任何原因或多種原因的綜合所導致的嚴重休克，可能發展並且導致永久性併發症或死亡。因此，一直需要開發用於治療和預防休克的新的和額外的方法。
大麻素是在植物和動物體內天然產生的一類化合物。植物產生的大麻素包括Δ9-四氫大麻醇(THC)和Δ8-四氫大麻醇，大麻中的上述第一種成分是大麻中影響精神的成分。在動脈體內內源產生的大麻素被稱作內大麻素，並且包括花生四烯乙醇醯胺(anandamide)和2-花生四烯甘油(2-AG)。另外，有多種的合成大麻素類似物，包括六氫大麻醇，大麻隆，和非典型的大麻素，如CP55940，氨基烷基吲哚(WIN55212)，和二芳基吡唑。
被收作本文參考的Kunos等的美國專利號5,939,429披露了大麻素可用於治療血液動力學異常，如低血壓或高血壓。正如Kunos所披露的，施用大麻素受體激動劑，如花生四烯乙醇醯胺，能導致低血壓。相反，施用大麻素受體拮抗劑，如SR141716A，能預防花生四烯乙醇醯胺-誘導的低血壓。因此，Kunos得出的結論是，使用能選擇性地阻斷大麻素受體的藥物，可以通過預防或減弱內毒素-誘導的低血壓而具有治療價值。另外，由於大麻素受體的激動劑能降低血壓，Kunos得出的結論是，這種製劑可用於治療與過度的血管收縮相關的症狀，如高血壓，外周血管疾病，或心絞痛。
大麻素的降血壓作用業已在科技文獻中廣泛地報導過。下面的每一份科技文獻都被收作本文參考，並且披露了在給動物施用時，大麻素能導致低血壓。(1)Kunos，G.，等，Prostaglandins other LipidMediators，6171-84(2000)；(2)Lake，KD，等，Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，281(3)1030-1037(1997)；(3)Hilliard，CJ，Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics，294(1)27-32(2000)；(4)Brown，DJ，等，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，188(3)624-629(1974)；(5)Adams，MD，Journal of Pharmacologyand Experimental Therapeutics，196(3)649-656(1976)；(6)Kunos，G，等，Chemistry and Physics of Lipids，108159-168(2000)；(7)Wagner，JA，等，Journal of Molecular Medicine，76824-836(1998)；(8)Siqueira，SW，等，European Journalof Pharmacology，58351-357(1979)；和(9)Wagner，JA，等，Nature，390518-521(1997)。Adams，在上面的參考文獻(5)中披露，儘管靜脈內施用Δ9-四氫大麻醇或A8-四氫大麻醇導致了血壓降低，動脈內施用Δ9-四氫大麻醇或Δ8-四氫大麻醇導致了血壓升高，它是血管收縮的指標。據Adams報導，在靜脈內施用時，THC產生了短時間的血壓升高，這種升高只持續了大約1分鐘，並且僅隨著的是更長時間的降血壓反應。Wagner，在上面的參考文獻(8)中披露，施用大麻素THC或HU-210使被放血後的大鼠的存活時間加倍，從大約30分鐘到60分鐘。Wagner指出，導致存活改善的機制是不明確的，並且推測可能是由於心臟輸出的有利的重新分布或通過局部血管舒張改善了微血管循環。
Kunos在美國專利號5,939,429中還提出了激活大麻素受體，可能有利於在失血性休克中存活，這可能是由於由大麻素激動劑導致的低血壓抵消了在出血之後出現的過度的代償性高血壓。正是由於這種血管舒張作用，大麻素受體激動劑被認為可用於治療失血性休克和與過度的血管收縮相關的其他症狀，如高血壓，外周血管病，和某些形式的心絞痛。
有關COX-2抑制劑的血壓作用的信息是不確定的。Johnson，DL，The Annals of Pharmacotherapy，37442-446(March 2003)報導了COX-2抑制劑對血壓的影響的若干研究，並且報導了較高的血壓是COX-2抑制劑的負面作用。Johnson披露上述觀點是不確定的。短期的試驗表明，COX-2抑制劑對血壓正常患者的血壓沒有作用，儘管這些研究可能是有缺陷的，因為這些研究的對象被限制使用低鈉飲食。在另一項研究中，患者施用羅弗可喜或塞來考昔六周時間，發現羅弗可喜能升高血壓，而由塞來考昔得出的結果是不確定的。Johnson還提供了某些有限的數據，這些數據表明，在用COX-2抑制劑開始治療之後，血壓可能升高。Johnson得出的結論是，儘管提供了所述信息，目前尚不了解存在於COX-2抑制劑治療和血壓升高之間的關係。Johnson沒有披露或建議COX-2抑制劑對動脈微脈管的任何作用。
Dilger K.等，Journal of Clinical Pharmacology，42985-994(2002)評估了塞來考昔-一種特異性的COX-2抑制劑，和雙氯芬酸-非特異性COX抑制劑在青年和老年患者體內對血壓，腎功能的影響，以及血管活性前列腺素類化合物的作用。Dilger得出的結論是，他們的研究提供了如下證據使用治療劑量的塞來考昔或雙氯芬酸15天時間，很明顯與健康年輕或老年對象的血壓或腎功能的顯著改變不相關。Dilger沒有披露或建議COX抑制劑對動脈微脈管的任何作用。
Burstein，美國專利號4,847,290；6,162,829；和6,448288，和Mechoulam，美國專利號5,538,993；和5,635,530披露了四氫大麻醇和它的某些衍生物具有止痛和抗炎特性。4,847,290號專利披露了四氫大麻醇的代謝物產生了疼痛緩解作用，它等效於甲氧萘丙酸的作用，甲氧萘丙酸是具有COX-1和COX-2抑制特性的化合物。
迄今為止，除了上面所述Adams的文獻(5)披露了動脈內施用THC之外，還沒有公開報導過使用大麻素受體激動劑或COX-2抑制劑引起動脈微脈管收縮。


圖1A-C是一系列活體顯微圖像，分別表示在治療之前的小動脈，施用能導致小動脈擴張的製劑之後的小動脈，以及同時施用大麻素和COX-2抑制劑之後的小動脈。
圖2是表示與對照相比小動脈對COX-2抑制劑的血管活性反應的曲線圖。
圖3A-C是一系列曲線圖，分別表示在施用大麻素之後小動脈的血管活性反應，在施用COX-2抑制劑和大麻素之後最初100秒內的小動脈的血管活性反應，以及在施用COX-2抑制劑和大麻素之後12.5分鐘時間內的血管活性反應。
圖4是表示腸繫膜小動脈對大麻素反應的曲線圖。
圖5A和B是一對曲線圖，分別表示局部和系統施用有和沒有COX-2抑制劑的大麻素之後小動脈的血管活性反應。
圖6是在未處理過的大鼠和用大麻素和COX-2抑制劑的組合處理過的大鼠開始逐步放血之後血壓變化的曲線圖。箭頭1表示達到40mmHg的點，而箭頭2表示注射藥物或賦形劑的點。

發明內容
業已出乎意料的發現，微脈管狀況，特別是橫紋肌狀況，可以使用COX-2抑制劑和大麻素受體激動劑(CRA)的組合進行調節。這種組合在給脊椎動物施用時提供了協同增強效應，並且產生了動脈微脈管的顯著的、長時間的收縮，特別是對於橫紋肌的微脈管來說。儘管不希望受理論的約束，我們認為，COX-2抑制劑和CRA的組合在導致橫紋肌的動脈脈管系統收縮方面具有優勢作用，同時在內臟血管中具有較弱的作用。這導致了血液流避開骨骼和其他橫紋肌，使得有較大體積的血液可用於其他器官，如大腦和腹部器官等重要器官。
在一種實施方案中，本發明是用於引起脊椎動物對象動脈微脈管收縮的方法。根據該實施方案，大麻素受體激動劑，以下稱之為大麻素或CRA是與COX-2抑制劑同時以能有效導致所述對象的動脈微脈管收縮的組合劑量施用的。
在另一種實施方案中，本發明是用於對抗施用CRA在脊椎動物對象體內導致動脈微脈管擴張的傾向的方法。根據該實施方案，給對象同時施用COX-2抑制劑和CRA，其劑量能有效減弱或阻斷擴張，這種擴張在沒有COX-2抑制劑的情況下施用CRA時會發生。因此，根據本發明的該實施方案同時施用COX-2抑制劑和CRA與單獨施用CRA相比，導致血壓的降低較少。
在另一種實施方案中，本發明是用於提高脊椎動物對象血壓的方法。根據該實施方案，以能有效導致對象血壓升高的組合劑量給所述對象同時施用CRA和COX-2抑制劑。在優選實施方案中，在所述同時給藥時，所述對象發生血壓的急劇降低。
在另一種實施方案中，本發明是用於治療與低血壓相關的身體疾病的方法。根據該實施方案，給患有這種疾病的脊椎動物對象或有可能患有這些疾病的對象同時施用CRA和COX-2抑制劑，其組合劑量能有效導致所述對象的血壓降低，或防止所述對象的血壓降低。
在另一種實施方案中，本發明是用於調節微脈管狀況的試劑盒。根據該實施方案，所述試劑盒是裝有COX-2抑制劑和CRA的包裝，它們包裝在獨立的容器中，或組合在一個容器中。優選的是，所述試劑盒還包括指導給需要的患者同時施用COX-2抑制劑和CRA的說明書，以便獲得在上述方法中所提到的任何或所有目的。
本發明在它的任何或所有實施方案中，都可用於治療和實驗場合。例如，本發明可用於控制急性低血壓，如與諸如休克的疾病相關的低血壓。本發明還可用於控制與全身、脊椎或硬膜外施用麻醉劑出現的特應性反應相關的急性的低血壓。
本發明的方法可用於具有內臟和橫紋肌動脈微脈管的循環系統的任何動物。因此，本發明可用於脊椎動物，包括非哺乳的脊椎動物，如魚類，兩棲類，爬行動物和禽類。本發明可用於哺乳動物，如家養或非家養貓科，犬科，有蹄類反芻動物和非反芻動物，非-有蹄類反芻動物，嚙齒類動物，兔類動物，鰭足類動物，以及人和非人靈長類動物。另外，由於對COX-2抑制劑和對大麻素受體激動劑的種間反應是保守的，在動物研究中獲得的與對這兩種化合物中任意一種或兩種的反應相關的數據，可用於人類。
在本說明書中，術語″COX-2抑制劑″表示能抑制前列腺素H合成酶的誘導型異構型的環加氧酶(COX)活性的化學製劑。對於本說明書來說，COX-2抑制劑可以具有除了抑制環加氧酶-2以外的其他作用。例如，適合本發明的COX-2抑制劑還能抑制COX-1同工酶，或具有與環加氧酶-1或環加氧酶-2無關的其他藥理學作用。因此，例如，吲哚美辛，一種能結合COX-1和COX-2酶的化合物適合，儘管不是優選作為本發明的COX-2抑制劑。類似的，非特異性COX-1和COX-2抑制劑的其他化合物，如吡羅西康，商標FELDENETM(Pfizer，New York，NY，USA)和替諾喜康被認為適合本發明。
適合本發明的COX-2抑制劑的例子包括羅弗可喜，商標VIOXXTM(Merck Co.，Inc.Whitehouse Station，NJ，USA)；塞來考昔，商標CELEBRETTM(Pfizer)；伐地考昔，商標BEXTRATM(PharmaciaCorp.，Peapack，NJ，USA)；paracoxib，商標DYNASTATTM(PharmaciaCorp.)；艾託考昔，商標ARCOXIATM(Merck Co.，Inc.)；NS-398((N-(2-環己氧基-4-硝基苯基)甲磺胺)；以及無論是目前已知的或將來發現的其他COX-2抑制劑。
在本說明書中，術語″大麻素″和″大麻素受體激動劑″(通常被縮寫為″CRA″)是同義詞。CRA是一種化合物，它是大麻素受體的激動劑配體，大麻素CB-1或CB-2受體中的一種或兩種。優選的是，CRA與CB-1結合併且是它的激動劑。適合本發明的CRAs包括植物大麻素，如Δ9-四氫大麻醇(THC)和Δ8-四氫大麻醇，被稱為內大麻素的內源大麻素，如花生四烯乙醇醯胺(ANA)和2-花生四烯甘油(2-AG)，合成的大麻素包括典型的和非典型的大麻素，以及目前已知的和將來發現的大麻素受體配體。優選的CRA例子是甲基花生四烯乙醇醯胺。適合本發明的其他CRAs包括大麻醇，大麻二醇，和部分大麻素受體激動劑，能產生僅次於最強身體反應的化合物。
在本文中，術語「共同施用」在用於限定COX-2抑制劑和CRA時表示給對象同時施用COX-2抑制劑和CRA，或以足夠緊密的時間間隔施用，以便COX-2抑制劑和CRA的組合能提供它們的協同增強作用。因此，COX-2抑制劑和CRA可以同時施用，這種方式是優選的。這種同時施用可以通過將COX-2抑制劑和CRA組合在相同的施用裝置中，如注射器，或者用不同的施用裝置同時施用。另外，同時施用可以在施用COX-2抑制劑後緊接著施用CRA，或在施用CRA之後緊接著施用COX-2抑制劑。
具有大麻素受體激動劑活性的化合物，還可另外具有COX-2抑制劑的活性。被收作本文參考的上面所引用的Burstein和Mechoulam的專利披露了四氫大麻醇及其代謝物的止痛，抗炎和抗增殖特性。這些特性是與COX-2抑制作用一致的。因此，本文所使用的術語「同時施用」包括施用具有大麻素受體興奮和COX-2抑制特性的單一化合物。所述化合物可以包括，例如，四氫大麻醇，它的代謝物以及其他內大麻素或合成大麻素，如(6aR，10aR)-3-(1，1-二甲基庚基)-6a，7，10，10a-四氫-1-羥基-6，6-二甲基-1-6H-二苯並[b，d]吡喃-9-甲酸。
在本文中，所提到的施用CRA，COX-2抑制劑，或CRA和COX-2抑制劑的組合的作用，急性血管活性作用是作為在動脈微脈管上使用的直接效果。這與施用CRA和COX-2抑制劑中的任意一種或兩種對血壓的慢性或長期作用相反，如由於腎小球過濾或鈉儲留變化所導致的，它有可能導致血壓改變，通常在長期治療時發生。
根據本發明的方法，給需要的患者同時施用CRA和COX-2抑制劑，其組合劑量能有效導致橫紋肌動脈微脈管收縮。同時施用可以在對象發生血壓降低之前，如在麻醉之前或在受傷之後，但是在因為失去足夠的血液而導致血壓顯著降低之前施用，或者可以在血壓降低之後施用，如患有休克的患者，如出血或其他原因休克。
這兩種藥理學製劑CRA和COX-2抑制劑中每一種的用量，根據若干種因素而改變，包括患者的體形，使用是在血壓降低開始的時候提供或者是為了防止有可能出現血壓降低的患者的血壓降低，特別是使用了CRA和COX-2抑制劑的患者。
一般，施用的CRA的優選用量是這樣的，在沒有COX-2抑制劑的條件下，能在橫紋肌的微脈管中導致反應。因此，要施用的Δ8-THC的優選用量為大約8mg/kg或更高，更優選10mg/kg或更高，更優選12mg/kg。不過，根據本發明，如果需要的話可以使用更少數量的Δ8-THC，例如，如果這種較低的劑量在單獨使用或者在與COX-2抑制劑同時使用時能夠提供動脈微脈管的收縮的話。
一般，要施用的COX-2抑制劑的優選用量是在文獻中所推薦的劑量。例如，在Physicians Desk Reference，Medical EconomicsCompany，Inc.，Montvale NJ，USA(2001)中披露的塞來考昔的優選劑量為大約100-200mg，即大約1-2mg/kg。不過，根據本發明，如果需要的話可以使用更低劑量的塞來考昔，例如，如果這種較低的劑量在與CRA同時施用時能夠提供協同增強作用的話。
根據本發明，施用的CRA或COX-2抑制劑沒有最大量的限制。不過，施用的最大劑量是由在高劑量下出現不希望的藥理學作用的潛在可能限定的。
動脈微脈管的收縮可以通過任何已知方法或有待發現的方法確定。所述方法可以是直接的或間接的。例如，動脈微脈管的收縮可以通過對在完整動物中，灌注的脈管床的血液動力學作用的研究，或對分離的動脈片段的研究確定。這樣的研究不是優選的，因為它們不能最終確定血液動力學作用是由小動脈血管收縮所導致的，或者不能最終確定所獲得的結果是在完整的，完全的個體中獲得的。
因此，動脈微脈管的收縮優選是通過能在體內提供微脈管的直接的實時視覺和評估的技術確定的。一種這樣的技術是活體鏡檢法。參見被收作本文參考的Koller，A.和Johnson，PC，Methods for in vivomapping and classifying microvascular networks in skeletalmuscle，eds.Popel，AS and Johnson PC，Karger，New York(1986)。
在下面的非限定性實施例中對本發明作進一步的說明。
例1-提睪肌方法根據動物個體的體重，通過肌內注射100-150μl氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(每毫升87mg氯胺酮和13mg甲苯噻嗪)對7-8周大，體重大約為20克的雄性C57-BL小鼠進行麻醉。通過對流加熱將體溫保持在37℃。動物是躺臥的，在頸部腹面區形成中線切口，並且將皮下的組織橫向切成兩部分，以便暴露出氣管。實施氣管切開術，並且用PE50管子對動物進行直接插管，以便有利於通氣。然後縫合傷口。
將左側後肢切開，以便暴露出股骨神經血管束，分離股靜脈，並且用連接到裝有普通鹽水的注射器的PE10插管。然後將所述動物放置在專門設計的手術臺上，並且陰囊中的右側睪丸朝向手術臺上所包括的透光觀察窗口。用熱的(大約37℃)的生理鹽水(4.3mM NaHCO3，126.4mM NaCl，0.9mM KCl，0.4mM CaCl2，0.2mM MgSO4)將陰囊溼潤。從中間將陰囊切開，並且將下面的筋膜用鈍器分離，以便暴露出睪丸。將提睪肌的頂部固定在手術臺遠端，並且沿著提睪肌的縱軸切開，以便暴露出睪丸。然後向後柔和地迫使睪丸回到腹股溝，使得提睪肌被均勻地固定在發光窗口周圍。
例2-腸繫膜方法準備例1所述動物，用於按例1所述方法進行手術。動物躺臥在手術臺上，以便動物的腹部朝向觀察窗口。在用熱的生理鹽水溼潤之後，通過白線形成中線切口。將下部十二指腸部分的一圈小腸取出，並且固定在觀察窗口周圍，使固定針穿透近端腸繫膜而不通過腸的正面。
例3-活體鏡檢法所有實驗都是用工業等級的顯微鏡(Nikon MM-11)進行的，具有兩個光源，明視場(OptiQuip 75W氙)和螢光(Nikon 150W汞)。主要的照相裝置具有冷卻的電荷耦合裝置(CCD)和控制器(HamamastuC5985)。輔助照相裝置具有CCD照相機(MTI CCD72)，它與增強器(MTI GENIISYS)結合。通過視頻監視器觀察實驗，並且記錄在數字錄象機上用於脫機處理。
將在例1和2所述製備的動物放置在帶有透光窗口的手術臺上的顯微鏡的載物臺上。用熱的生理鹽水溼潤暴露的組織，N2/CO2(95％/5％)的混合物通過它起泡。讓所述組織平衡，直到觀察到正常的血流或灌注液流穩定，在此期間，以1-X對A1-A4小動脈進行掃描。然後通過局部施用0.1mM的腺苷(陽性對照)檢查小動脈的生理學狀況。血管直徑沒有表現出至少20％的增加，都不被考慮用於實驗。
在小動脈恢復到靜止直徑之後(大約10分鐘)，用試驗化學藥物對所述組織進行局部處理，或者系統性地施用所述藥物，並且以20倍的放大比例觀察小動脈的反應。局部處理是直接使用賦形劑溶液(1∶1∶18 stepantex∶乙醇∶鹽水)或藥物加賦形劑溶液。在完整動物體內的系統治療是通過股靜脈導管施用的。在整個過程中對小動脈進行視頻記錄，以便用於脫機分析。在所述過程中用1.4F(0.56mm)Millar導管壓力傳感器監測血壓，所述傳感器通過主動脈插入左心室。記錄收縮和舒張壓，以及心率。所述動物的藥物劑量方案基於文獻中的值或通過基於mg/kg的藥物滴定曲線通過實驗確定的值。
例4-數據分析對例3的視頻圖像進行脫機分析，首先將數字AVI文件轉化成數字圖像文件，然後用MetaMorph軟體(universal Imaging Co.)在DellOptiplex GX-1上進行分析。軟體的校正是使用微米載玻片進行的，並且測定是在微米/像素中確定的。最初以5秒的間隔在每個血管上每個時間點平均進行5-6次測定，進行開始的50秒鐘。然後延長間隔長度。對於180秒對照注射和隨後的大麻素注射來說，該方法保持穩定。
用GraphPad，Prism軟體進行數據分析。通過變量分析確定血管直徑改變在時間點，實驗，和條件之間的顯著性。直徑的統計學上的顯著變化或百分比變化被定義為P＜0.05，n＝5或以上。通過非線性回歸擬合時間曲線，通過它計算血管收縮或擴張率。
例5-藥物施用方案將stepantex∶乙醇∶等滲鹽水(1∶1∶18)的賦形劑溶液用於製備藥物溶液。首先將親脂性藥物溶解在stepantex∶乙醇(1∶1)中，然後與等滲鹽水合併。將親水性藥物直接溶解在stepantex∶乙醇等滲鹽水溶液中。
在施用試驗藥物(CRA，COX-2抑制劑，或組合)之前，系統性地施用由CRA和酶抑制劑或大麻素受體拮抗劑組成的探針，3分鐘之後再施用試驗藥物，系統性地施用或局部使用。這樣能夠確定組織特異性反應，以及局部作用與系統性作用之間的關係。在下面的實施例中系統性地使用的THC和NS-398的劑量為12mg/kg THC和2mg/kgNS-398。
例6-小動脈活體鏡檢法圖1A-C表示來自活體鏡檢法實驗的有關提睪肌小動脈的結構，是按照上述實施例的方法進行鏡檢的。如圖1A所示，小動脈是在施用化學製劑之前在靜止狀態下成像的。在圖1B中，在局部使用腺苷，一種能導致小動脈擴張的製劑之後，觀察到了小動脈擴張。在圖1C中，在施用大麻素THC和COX-2抑制劑NS-398之後觀察到了小動脈收縮。
例7-小動脈對COX-2抑制劑的反應在圖2中用曲線圖表示了提睪肌小動脈的反應，它是小動脈直徑的百分比變化與秒為單位的時間作圖的曲線圖。系統性使用賦形劑的提睪肌小動脈在施用之後3分鐘內基本上沒有表現出直徑的變化。當NS-398與賦形劑一起給小鼠施用時，觀察到了小動脈的最初的輕微的擴張，直徑增加了大約8％，在大約3分鐘之內恢復正常。
例8-小動脈對有和沒有COX-2抑制劑的CRA的反應研究了CRA本身以及與COX-2抑制劑的組合對提睪肌小動脈的作用，並且在圖3中以示意圖的形式示出。圖3是表示小動脈直徑的百分比改變與以秒為單位的時間作圖的三幅曲線圖。圖3C比較了在系統性施用Δ8-THC，在這些實施例中被稱為「THC」和THC與NS-398的組合之後，提睪肌小動脈直徑的變化。如圖3C所示，CRA(THC)和COX-2抑制劑(NS-398)的組合產生了提睪肌小動脈的顯著的和長時間的收縮，小動脈直徑縮小了大約45％，持續了整個實驗的750秒時間(12.5分鐘)。
圖3C的曲線的最初100秒在圖3B中是用放大曲線表示的。該曲線明確地示出了，CRA和CRA與COX-2抑制劑的組合導致了小動脈的最初的大約15％的輕微收縮。不過，在使用大約30秒之後，僅接受CRA的小鼠的提睪肌小動脈的直徑恢復到正常直徑。相反，接受CRA和COX-2抑制劑組合的提睪肌小動脈的直徑繼續降低。
為了排除對微脈管直徑的系統性影響，將THC局部使用在提睪肌小動脈上。如圖3A所示，提睪肌小動脈對局部THC的反應體現了系統使用THC的反應，如圖3B所示。
例9-腸繫膜小動脈對CRA的反應在例2所述方法之後，將THC局部使用於腸繫膜小動脈。如圖4所示，局部使用CRA，與提睪肌小動脈相比在腸繫膜小動脈中產生了不同的反應。給腸繫膜小動脈使用CRA，產生了兩階段的反應，最初的短時間的收縮持續不到5秒鐘，然後是擴張，然後在給藥大約100秒之後恢復正常。腸繫膜小動脈對使用CRA的反應與以前的科技文獻中的報導吻合。
例10-小動脈對有和沒有NS-398的花生四烯乙醇醯胺的反應圖5A是表示局部使用有和沒有NS-398的花生四烯乙醇醯胺(ANA)之後提睪肌小動脈直徑的百分比變化與時間的曲線圖。圖5B是表示系統性施用有和沒有NS-398的ANA之後提睪肌小動脈直徑的百分比變化與時間的曲線圖。參見圖5，ANA無論是局部或是系統性施用，在施用大約200秒之後都能導致提睪肌小動脈擴張。圖5還證實了同時施用NS-398和ANA能抑制由ANA導致的小動脈擴張。
例11-失血性休克按照由Collins，JA，Arch.Surg.，99484-487(1969)開發的由Wagner，JA，Nature，390518-521(1997)改進的大鼠失血性休克模型，對300-350克重的十二隻四個月大的Sprague-Dawley大鼠進行標準化的逐步放血。用異氟醚(0.7g/kg腹膜內)對大鼠進行固定，然後用尿烷(0.3g/kg靜脈內)或用300-350μl肌內注射的氯胺酮(87mg/ml)和甲苯噻嗪(13mg/ml)進行麻醉。通過對流加熱將體溫保持在37℃。
通過將後腿嵌入安裝板將大鼠保持成仰臥姿態。剔除在左側肢體上腹股溝部位的毛，並且切開，以便暴露出股骨神經血管束。用P50導管對左股靜脈和動脈進行插管，用4-0絲線固定所述導管。在頸部腹面部位形成中線切口，並且將下面的組織橫向切成兩部分，以便暴露出頸動脈。1.4F(0.56mm)Millar導管壓力傳感器插入所述動脈，用4-0絲線固定，以便監測血壓和心率。將左股靜脈用於藥物注射，而將左股動脈用於放血和取樣。
然後對所述動物進行逐步的放血，直到平均血壓穩定在40mmHg(取出大約2-2.5ml的血液)。在該血壓下保持5-10分鐘之後，給所述動物注射200μl的賦形劑(對照動物)或存在於同一種賦形劑中的二元藥物溶液，以便提供12mg/kg CRA(THC)和2mg/kg COX-2抑制劑(NS-398)的劑量。在整個研究中監測血壓和心率。當開始出現心律不齊和呼吸暫停時或者當血壓降低到低於20mmHg時確定為實驗的終點。在該點上，所述動物非常痛苦，並且通過心內注射飽和的KCl實施安樂死。
在圖6中以曲線圖的形式示出了本研究的結果，在附圖中比較了發生上述失血性休克和按照本發明通過同時施用COX-2抑制劑和CRA處理的或沒有處理過的大鼠的動脈血壓。圖6中的箭頭1表示血壓降低到40mmHg的時間點，箭頭2表示注射賦形劑或本發明的藥物組合物的時間點。
如圖6所示，沒有按照本發明進行處理，而是接受賦形劑的大鼠的血壓在開始逐漸放血之後大約40-50分鐘，血壓繼續降低到低於20mmHg。相反，在按照本發明方法處理過的大鼠的血壓在注射COX-2抑制劑和CRA的組合物時沒有降低到低於所述血壓(40mmHg)。實際上，在所述注射之後，血壓回升，並且保持高於該血壓至少6小時，此時本研究結束。
對本領域技術人員來說，對本文所披露的發明的改進，用途和使用是顯而易見的。這樣的改進被認為包括在以下的權利要求書的範圍內。
權利要求
1.一種用於引起動脈微脈管收縮的方法，包括給脊椎動物對象同時施用有效量的大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑。
2.如權利要求1的方法，其中，所述對象是哺乳動物。
3.如權利要求2的方法，其中，所述哺乳動物是人。
4.如權利要求1的方法，其中，所述COX-2抑制劑還是COX-1抑制劑。
5.如權利要求1的方法，其中，所述COX-2抑制劑還是大麻素受體激動劑。
6.如權利要求1的方法，其中，所述大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑的同時施用是通過施用具有大麻素受體激動活性和COX-2抑制活性的單一種化合物完成的。
7.如權利要求1的方法，其中，所述COX-2抑制劑選自下列一組羅弗可喜，塞來考昔，伐地考昔，paracoxib，艾託考昔，和NS-398。
8.如權利要求1的方法，其中，所述大麻素受體激動劑選自下列一組Δ9-四氫大麻醇，Δ8-四氫大麻醇，花生四烯乙醇醯胺，2-花生四烯甘油，和甲基花生四烯乙醇醯胺。
9.如權利要求1的方法，其中，所述大麻素受體激動劑是合成的大麻素受體激動劑。
10.如權利要求1的方法，其中，所述大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑的施用是系統性的。
11.如權利要求1的方法，其中，所述微脈管是橫紋肌微脈管。
12.一種用於提高對象血壓的方法，包括同時施用有效量的大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑，以便增加所述對象的血壓。
13.如權利要求12的方法，其中，所述對象是哺乳動物。
14.如權利要求13的方法，其中，所述哺乳動物是人。
15.如權利要求12的方法，其中，在同時施用時，所述對象患有急性血壓降低。
16.如權利要求12的方法，其中，所述同時施用是通過施用具有大麻素受體激動劑活性和COX-2抑制劑活性的化合物進行的。
17.一種用於治療患有或可能發生休克的對象的方法，包括給需要施用的脊椎動物對象同時施用大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑。
18.如權利要求17的方法，其中，所述COX-2抑制劑還是COX-1抑制劑。
19.如權利要求17的方法，其中，所述同時施用是通過施用具有大麻素受體激動劑活性和COX-2抑制劑活性的化合物進行的。
20.如權利要求17的方法，其中，所述COX-2抑制劑選自下列一組羅弗可喜，塞來考昔，伐地考昔，paracoxib，艾託考昔，和NS-398。
21.如權利要求17的方法，其中，所述大麻素受體激動劑選自下列一組A9-四氫大麻醇，A8-四氫大麻醇，花生四烯乙醇醯胺，2-花生四烯甘油，和甲基花生四烯乙醇醯胺。
22.如權利要求17的方法，其中，所述大麻素受體激動劑是合成的大麻素受體激動劑。
23.如權利要求17的方法，其中，所述大麻素受體激動劑和COX-2抑制劑的施用是系統性的。
24.如權利要求17的方法，其中，所述對象是哺乳動物。
25.如權利要求24的方法，其中，所述哺乳動物是人。
26.如權利要求26的方法，其中，所述休克是失血性休克。
27.如權利要求17的方法，其中，所述共同施用是為了控制與麻醉劑相關的低血壓。
28.一種用於對抗施用大麻素受體激動劑在對象體內導致動脈肌肉系統擴張的傾向的方法，包括給所述對象同時施用COX-2抑制劑和大麻素受體激動劑。
29.如權利要求28的方法，其中，所述對象是哺乳動物。
30.如權利要求29的方法，其中，所述哺乳動物是人。
全文摘要
用於調控動脈微脈管狀況的方法和試劑盒，其中，COX－2抑制劑和大麻素受體激動劑是同時給對象施用的。
文檔編號A61K31/415GK1787816SQ200480012834
公開日2006年6月14日 申請日期2004年4月12日 優先權日2003年5月12日
發明者B·M·莫利二世 申請人:田納西大學研究基金會