一種豬脾轉移因子注射液的製備方法

2023-08-13 04:27:21 1

專利名稱：一種豬脾轉移因子注射液的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物製品的製備方法，特別是涉及一種豬脾轉移因子注射液的製備方法。
背景技術：
現代集約化養殖業，常發性、多發性傳染病種類繁多，應用疫苗接種免疫預防各種傳染病成為養殖業成敗的關鍵。疫苗免疫效果受外因和內因多種因素的影響，外因有疫苗質量、保管和使用方法等，關鍵是內因，主要是機體抗病力和對疫苗的反應，尤其是機體的免疫系統功能狀態。影響機體免疫系統功能狀態的因素很多，如某些疾病、應激、抗生素的應用、營養不良等都能使機體的免疫系統功能下降或抑制而影響免疫效果。開發應用動物免疫增強劑改善機體特異性、非特異性免疫系統功能，提高疫苗免疫效果，增強機體抗感染能力已日益引起人們的重視。轉移因子(Transfer factor)是動物體內有免疫活性的T淋巴細胞所釋放的多種因子中一種能夠轉移免疫致敏信息的因子，它能夠特異性地將供體某一細胞免疫功能轉移給受體動物，非特異性地增強受體動物免疫功能，是一種新型的免疫激發劑。傳統生產方法生產豬脾轉移因子注射液，原料經預處理、絞碎、勻漿、反覆凍融、離心、透析、離心、過濾等工藝製成，經傳統生產工藝加工會破壞原材料的生物活性成分，有效成分利用率低，且生產周期長，至少需要7天。

發明內容
本發明的目的是提供一種豬脾轉移因子注射液的製備方法，以解決上述工藝生物活性成分被破壞，有效成分利用率低和生產周期長的問題。

技術方案如下:—種豬脾轉移因子注射液的製備方法，包括:將檢驗合格的豬脾臟預處理後，初絞I 3遍；將初絞的豬脾臟精絞研磨1.5 8分鐘，製成勻漿；在所述勻漿中加入甲醛溶液滅活；將滅活的勻漿反覆凍融6 10次；將反覆凍融的勻漿經離心分離、過濾與超濾，得到半成品；向檢驗合格的半成品中加入注射用水，得到成品。進一步，所述預處理過程中，將豬脾臟解凍融化後，用剪刀剪去脂肪，再用濃度為
0.5 1.5%氯化鈉溶液清洗2 3次。進一步，所述精絞過程中，將初絞的豬脾與純化水按1:1 3的比例混合，置於膠體磨中研磨。進一步，所述滅活過程中，甲醛溶液的加入量佔勻漿總量的0.1 0.2%。進一步，所述滅活條件為，37 42°C下滅活18 24小時，中間間隔4 6小時震搖I次。進一步，所述離心分離過程中，將反覆凍融的勻漿置管式分離機中，將凍融的勻漿，室溫下以16000 20000r/min的轉速連續離心，去沉澱，取上清液備用。進一步，所述過濾過程中，將離心分離得到的上清液先經0.43 0.46 μ m的微孔濾膜第一次過濾，再用0.20 0.26 μ m的微孔濾膜第二次過濾。進一步，所述超濾使用截留分子量為5000 6000道爾頓超濾膜。 進一步，將檢驗合格的豬脾臟去除脂肪，用濃度為0.9%氯化鈉溶液清洗3次，於絞肉機中初絞I遍；將初絞的豬脾臟與純化水按1: 1.5的比例混合，於膠體磨中研磨5分鐘，製成勻漿；向勻漿中加入勻漿總量0.1%的甲醛溶液，37°C滅活24小時，間隔5小時震搖I次；將滅活的勻漿置於-20°C冷庫反覆凍融8次，融化溫度不得超過37°C ;將離心分離得到的上清液先用0.45 μ m的微孔濾膜進行過濾，再用0.22 μ m的微孔濾膜進行過濾，最後用截留分子量為5000道爾頓超濾膜進行超濾。進一步， 半成品中加入注射用水後，加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至6.3 7.5之間。本發明的有益效果:(I)本發明生產的豬脾轉移因子注射液主要成分為低分子活性多肽和核糖，是一種低分子肽一核苷酸複合物，而不是蛋白質。(2)本發明所用原料、儀器取材容易，工藝簡單，成本低，可大大縮短生產周期，周期為4天，節省了大量的人力物力，提高了轉移因子的生產效率，為滿足工業化大規模生產提供了可行途徑。(3)本發明生產的豬脾轉移因子注射液應用安全，過量使用也無毒副作用，無藥物殘留；活性高，臨床用量小，見效快，使用後24 36小時就可發揮作用，效果可持續7天以上。(4)本發明生產的豬脾轉移因子注射液能增強動物免疫功能，提高機體抗感染能力；不僅可用於預防，也可用於病毒感染引起的疾病的緊急輔助治療；配合疫苗同時使用，增強疫苗免疫效果，並且可以彌補疫苗接種後，抗體產生的時間空缺。(5)傳統工藝中離心分離多採用4°C，6000r/min離心15min，收集上清液。本發明的改進工藝中應用管式分離機，克服了製備過程中原料粘度大，顆粒小，比重差小，絮狀物多等問題；且加工材料原有生物活性成分主要為多肽、胺基酸，本發明工藝有效的保護了加工材料原有生物活性成分不被破壞；同時採用室溫下16000 20000r/min高速連續離心的方法，極大的節省了人力物力，增加了產量，每天產量可達2噸，約2000L，提高了收益率，Ikg脾臟大約出1.8L半成品，適用於工業化大規模推廣應用。
具體實施例方式本實施例中以豬脾臟為原料，經剪摘、稱量清洗、初絞、精絞、滅活、凍融、離心分離、澄清過濾與超濾等過程製成轉移因子注射液半成品，傳統生產方法將原料經預處理、絞碎、勻漿、反覆凍融、離心、透析、離心、過濾過程製成，本發明更注重了對離心分離過程、初絞次數、精絞時間、甲醛滅活終濃度、凍融次數的控制。半成品經檢驗合格後，調整含量、PH值進一步製成轉移因子注射液成品。
實施例1:豬脾轉移因子注射液的製備方法一種豬脾轉移因子注射液的製備方法，具體步驟如下:S1:豬脾臟的收集與檢驗；原料選取標準化生豬養殖、屠宰企業收集豬脾臟，標準化生豬養殖、屠宰企業，此屠宰企業應具有《動物防疫合格證》，屠宰場應符合中華人民共和國國家標準GB/T17236-1998《生豬屠宰操作規範》規定，衛生要求應符合《肉類加工衛生規範》GB12649的規定。本實施例所用原料——豬脾臟來自山東得利斯集團，符合豬脾臟原料地及屠宰要求。豬脾臟經外觀檢驗、衛生檢驗、病原微生物檢驗，檢驗合格後方可用作原料。豬脾臟外觀檢驗，健康豬脾臟應呈扁長條形，色澤均勻一致，呈暗紅色或棕紅色，無充血、結節、出血點及腫脹等病灶，具有一定的彈性和硬度，被膜呈灰白色、淺褐色或微灰紅色，切面呈深紅色，實質柔軟，較脆，無腐敗變質等現象，有豬脾臟固有的氣味。衛生檢驗，包括細菌總數檢驗，大腸桿菌最可能數(Most probable number, MPN)檢驗,黴菌總數檢驗。細菌檢驗中標準細菌總數應< 104/g為合格；大腸桿菌最可能數檢驗，標準大腸桿菌MPN < 150萬/g為合格；黴菌總數< 100個/克為合格。病原微生物檢驗，包括口蹄疫病毒檢驗，豬瘟病毒、豬細小病毒檢驗。口蹄疫病毒檢驗採用乳鼠檢查法；豬瘟病毒、豬細小病毒採用外源病毒檢查法。S2:剪摘:將解凍融化的豬脾臟去掉裝袋，按豬脾臟原料標準中外觀項要求，嚴格挑選，並用鑷子夾住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:將剪摘後的原料用濃度為0.5%氯化鈉溶液清洗2次。S4:初絞:將豬脾原料 置於絞肉機裝料鬥內，按絞肉機操作規程進行操作，初絞2遍，並用潔淨物料桶盛裝。S5:精絞:將初絞的豬脾與純化水按1:1的比例混合，置於膠體磨裝料鬥中，按膠體磨操作規程將其研磨1.5分鐘，製成勻漿，並用潔淨物料桶盛接。所用純化水為原水經蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其適宜方法製得的供藥用的水，不含任何添加劑。S6:滅活:按勻漿總量的0.2%加甲醛溶液，42°C滅活18小時，間隔4小時震搖I次。S7:凍融:將滅活的勻漿，置_18°C冷庫反覆凍融6次，融化溫度不得超過37°C。S8:離心分離:將凍融的勻漿置管式分離機中，室溫以18000r/min連續離心，去沉澱，取上清液備用。S9:澄清過濾與超濾:上清液用0.43 μ m的微孔濾膜進行過濾，再用0.20 μ m的微孔濾膜進行過濾除菌，然後用截留分子量為6000道爾頓超濾膜進行超濾，即得轉移因子注射液半成品。超濾液在_20°C以下，保存期為12個月。SlO:半成品檢驗:半成品經pH值、無菌檢驗、含量測定、鑑別檢驗、高分子量物質檢驗等檢驗項目合格後，_20°C保存備用。Sll:成品製備:將半成品溶液移入配液罐中，根據半成品含量測定結果，加入注射用水，使多肽含量不少於1.5mg/ml,核糖含量不少於50 μ g/ml,攪拌30分鐘後,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至6.3 7.5之間，混勻，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由純化水經蒸餾所得。實施例2:豬脾轉移因子注射液的製備方法
—種豬脾轉移因子注射液的製備方法，具體步驟如下:S1:豬脾臟的收集與檢驗；原料選取標準化生豬養殖、屠宰企業收集豬脾臟，標準化生豬養殖、屠宰企業，此屠宰企業應具有《動物防疫合格證》，屠宰場應符合中華人民共和國國家標準GB/T17236-1998《生豬屠宰操作規範》規定，衛生要求應符合《肉類加工衛生規範》GB12649的規定。本實施例所用原料——豬脾臟來自山東得利斯集團，符合豬脾臟原料地及屠宰要求。豬脾臟經外觀檢驗、衛生檢驗、病原微生物檢驗，檢驗合格後方可用作原料。豬脾臟外觀檢驗，健康豬脾臟應呈扁長條形，色澤均勻一致，呈暗紅色或棕紅色，無充血、結節、出血點及腫脹等病灶，具有一定的彈性和硬度，被膜呈灰白色、淺褐色或微灰紅色，切面呈深紅色，實質柔軟，較脆，無腐敗變質等現象，有豬脾臟固有的氣味。衛生檢驗，包括細菌總數檢驗，大腸桿菌最可能數(Most probable number, MPN)檢驗,黴菌總數檢驗。細菌檢驗中標準細菌總數應< 104/g為合格；大腸桿菌最可能數檢驗，標準大腸桿菌MPN < 150萬/g為合格；黴菌總數< 100個/克為合格。病原微生物檢驗，包括口蹄疫病毒檢驗，豬瘟病毒、豬細小病毒檢驗。口蹄疫病毒檢驗採用乳鼠檢查法；豬瘟病毒、豬細小病毒採用外源病毒檢查法。S2:剪摘:將解凍融化的豬脾臟去掉裝袋，按豬脾臟原料標準中外觀項要求，嚴格挑選，並用鑷子夾住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:將剪摘後的原料用濃度為0.9%氯化鈉溶液清洗3次。S4:初絞:將豬脾原料置於絞肉機裝料鬥內，按絞肉機操作規程進行操作，初絞I遍，並用潔淨物料桶盛裝。S5:精絞:將初絞的豬脾與純化水按1:1.5的比例混合，置於膠體磨裝料鬥中，按膠體磨操作規程將其研磨5分鐘，製成勻漿，並用潔淨物料桶盛接。所用純化水為原水經蒸餾法、離子交換法、反滲 透法或其適宜方法製得的供藥用的水，不含任何添加劑。S6:滅活:按勻漿總量的0.1%加甲醛溶液，37°C滅活24小時，間隔5小時震搖I次。S7:凍融:將滅活的勻漿，置_20°C冷庫反覆凍融8次，融化溫度不得超過37°C。S8:離心分離:將凍融的勻漿置管式分離機中，室溫以16000r/min連續離心，去沉澱，取上清液備用。S9:澄清過濾與超濾:上清液用0.45 μ m的微孔濾膜進行過濾，再用0.22 μ m的微孔濾膜進行過濾除菌，然後用截留分子量為5000道爾頓超濾膜進行超濾，即得轉移因子注射液半成品。超濾液在_20°C以下，保存期為12個月。SlO:半成品檢驗:半成品經pH值、無菌檢驗、含量測定、鑑別檢驗、高分子量物質檢驗等檢驗項目合格後，_20°C保存備用。Sll:成品製備:將半成品溶液移入配液罐中，根據半成品含量測定結果，加入注射用水，使多肽含量不少於1.5mg/ml,核糖含量不少於50 μ g/ml,攪拌30分鐘後,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至6.3 7.5之間，混勻，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由純化水經蒸餾所得。實施例3:豬脾轉移因子注射液的製備方法一種豬脾轉移因子注射液的製備方法，具體步驟如下:
S1:豬脾臟的收集與檢驗；原料選取標準化生豬養殖、屠宰企業收集豬脾臟，標準化生豬養殖、屠宰企業，此屠宰企業應具有《動物防疫合格證》，屠宰場應符合中華人民共和國國家標準GB/T17236-1998《生豬屠宰操作規範》規定，衛生要求應符合《肉類加工衛生規範》GB12649的規定。本實施例所用原料——豬脾臟來自山東得利斯集團，符合豬脾臟原料地及屠宰要求。豬脾臟經外觀檢驗、衛生檢驗、病原微生物檢驗，檢驗合格後方可用作原料。豬脾臟外觀檢驗，健康豬脾臟應呈扁長條形，色澤均勻一致，呈暗紅色或棕紅色，無充血、結節、出血點及腫脹等病灶，具有一定的彈性和硬度，被膜呈灰白色、淺褐色或微灰紅色，切面呈深紅色，實質柔軟，較脆，無腐敗變質等現象，有豬脾臟固有的氣味。衛生檢驗，包括細菌總數檢驗，大腸桿菌最可能數(Most probable number, MPN)檢驗,黴菌總數檢驗。細菌檢驗中標準細菌總數應< 104/g為合格；大腸桿菌最可能數檢驗，標準大腸桿菌MPN < 150萬/g為合格；黴菌總數< 100個/克為合格。病原微生物檢驗，包括口蹄疫病毒檢驗，豬瘟病毒、豬細小病毒檢驗。口蹄疫病毒檢驗採用乳鼠檢查法；豬瘟病毒、豬細小病毒採用外源病毒檢查法。

S2:剪摘:將解凍融化的豬脾臟去掉裝袋，按豬脾臟原料標準中外觀項要求，嚴格挑選，並用鑷子夾住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:將剪摘後的原料用濃度為1.5%氯化鈉溶液清洗3次。S4:初絞:將豬脾原料置於絞肉機裝料鬥內，按絞肉機操作規程進行操作，初絞3遍，並用潔淨物料桶盛裝。S5:精絞:將初絞的豬脾與純化水按1: 3的比例混合，置於膠體磨裝料鬥中，按膠體磨操作規程將其研磨8分鐘，製成勻漿，並用潔淨物料桶盛接。所用純化水為原水經蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其適宜方法製得的供藥用的水，不含任何添加劑。S6:滅活:按勻漿總量的0.15%加甲醛溶液，40°C滅活20小時，間隔6小時震搖I次。S7:凍融:將滅活的勻漿，置_19°C冷庫反覆凍融10次，融化溫度不得超過37°C。S8:離心分離:將凍融的勻漿置管式分離機中，室溫以20000r/min連續離心，去沉澱，取上清液備用。S9:澄清過濾與超濾:上清液用0.46 μ m的微孔濾膜進行過濾，再用0.23 μ m的微孔濾膜進行過濾除菌，然後用截留分子量為5500道爾頓超濾膜進行超濾，即得轉移因子注射液半成品。超濾液在_20°C以下，保存期為12個月。SlO:半成品檢驗:半成品經pH值、無菌檢驗、含量測定、鑑別檢驗、高分子量物質檢驗等檢驗項目合格後，_20°C保存備用。Sll:成品製備:將半成品溶液移入配液罐中，根據半成品含量測定結果，加入注射用水，使多肽含量不少於1.5mg/ml,核糖含量不少於50 μ g/ml,攪拌30分鐘後,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至6.3 7.5之間，混勻，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由純化水經蒸餾所得。實施例4:初絞次數對半成品的影響傳統工藝中初絞次數一般為3次，經反覆研究確定初絞次數為I次，極大的節省了人力物力。
本實施例中，將豬脾臟使用絞肉機進行不同次數的重複絞碎，每組絞碎的脾臟樣品設置3個平行樣，其他生產工藝按照實施例2的步驟執行，不同絞碎次數生產出的半成品含量檢測結果見表I。表I
權利要求
1.一種豬脾轉移因子注射液的製備方法，包括: 將檢驗合格的豬脾臟預處理後，初絞I 3遍； 將初絞的豬脾臟精絞研磨1.5 8分鐘，製成勻漿； 在所述勻漿中加入甲醛溶液滅活； 將滅活的勻漿反覆凍融6 10次； 將反覆凍融的勻漿經離心分離、過濾與超濾，得到半成品； 向檢驗合格的半成品中加入注射用水，得到成品。
2.如權利要求1所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述預處理過程中，將豬脾臟解凍融化後，用剪刀剪去脂肪，再用濃度為0.5 1.5%氯化鈉溶液清洗2 3次。
3.如權利要求2所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述精絞過程中，將初絞的豬脾與純化水按1:1 3的比例混合，置於膠體磨中研磨。
4.如權利要求3所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述滅活過程中，甲醛溶液的加入量佔勻漿總量的0.1 0.2%。
5.如權利要求4所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述滅活條件為，37 42°C下滅活18 24小時，中間間隔4 6小時震搖I次。
6.如權利要求5所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述離心分離過程中，將反覆凍融的勻漿置 管式分離機中，將凍融的勻漿，室溫下以16000 20000r/min的轉速連續離心，去沉澱，取上清液備用。
7.如權利要求6所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述過濾過程中，將離心分離得到的上清液先經0.43 0.46 μ m的微孔濾膜第一次過濾，再用0.20 0.26 μ m的微孔濾膜第二次過濾。
8.如權利要求7所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:所述超濾使用截留分子量為5000 6000道爾頓超濾膜。
9.如權利要求8所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:將檢驗合格的豬脾臟去除脂肪，用濃度為0.9%氯化鈉溶液清洗3次，於絞肉機中初絞I遍；將初絞的豬脾臟與純化水按1: 1.5的比例混合，於膠體磨中研磨5分鐘，製成勻漿；向勻漿中加入勻漿總量0.1%的甲醛溶液，37°C滅活24小時，間隔5小時震搖I次；將滅活的勻漿置於_20°C冷庫反覆凍融8次，融化溫度不得超過37°C ;將離心分離得到的上清液先用0.45 μ m的微孔濾膜進行過濾，再用0.22 μ m的微孔濾膜進行過濾，最後用截留分子量為5000道爾頓超濾膜進行超濾。
10.如權利要求1所述的豬脾轉移因子注射液的製備方法，其特徵在於:半成品中加入注射用水後，加入鹽酸或氫氧化鈉溶液調pH至6.3 7.5之間。
全文摘要
一種豬脾轉移因子注射液的製備方法，包括將檢驗合格的豬脾臟預處理後，初絞1～3遍；將初絞的豬脾臟精絞研磨1.5～8分鐘，製成勻漿；在所述勻漿中加入甲醛溶液滅活；將滅活的勻漿反覆凍融6～10次；將反覆凍融的勻漿經離心分離、過濾與超濾，得到半成品；向檢驗合格的半成品中加入注射用水，得到成品。本發明工藝簡單，成本低，可大大縮短生產周期，周期為4天，節省了大量的人力物力，提高了轉移因子的生產效率。
文檔編號A61K38/19GK103212062SQ20131013647
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月18日 優先權日2013年4月18日
發明者李朝陽, 喬彥良 申請人:山東信得科技股份有限公司