檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的dna晶片的製作方法
2023-08-12 21:55:21 6
專利名稱：檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的dna晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片。
結核桿菌引起的結核病是以呼吸道傳播為主的慢性傳染病，曾是危及人類生命的「第一殺手」。1882年科赫(德國)發現了致病的病源菌----結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，結核菌屬於分枝桿菌屬，分為人型、牛型、鳥型、鼠型等，對人類有致病能力的有人型和牛型，其中人型結核菌為人類結核病的主要病原菌(佔95％以上)，牛型結核菌次之，其它類型結核菌人類罕被感染。
結核菌為長約1～4μm、寬約0.3～0.6μm、稍彎曲的細長桿菌，兩端鈍圓。抗酸染色呈紅色，最適生長溫度為37℃，在氧氣豐富的環境生長良好。結核菌對外環境的抵抗力較強，100℃15分鐘或直接陽光下2～3小時才能將其殺死。
110多年來，隨著社會的文明進步，抗結核病藥物的開發、預防疫苗的研製和應用，在全世界範圍內結核病的發病率和死亡率均有明顯下降。
但進入80年代中期，一度被人們已控制流行的結核病，近十年來發病率呈大幅上升的趨勢。在全球範圍內，結核病又呈肆虐人類之勢，其中受害最重的仍為經濟滯後的發展中國家。世界衛生組織宣布全球已處於結核病緊急狀態！結核病捲土重來，勢頭兇猛。每年死於結核病的人數已達到人類沒發現鏈黴素等化學治療藥物前的水平。
據估計全球已有17億人感染結核桿菌，約有2000萬結核患者，每年新增病例800萬，死亡達300萬，為傳染病死亡人數第一位。結核病又將可能成為「十癆九死」或「不治之症」。由於吸菸低齡化及女性化、環境汙染加劇，免疫力下降，使年輕女性及老年結核患者死亡率上升。
結核病死灰復燃，全球呈大回升流行之勢，究其原因有一是結核桿菌的耐藥性。由於鏈黴素、異煙肼、乙胺丁醇、利福平等12種國際通用抗結核藥物長期使用，結核病療程長的因素，自然界和患者體內已產生了對化學藥物具抗性的結核菌株，特別是多重耐藥結核病流行，增大了治療難度。二是結核病和愛滋病的雙重感染。在全球範圍內，結核病是目前HTV患者的頭號殺手。幾乎三分之一的HTV患者的死亡是由結核病造成的。三是由於結核桿菌傳染途徑和傳染力極強，整個世界範圍內的人口流動，使結核傳染源得到傳播。另外，早期發現感染致病有一定的難度，致使漏診、誤診等。
許多研究資料證明，現今使用的卡介苗既不能預防原發性結核桿菌的感染，又不能預防大量傳染性的肺結核發病，故不能明顯地降低社區中的結核病傳播。因此，不能寄希望於現行使用的卡介苗作控制結核病的主導措施，而只能作為一種輔助手段。國際經驗表明，預防控制結核病，最有效的辦法是對那些作為主要傳染源的向外界排菌的肺結核病人實施有監督的化學治療。
預防結核病的根本措施在於早期發現和早期治療，這樣既可以迅速消滅結核病的傳染源，也有利於切斷傳染途徑，沒有治療過的結核病人是最危險的傳染原，而結核病患者一經接受藥物治療，其傳染性可迅速降低。就目前的化學療法水平來說，即便是大量排菌的初髮結核病患者，經過合理化療三個月內可以使大約50％的病人痰菌陰轉，經過六個月的治療，痰菌陰轉率可達90％以上，這就使結核病的傳染危險大為降低。因此，搜尋、發現和及時治療新發生的結核病人，是預防結核病的頭等重要的工作。
實踐證明，結核桿菌的抗藥性分型的所需時間非常長，因為結核桿菌生長非常緩慢，檢測及抗藥性分析一般需6～8周。本發明所說的抗藥性分型是指引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域；引起利福平抗藥性的rpoB基因；引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因；引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因分型。結核桿菌的相關抗藥性作用機制如下表
注katGcatalase-peroxidase；inhAenoyl-acyl carrier protein reductase；ahp Calkylhydroperoxide reductase；rpoBsubunit B of RNA polymerase；rpsLribosomalprotein S12；rrs16S rRNA；embBarabinosyl transferase；pncApyrazinamidasenicotinamidase；gyrADNA gyrase subunit A。
在現有技術中，結核桿菌的抗藥性檢測主要是檢測分離培養的結核桿菌在不同濃度的不同抗菌藥物的特定生長條件下的生長速度。經常使用的方法有平板擴散(disk diffusion)、培養液稀釋(broth dilution)、瓊脂稀釋(agar dilution)和遞度擴散(gradient diffusion)等。因為結核桿菌生長非常緩慢，檢測及抗藥性分析一般需6～8周。由於抗藥性的遺傳機制的有關研究的大量報導，抗藥性的基因檢測正在成為臨床實驗室的一種方法(Franklin R Cockerill III，GantimicrobialAgents and Chemotherapy，43(2)，199-212，1999)。現在結核桿菌抗藥性相關基因突變檢測方法主要有(1)PCR-SSCP(single-stranded conformation polymorphism)，SSCP是指單鏈DNA分子在中性PAGE中電泳遷移率隨其構象改變的性質。因此可作為基因變異的檢測方法，最早由Orita用於癌基因點突變和人基因組多態性研究(Orita，M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，2766，1989)，此法僅能檢測基因變異的存在，而不能確定突變的部位和內容。以下文獻報導了目前廣泛應用於結核桿菌抗藥性基因檢測的方法(Heym B et al.，Mol.Microbiol.15，235-245，1995；Rouse D.A.et al.，Antimicrob.Agents Chemother.39，2472-2477，1995；Selvakumar N，et al.，Curr.Sci.73，774-777，1997；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，1677-1681，1997；Telenti A，et al.，J Clin Microbiol.，35，719-723，1997；Temesgen Z，et al.，Mol Cell.Probes，11，59-63，1997；Whelen A.C，et al.，J Clin Microbiol.，33，556-561，1995；Victor T. C，et al.，Antimicrob.AgentsChemother，40，1572，1996)；(2)PCR-RFLP(restriction fragment lengthpolymorphism)，該方法利用多種限制性內切酶對基因擴增產物進行酶切，不同的基因序列將產生不同的電泳圖譜(Nachamkin I，et al.，Clin Infect Dis.，24，894-900，1997；Cockerill F.R，et al.，J Infect Dis.，171，240-245，1995；Haas W.H，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，1601-1603，1997)。該方法只能應用於當突變改變了某一酶切位點時；(3)PCR-LiPA(line probe assay)(Rossau R，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，2093-2098，1997)，該方法需進行同位素標記或地高辛，生物素，過氧化物酶等標記，分析過程複雜，不適宜快速分析；(4)DNA測序法Musser J.M，et al.，J Infect Dis.，173，196-202，1996；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，600-606，1997；William D.L，et al，Clin InfectDis.，26，446-450，1998；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，40，1024-1026，1996；Sreevatsan S，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，41，636-640，1997；Takiff H.E，et al.，Antimicrob.Agents Chemother，38，773-780，1994)，這是最直觀，最準確的方法。但技術複雜價格昂貴，不能作為常規方法。
Affymetrix公司研究開發了結核桿菌利福平抗藥性基因晶片(A.Troesch et al.，J of Clinical Microbiology，37(1)，49-55，1999；T.R.Gingeras et al.，Genome Research，8,435-448,1998)，該公司是利用光導DNA原位合成方法在矽片上合成特定的DNA探針的方法製作這種晶片。該晶片製作方法複雜，設備要求高，晶片雜交信號處理困難，並且只能檢測一種藥物的抗藥性。Orchid Biocomputer公司開發了引物延伸序列掃描方法(S.R.Head et al.，Molecular and Cellular Probes，13，81-87，1999)檢測結核桿菌利福平抗藥性，由於固相表面引物延伸仍然存在許多技術問題，靈敏度及解析度都較低，難以大規模使用。
綜上所述，在結核桿菌抗藥性相關基因突變診斷的現有技術中，存在操作繁雜，所需時間長，成本較高，難以自動化及大量樣本平行分析等問題。
本發明的目的是針對現有技術的不足，提出一種可同時檢測結核桿菌所有抗藥性相關基因突變的檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片。
本發明還涉及一種待檢測樣品的靶的基因或突變區域的PCR擴增引物。
實現本發明目的的技術方案如下所述所說的檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片，是一種在表面固定了檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的特異DNA探針的玻片、矽片、膜、高分子材料。
所說的探針為引起利福平抗藥性的rpoB基因突變探針W1 gga gtt ctt cgg cacW2 cag cca gct gag ccaW3 agc tga gcc aat tcaW4 att cat gga cca gaaW5 tgg acc aga aca accW6 caa ccc gct gtc gggW7 ccg ctg tcg ggg ttW8 ggt tga ccc aca agcW9 ttg acc cac aag cgcW10 aag cgc cga ctg tcgW11 cga ctg tcg gcg ctgW12 tcg gcg ctg ggg cccM1 gga gtt gtt cgg cacM2 cca gcc atc tga gccM3 agc cag cng agc caa n---c，gM4 cca gct ggg cca attM5 cag ctg acc caa ttcM6 gct gag cna att cat n---a，gM7 ctg agc cna ttc atg n---t，cM8 agc caa ttc ttc atgM9 gcc aat tca tgt tcaM10cat gga caa ccc gctM11gga cca gaa ccc gctM12att cat gaa caa cccM13tgg acc acc cgc tgtM14gct gag cat gga ccaM15ctg agc cac cag aacM16aat tca tag acc agaM17att cat gta cca gaaM18ttc atg gtc cag aac n---t，gM19tca tgg agc aga acaM20caa ccc gat gtc gggM21 ccc gct gcc ggg gttM22 ccg ctg tng ggg ttg n---t，aM23 ggg ttg aac cac aagM24 gtt gac can caa gcg n---t，g，aM25 ttg acc cnc aag cgc n---g，t，cM26 tga ccc ana agc gcc n---a，gM27 aag cgc caa ctg tcgM28 ccg act gcc ggc gctM29 cga ctg tng gcg ctg n---a，t，gM30 gac tgt ctg cgc tggM31 tcg gcg ccg ggg ccc引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因突變探針 引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因突變探針 引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、ahpC基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域突變探針 引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因突變探針 引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因突變探針 這些設計的探針的長度可以有一定的增加或減少，一般在10～25個鹼基範圍。
本發明與現有技術相比，在一顯微鏡載玻片表面，固定160×2DNA探針，因此一次可同時檢測引起結核桿菌抗藥性相關基因----引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域；引起利福平抗藥性的rpoB基因；引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因；引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因的常見基因突變。同時具有平行分析和多重分析的特定。結核桿菌抗藥性相關基因突變的檢測可縮短至1天內完成。開發的檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片可檢測116種常見抗藥性突變位點，包括katG基因的10種突變位點(SEQ ID 7)；inhA基因的4種突變位點(SEQ ID 6)；oxyR基因和ahp C基因的中間區域的13種突變位點(SEQ ID 5)；rpoB基因的43種突變位點(SEQ ID 1)；rpsL基因的5種突變位點(SEQ ID 2)；rrs基因的10種突變位點(SEQ ID 3)；embB基因的6種突變位點(SEQ ID 8)；pncA基因的17種突變位點(SEQ ID 9)和gyrA基因的8種突變位點(SEQ ID 4)。所需時間為一天。生產成本少於30元。
下面結合附圖和實施例對本發明作詳細說明。
圖1是檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片模式圖。
圖2是一種利福平抗藥性結核桿菌的雜交結果圖。
圖3是一種異煙肼抗藥性結核桿菌的雜交結果圖。
圖4是一種鏈黴素抗藥性結核桿菌的雜交結果圖。
圖1中黑色點陣為野生型探針；白色點陣為突變型探針。由
圖1可見，該基因晶片包括①利福平抗藥性分型區域陣列1，野生型探針從左到右分別是W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、W10、W11和W12；突變型探針從左到右，從上到下分別是W1、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、W1、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、W1、M23、M24、M25、M26、M27、M28、M29、M30和M31；②異煙肼抗藥性分型區域陣列2，上排野生型探針從左到右分別OA4(1)、OA-4(1)、OA-6(1)、OA-9(1)、OA-9(1)、OA-12(1)、OA-32(1)、OA-34(1)、OA-39(1)、OA-44(1)、OA-45(1)、OA-45(1)；上排突變型探針從左到右分別是OA4(2)、OA-4(2)、OA-6(2)、OA-9(2)、OA-10(2)、OA-12(2)、0A-32(2)、OA-34(2)、OA-39(2)、OA-44(2)、OA-45(2)、OA-46(2)；下排野生型探針從左到右分別KatG275(1)、KatG833(1)、KatG848(1)、KatG315(1)、KatG328(1)、KatG463(1)、KatG488(1)、KatG500(1)、RBS-A(1)、RBS-T(1)、KatG315(3)、KatG328(3)；下排突變型探針從左到右分別是KatG275(2)、KatG833(2)、KatG848(2)、KatG315(2)、KatG328(2)、KatG463(2)、KatG488(2)、KatG500(2)、RBS-A(2)、RBS-T(2)、RBS-C(2)、RBS-T(3)；③鏈黴素和Fluoroquinolones抗藥性分型區域陣列，上排野生型探針從左到右分別是16S-491(1)、16S-512(1)、16S-512(1)、16S-516(1)、16S-798(1)、16S-877(1)、16S-904(1)、16S-905(1)、16S-905(1)、S12-9(1)；上排突變型探針從左到右分別是16S-491(2)、16S-512(2)、16S-513(2)、16S-516(2)、16S-798(2)、16S-877(2)、16S-904(2)、16S-905(2)、16S-906(2)、S12-9(2)；下排野生型探針從左到右分別是S12-43(1)、S12-88(1)、S12-88(1)、S12-93(1)、GyrA88(1)、GyrA90(1)、GyrA91(1)、GyrA94(1)、GyrA94(1)；下排突變型探針從左到右分別是S12-43(2)、S12-88(2)、S12-88(3)、S12-93(2)、GyrA88(2)、GyrA90(2)、GyrA91(2)、GyrA94(2)、GyrA94(3)；④吡嗪醯胺和乙胺丁醇抗藥性分型區域陣列，上排野生型探針從左到右分別PncA55(1)、PncA55(1)、PncA57(1)、PncA63(1)、PncA68(1)、PncA69(1)、PncA72(1)、PncA76(1)、PncA85(1)、PncA96(1)；上排突變型探針從左到右分別是PncA55(2)、PncA55(3)、PncA57(2)、PncA63(2)、PncA68(2)、PncA69(2)、PncA72(2)、PncA76(2)、PncA85(2)、PncA96(2)；下排野生型探針從左到右分別PncA132(1)、PncA137(1)、PncA138(1)、PncA139(1)、PncA141(1)、PncA142(1)、EmbB306(1)、EmbB306(1)、EmbB306(1)、EmbB330(1)；下排突變型探針從左到右分別是PncA132(2)、PncA137(2)、PncA138(2)、PncA139(2)、PncA141(2)、PncA142(2)、EmbB306(2)、EmbB306(3)、EmbB306(4)、EmbB330(2)；本發明的目的是這樣實現的將涉及的特異性探針固定於一種載體如載玻片、矽片、膜和高分子材料表面。用表面陣列的特異性DNA探針雜交方法來檢測引起結核桿菌抗藥性的所有相關基因突變。
探針設計選取結核桿菌抗藥性katG基因的10種突變位點、inhA基因的4種突變位點、oxyR基因和ahp C基因的中間區域的13種突變位點、rpoB基因的43種突變位點、rpsL基因的5種突變位點、rrs基因的10種突變位點、embB基因的6種突變位點、pncA基因的17種突變位點和gyrA基因的8種突變位點，合成相對應的野生型和突變型DNA探針，固定於載體表面。
檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片的構建合成以上160種DNA探針，5』末端用氨基或其它活性基團修飾。每種探針重複3次固定於載體的活性表面，構建檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片。
樣品處理用設計的PCR引物擴增待檢測樣品的靶的基因或突變區域，螢光標記可以用PCR引物末端標記或PCR擴增時加入螢光標記的dNTP。設計的PCR引物是RpoB1 tcacaccgcagacgttgatRpoB2 cacgctcacgtgacagaccRps1 ggtagatgccaaccatccagRps2 tcttgacaccctgcgtatcc16S1 gggttctctcggattgacg16S2 cgagctctttacgcccagta16S3 gcagtaactgacgctgagga16S4 cgttgcatcgaattaatccacGyrA1 ggtgctctatgcaatgttcgGyrA2 gcttcggtgtacctcatcgOA1 attgatcgccaatggttagcOA2 ccggctagcacctcttggInhA1 gtaaccccagtgcgaaagttInhA2 actgaacgggatacgaatggKatG1 catgaacgacgtcgaaacagKatG2 ccgtacaggatctcgaggaaKatG3 ccgagattgccagccttaKatG4 agggtgcgaatgaccttgembB1 tgatattcggcttcctgctcembB2 gctgacatgggtcatcagcPncA1 ggcggactaccatcacgtcPncA2 ccgttctcgtcgactccttPncA3 tcgaaggagtcgacgagaacPncA4 acacacccgctgtcaggt晶片表面雜交螢光標記的PCR擴增產物在一定的條件下與檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片表面的DNA探針雜交，用特定的洗脫條件可以區分全配雜交和單鹼基失配雜交。
雜交信號檢測雜交洗脫後用共聚焦螢光顯微鏡或螢光掃描儀檢測DNA晶片雜交信號；從而可以檢測結核桿菌抗藥性katG基因的10種突變位點、inhA基因的4種突變位點、oxyR基因和ahpC基因的中間區域的13種突變位點、rpoB基因的43種突變位點、rpsL基因的5種突變位點、rrs基因的10種突變位點、embB基因的6種突變位點、pncA基因的17種突變位點和gyrA基因的8種突變位點。
實施例1現結合附
圖1和圖2介紹本發明的實施例1。利用本發明的晶片檢測利福平抗藥性結核桿菌。取分離培養的結核桿菌溶液1毫升，利用商業化的DNA抽提試劑盒或標準的苯酚抽提/乙醇沉澱方法提取待測結核桿菌基因組DNA，用設計的PCR(聚合酶鏈式反應)引物RpoB1tcacaccgcagacgttgat和RpoB2Cy5-cacgctcacgtgacagacc對rpoB基因片段進行擴增。擴增的體積為100μl，PCR產物中，加入1/10體積的3M pH5.2醋酸緩衝液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻後，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉澱，乾燥。
DNA晶片表面雜交過程
5μl雜交緩衝液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加於DNA晶片表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。雜交信號檢測用螢光掃描儀GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000檢測DNA晶片雜交信號。結果如圖2。結果顯示，待測結核桿菌是一種帶有rpoB基因Ser531Leu突變的利福平抗藥性結核桿菌。
實施例2現結合附
圖1和圖3介紹本發明的實施例2。利用本發明的晶片檢測異煙肼抗藥性結核桿菌。取分離培養的結核桿菌溶液1毫升，利用商業化的DNA抽提試劑盒或標準的苯酚抽提/乙醇沉澱方法提取待測結核桿菌基因組DNA，用設計的PCR(聚合酶鏈式反應)引物KatG1catgaacgacgtcgaaacag；KatG2Cy5-ccgtacaggatctcgaggaa和KatG3ccgagattgccagcctta；KatG4Cy5-agggtgcgaatgaccttg對katG基因、InhA1gtaaccccagtgcgaaagtt和InhA2Cy5-actgaacgggatacgaatgg對inhA基因、OA1attgatcgccaatggttagc和OA2Cy5-ccggctagcacctcttgg對oxyR基因和ahp C基因的中間區域片段進行擴增。擴增的體積分別為50μl，混合PCR產物，加入1/10體積的3M pH5.2醋酸緩衝液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻後，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉澱，乾燥。
DNA晶片表面雜交過程5μl雜交緩衝液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加於DNA晶片表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。雜交信號檢測用螢光掃描儀GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000檢測DNA晶片雜交信號。結果如圖3。結果顯示，待測結核桿菌是一種帶有oxyR基因和ahpC基因的中間區域G-12A突變的異煙肼抗藥性結核桿菌。
實施例3現結合附圖l和圖4介紹本發明的實施例3。利用本發明的晶片檢測一種結核桿菌。取分離培養的結核桿菌溶液1毫升，利用商業化的DNA抽提試劑盒或標準的苯酚抽提/乙醇沉澱方法提取待測結核桿菌基因組DNA，用設計的12組PCR(聚合酶鏈式反應)引物對katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域、rpoB基因、rpsL基因、rrs基因、embB基因、pncA基因和gyrA基因進行擴增。擴增的體積分別為50μl，混合PCR產物，加入1/10體積的3MpH5.2醋酸緩衝液，加入2.5倍體積的-20℃冷藏的100％乙醇，混勻後，-20℃放置30分鐘。13000rpm離心10分鐘，用70％乙醇洗滌沉澱，乾燥。
DNA晶片表面雜交過程5μl雜交緩衝液(5 X SSC，0.2％SDS)溶解上述DNA，95℃變性5分鐘，冷卻至室溫，滴加於DNA晶片表面，再蓋上載玻片，42℃雜交4～8小時。
雜交信號檢測用螢光掃描儀GSI Lumonics Inc(Watertown，MA)的ScanArray5000檢測DNA晶片雜交信號。結果如圖4。從晶片雜交結果圖4可以知道待測結核桿菌是rpsL的K88Q突變，具有鏈黴素抗藥性。
基因序列表(1)SEQ ID 1rpoB(βsubunit of RNA polymerase)基因片段(GenBank L27989)及突變位點(陰影位點) (2)SEQ ID 2rpsL(核糖體蛋白S12)基因片段(GenBank L08011)及突變位點(陰影位點) (3)SEQ ID 3rrs(16s rRNA)基因片段(GenBank X52917)及突變位點(陰影位點) (4)SEQ ID 4gyrA(A subunit of DNA gryase)基因片段(GenBank L27512)及突變位點(陰影位點) (5)SEQ ID 5oxyR基因和ahp C基因的中間區域片段(GenBank U16243)及突變位點(陰影位點) (6)SEQ ID 6inhA基因調控區域片段(GenBank U41388)及突變位點(陰影位點) (7)SEQ ID 7KatG(catalase-peroxidase)基因片段(GenBank X68081)及突變位點(陰影位點) (8)SEQ ID 8embB基因片段(GenBank U68480)及突變位點(陰影位點) (9)SEQ ID 9pncA(pyranzinamidase)基因片段(GenBank U59967)及突變位點(陰影位點)
權利要求
1.一種檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片，由玻片、矽片、膜或高分子材料和固定在其表面的DNA探針所構成，其特徵在於所說的DNA探針為檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的特異DNA探針。
2.如權利要求1所說的基因晶片，其特徵在於，所說的引起結核桿菌抗藥性相關基因突變的特異DNA探針為引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域；引起利福平抗藥性的rpoB基因；引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因；引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因；引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因，所說的引起利福平抗藥性的rpoB基因突變探針為W1 gga gtt ctt cgg cacW2 cag cca gct gag ccaW3 agc tga gcc aat tcaW4 att cat gga cca gaaW5 tgg acc aga aca accW6 caa ccc gct gtc gggW7 ccg ctg tcg ggg ttW8 ggt tga ccc aca agcW9 ttg acc cac aag cgcW10 aag cgc cga ctg tcgW11 cga ctg tcg gcg ctgW12 tcg gcg ctg ggg cccM1 gga gtt gtt cgg cacM2 cca gcc atc tga gccM3 agc cag cng agc caa n---c，gM4 cca gct ggg cca attM5 cag ctg acc caa ttcM6 gct gag cna att cat n---a，gM7 ctg agc cna ttc atg n---t，cM8 agc caa ttc ttc atgM9 gcc aat tca tgt tcaM10 cat gga caa ccc gctM11 gga cca gaa ccc gctM12 att cat gaa caa cccM13 tgg acc acc cgc tgtM14 gct gag cat gga ccaM15 ctg agc cac cag aacM16 aat tca tag acc agaM17 att cat gta cca gaaM18 ttc atg gtc cag aac n---t，gM19 tca tgg agc aga acaM20 caa ccc gat gtc gggM21 ccc gct gcc ggg gttM22 ccg ctg tng ggg ttg n---t，aM23 ggg ttg aac cac aagM24 gtt gac can caa gcg n---t，g，aM25 ttg acc cnc aag cgc n---g，t，cM26 tga ccc ana agc gcc n---a，gM27 aag cgc caa ctg tcgM28 ccg act gcc ggc gctM29 cga ctg tng gcg ctg n---a，t，gM30 gac tgt ctg cgc tggM31 tcg gcg ccg ggg ccc所說的引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因突變探針為 引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因突變探針 所說的引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、ahpc基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域突變探針為 所說的引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因突變探針為 所說的引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因突變探針為
3.如權利要求2所述的晶片，其特徵在於探針的長度為10～25個鹼基範圍。
4.如權利要求1～4所述的任一晶片，其特徵在於，設計螢光標記PCR引物擴增相關基因片段，所說的PCR引物為RpoB1 tcacaccgcagacgttgatRpoB2 cacgctcacgtgacagaccRps1 ggtagatgccaaccatccagRps2 tcttgacaccctgcgtatcc16S1 gggttctctcggattgacg16S2 cgagctctttacgcccagta16S3 gcagtaactgacgctgagga16S4 cgttgcatcgaattaatccacGyrA1 ggtgctctatgcaatgttcgGyrA2 gcttcggtgtacctcatcgOA1attgatcgccaatggttagcOA2ccggctagcacctcttggInhA1 gtaaccccagtgcgaaagttInhA2 actgaacgggatacgaatggKatG1 catgaacgacgtcgaaacagKatG2 ccgtacaggatctcgaggaaKatG3 ccgagattgccagccttaKatG4 agggtgcgaatgaccttgembB1 tgatattcggcttcctgctcembB2 gctgacatgggtcatcagcPncA1 ggcggactaccatcacgtcPncA2 ccgttctcgtcgactccttPncA3 tcgaaggagtcgacgagaacPncA4 acacacccgctgtcaggt
全文摘要
本發明公開了一種檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的DNA晶片。在玻片等材料表面固定檢測引起結核桿菌抗藥性的相關基因突變的特異DNA探針。所說的基因是引起異煙肼抗藥性的katG基因、inhA基因、oxyR基因和ahp C基因的中間區域;引起利福平抗藥性的rpoB基因;引起鏈黴素抗藥性的rpsL基因和rrs基因;引起乙胺丁醇抗藥性的embB基因;引起吡嗪醯胺抗藥性的pncA基因和引起Fluoroquinolones抗藥性的gyrA基因。結核桿菌抗藥性檢測可縮短至1天內完成,並可同時檢測116種常見抗藥性突變位點。
文檔編號C12Q1/04GK1341752SQ0011987
公開日2002年3月27日 申請日期2000年9月5日 優先權日2000年9月5日
發明者葉邦策 申請人:華東理工大學