一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體及其構建方法和應用的製作方法

2023-08-12 15:03:36 2

專利名稱：一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體及其構建方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及氯黴素抗體領域，具體涉及一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體及其 構建方法和應用。
背景技術：
氯黴素(CAP)是一種可引起人類再生障礙性貧血粒狀白細胞缺乏症等嚴重疾病 的抗生素，自1994年起便被聯合國禁止使用，我國亦自2002年起明確規定動物源性食品 中氯黴素殘留不得檢出(王伊琴，包勇敢，胡烈山，等.ELISA在檢測動物組織氯黴素殘留 中的應用[J].中國農業通報，2006，22 (4) :26-29.)，但由於廉價高效，目前仍被廣泛非法 濫用於養殖業，給人民生命健康和我國動物源性食品相關產品的出口貿易帶來了較大的挑 戰。特異性抗體在食品有害殘留檢測中具有重要意義，高質量的抗體是食品有害殘留樣品 的製備和檢測的關鍵試劑(周宏琛，閆秋成，田曉林，等.動物源性食品安全快速檢測與酶 聯免疫吸附方法的應用[J].肉品衛生，2005,25(11) :29-32.)。單克隆抗體(MAb)具有特 異性強和親和力高的優點，但其現有生產技術存在生產成本高、規模難於工業放大和質控 等缺點。基因工程小分子抗體是單克隆抗體的理想替代產品，目前已有眾多獸藥和農藥類 小分子半抗原的基因工程抗體的報導(YAU KY, LEEH，HALL J C. et al. Emerging trends in the synthesis and improvement of hapten-specific recombinant antibodies[J]. Biotechnology Advances, 2003, 21 :599_637. >KRAMER K,HOCK B. Recombinant antibodies for environmental analysis[J]. Anal. Bioanal. Chem. 2003,377,417-426. > H00GENB00M H R. Selecting and screening recombinant antibody libraries[J]. Nature 2005,23, 1105-1116.)。單鏈抗體(scFv)是一種以柔性接頭連接抗體重鏈和輕鏈可變區的小分子 基因工程抗體，該類抗體既保留了母本抗體的親和力又便於基因工程手段生產，因此得到 了較廣泛的研究和應用。但該類抗體的二個可變區之間由於缺乏母本抗體那樣的鏈間二 硫鍵，因此穩定性較差。二硫鍵穩定的單鏈抗體(sdsFv)即是通過模擬天然抗體的結構 而在單鏈抗體基礎上引入一對二硫鍵的構建形式(NISHI K，ISHIUCHI M，M0RIMUNE K，et al. Molecular and immunochemical characteristics of monoclonal and recombinant antibodies selective for the triazine herbicide simetryn and application to environment analysis. J. Agric. Food Chem. 2005，53，5096-5104.)。我們曾報導了抗氯黴 素單克隆抗體可變區基因的克隆(李黃金，趙林，陳偉，等.抗氯黴素抗體可變區基因的克 隆與序列分析[J].現代預防醫學，2009，36 (24) =4655-4658.) 0

發明內容
本發明的目的在於根據現有的用於檢測氯黴素殘留的單鏈抗體中存在的可變區 之間缺乏二硫鍵，穩定性較差的問題，提供了一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。本發明另一目的在於提供經過優化的編碼上述抗氯黴素單鏈抗體的cDNA。本發明另一目的在於提供上述抗氯黴素單鏈抗體的構建方法。
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本發明另一目的在於提供一種含有上述氯黴素單鏈抗體的試劑盒。本發明還有一個目的在於提供上述氯黴素單鏈抗體的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體，其胺基酸序列如SEQ ID NO 1所示。一種編碼權利要求1所述二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體的cDNA，其特徵在於其 核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體的構建方法是以抗氯黴素抗體可變區基 因為模板，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區分別加入一個半胱氨酸定點突變，以 重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體基因，將該基因轉導入大腸桿菌表達 系統中，表達的蛋白即為二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。一種試劑盒，該試劑盒中包含二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。單鏈抗體(scFv)是目前得到廣泛應用的基因工程抗體類型，該類抗體是以 (Gly4Ser)JMf Vh和\片段連接起來而形成的單鏈小分子抗體。眾多的研究結果表明， scFv類小分子抗體擁有與母本單抗相似、甚至更高的親和力。二硫鍵穩定的單鏈抗體 (sdsFv)是為了提高scFv的穩定而在V1^P Vl間引入一對二硫鍵的改良型。目前在sdsFv 中的二硫鍵位置主要是Vh44和Vutltl，分別位於Vh的FR2區和\的FR4，均為非抗原識結合， 所以此處引入二硫鍵對抗體的親和力影響不大。我們通過以KABAT資料庫比對單抗V區氨 基酸保守序列進行推斷，得出先前克隆的抗氯黴素抗體V基因的突變位點為Vh49和Vu2tl,並 以此為基礎構建sdsFVCAP。與scFV 類抗體一樣，sdsFv 也有 VH-linker_VL 和 Vflinker-V11 二種構建形式。有 研究表明，以前種形式構建的sdsFv親和力高於後者形式的，但表達水平遠低於後者的。在 本發明中所構建的sdsFV。^基因不能獨立表達，但當融合於Trx的3』端時可高效表達，表 明該基因的5』端序列影響轉錄或翻譯。當通過同義突變將該基因的5』端30bp內的GC含 量從60%降低到30%時即實現了高效表達，表明5』端序列GC含量過高是sdsFV ^基因 低表達的關鍵原因，至於是否為所有VH-linker-\類構建的低表達原因尚需進一步研究。大腸桿菌高效表達產物一般為不溶的包涵體蛋白，包涵體蛋白的復性是關鍵工藝 之一。sdsFV。AP_2基因表達產物也為包涵體蛋白，當我們對該產物變性後採用常規的稀釋復 性法進行復性操作時發現絕大部分目的蛋白被聚沉了，這可能與在VirIinker-VJ旬引入了 二硫鍵有關。當採用環糊精分子伴侶系統進行復性時即解決了沉澱問題，所獲復性產 物的與母本抗體的親和力基本一致，表明SdsFVfflp蛋白得到了較好的復性。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明以抗氯黴素抗體可變區基因為模板，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可 變區分別加入一個半胱氨酸定點突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈 抗體基因，將該基因轉導入大腸桿菌表達系統中，表達出二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。 由於引入了一對二硫鍵的構建形式，使抗體的穩定性提高，從而可以取代單克隆抗體用於 氯黴素殘留的檢測。同時，通過降低5』端序列中的GC含量對目的基因進行優化，解決了天 然V基因組裝產物在大腸桿菌系統中的低水平表達問題。


圖1為抗氯黴素抗體V區半胱氨酸突變位點；圖2 為重疊延伸 PCR 組裝 SdSFvc^1，其中，1 為 ScFvcap ； 2 為 VH_CAP_Linker ； 3 為 Linker-VL_CAP ；M 為 IOObp DNA ladder ；圖3為^評^^「基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達；其中，1為未誘導的含有 pET2Ia-ScFvc^1的宿主細胞；2為誘導的含有pETZla-scFv^^的宿主細胞；3為未誘導 的含有pETSZa-scFv^H的宿主細胞；4為誘導的含有pETSZa-scFv。^的宿主細胞；M為 marker ；圖4為8(1評\ _2基因在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，其中，1為宿主細胞；2為未 誘導的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主細胞；3為未誘導的含有pETSZa-scFv。^的宿主細胞； 4為誘導的含有pET21a-SCFVeAP_2的宿主細胞；5為誘導的含有pETSZa-scFv^H的宿主細 胞；M 為 marker ；圖5為sdsFV。AP_2基因表達產物分離純化，其中，1為總蛋白；2為超聲破碎宿主細胞 得到的上清；3為超聲破碎宿主細胞得到的沉澱；4為純化的包被蛋白；5為復性的SCFvcap。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體的構建1.材料與方法1. 1 材料抗CAP Mab 粗製品、含抗 CAP 的 VH(FJ477893)和 VL(FJ477894)基因的質粒 1 18-11-￥11與？1 18-11-\、氯黴素-卵清蛋白偶聯物(CAP-OVA)、大腸桿菌DH5 α等均由本 室製備或保存。大腸桿菌BL21 (DE3)、表達載體pET21a和pET32a均為N0VAGEN公司產品， PMD18-T、Taq 酶、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、DNA lader, TaKaRa MutanBEST Kit 等均 購自大連寶生物工程有限公司，DNA回收試劑盒購自百泰克生物技術有限公司，HisTrap FF 柱(Iml)、HiTrap Protein G 柱(Iml)、HRP-anti_His6 tag 禾口 HRP-goat-anti-mouse IgG 均為GE公司產品，BCA試劑盒為廣州美津生物技術有限公司產品。1.2引物設計與合成V基因定點突變用引物VH-ml的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示，VH_m2的核苷 酸序列如SEQ ID NO 5所示，Vfml的核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示，VL_m2的核苷酸序 列如SEQ ID NO 7所示。sdsFvCAP組裝用引物A(VH5，)的核苷酸序列如SEQ ID NO 8所 示，B(VH3，-linker)的核苷酸序列如SEQ ID NO :9所示，C(Linker_VL5，)的核苷酸序列如 SEQ ID NO 10所示，D(Vl3')的核苷酸序列如SEQ ID NO 11所示，E的核苷酸序列如SEQ ID N0:12所示。所有引物均由上海英俊生物技術有限公司合成。1.3V基因定點突變採用TaKaRa MutanBEST Kit按廠家說明進行。Vh突變模板為pMD 18_T_VH，引物 為 VH-ml 和 VH-m2 ;VL 突變模板為 PMD18-T_Vl，引物為 Vfml 和 Vl-iii2。1. 4sdsFVCAP基因組裝與克隆
以上述突變Vh和VJ3CR產物為模板，以引物A與B擴增VH-linker，以引物C與D 擴增 linker-VL。PCR 反應參數為 94°C 5min，94°C 30s, 55 °C 30s, 72°C 30s，共 25 個循環， 72°C 7min。擴增產物以(ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離後用DNA回收試劑盒按照廠家說明 書進行目的片段回收。回收片段經適當稀釋後進行下述二步擴增反應第一步，Va-Iinker 和Iinker-VL進行重疊延伸，反應條件為94°C 5min，94°C lmin，72°C 1.5min，共5個循環； 第二步，以引物A和D或E和D配對進行常規PCR擴增，反應條件為94°C 5min,94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1. 5min，共 25 個循環，72°C 7min。A-D 引物對擴增產物以 NdeI-HindIII 雙 酶切後按常規方法[8]克隆於表達載體pET21a的相同位點，得表達載體pET21a-SdSFVfflP ； E-D引物對擴增產物以Nc0I-HindIII雙酶切後克隆於pET32a的相同位點，得融合表達載 體pET32a-SdSFV。AP。所有表達載體的構建均以大腸桿菌DH5 α為宿主菌，所獲表達載體委 託深圳華大基因有限公司進行目的基因表達盒序列分析。經序列分析確證後的表達載體質 粒轉化表達宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，得sdsFveAP工程菌。1. 5sdsFVCAP基因表達誘導SCFvcap工程菌接種於含50 μ g/ml氨苄青黴素的LB培養基，37°C振蕩培養過夜，按 1% (V/V)比例轉接新鮮LB培養基，繼續培養2. 5h，加入IPTG至終濃度lmmol/L進行表達 誘導,共誘導4h。6000r/min離心5min收集菌體。1. 6sdsFVCAP包涵體蛋白分離純化經表達誘導所獲菌體按10% (W/V)懸浮於含500mmol/L NaCl的20mmol/L磷 酸鈉緩衝液(PH7. 5)，於冰浴中以300瓦輸出功率間歇式超聲破碎lOmin，12000r/min離 心IOmin0所獲沉澱分別用含2% (V/V)TritonX100、500mmol/LNaCl和不同濃度尿素的 20mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH8. 0)洗滌，最後所獲離心沉澱按溼重的1 % (W/V)懸浮 於變性緩衝液(含8mol/L尿素、1 % (V/V) β -巰基乙醇和500mmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl 緩衝液，pH8. 0)，37°C水浴 3h, 12000r/min 離心 lOmin，所獲上清以 HisTrap FF 柱 參照廠家說明進一步純化，其中平衡緩衝液為含20mmol/L咪唑的變性緩衝液，洗脫緩衝液 為含300mmol/L咪唑的變性緩衝液。1. 7scFVCAP包涵體蛋白的復性變性的目的蛋白參照β-環糊精人工伴侶系統[9]以含18mmol/Li3-環糊精的 20mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH8. 0)進行稀釋復性，稀釋後的蛋白質溶液中SDS的終濃度控 制為2mmol/L，β -環糊精的終濃度為8mmol/L。稀釋液在室溫下磁力攪拌過夜。以0. 45 μ m 纖維素膜過濾法去除可見沉澱，以S印hadex G25(GE公司產品)柱按30% (V/V)上樣體積 將上述復性產物的緩衝液置換為20mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH7. 5)。1. 8蛋白質SDS-PAGE與凝膠掃描分析參照常規方法進行各種樣品的SDS-PAGE。菌體培養物或純化過程中的蛋白樣品以 2倍上樣緩衝液煮沸5min，還原電泳上樣緩衝液不含β-巰基乙醇。電泳所獲凝膠以「天能 牌」凝膠密度掃描儀按廠家說明進行拍照和表達水平或蛋白質純度分析。1.9蛋白質濃度測定採用BCA試劑盒參照廠家說明進行，以小牛血清白蛋白為標準品。1. 10抗體親和力常數測定參照Batty等非競爭性ELISA法[1°]進行，以sdsFVfflP樣品和母本單抗4D10平
6行分析，酶標二抗分別為HRP-anti-His6 tag和HRP-goat-anti-mouse IgG。為使母本單 抗與待測SdsFv。AP樣品純度基本一致，將抗CAP Mab粗製品(經辛酸硫酸銨法製備)以 HiTrap Protein G柱按照廠家說明書進行純化，其中柱平衡緩衝液為20mmol/L磷酸鈉緩衝 液(PH7. 4)，洗脫緩衝液為lOOmmol/L的甘氨酸-HCl (pH2. 7)，目的峰樣收集於預置中和緩 衝液lmol/L Tris-HCl (ρΗ9· 0)。親和力常數測定時以1 μ g/ml、2 μ g/ml和4 μ g/ml等三個 不同濃度的CAP-OVA(抗原)包被酶標板，供試抗體經濃度測定後倍比稀釋。以抗體的摩爾 濃度(mol/L)為橫坐標、以OD45tl值為縱坐標作圖，找出其ODmax值，並求出OD450 = 1/2 ODfflax 時相對應的抗體濃度[Ab] 1/2，按公式Ka= (n-l)/[2(n[Ab]1/2' -[Ab]1/2)]分別求出二種抗 原濃度之間的Ka值，其中η為抗原高低濃度之比，[Ab]1/2'為較低濃度抗原對應的[Ab]1/2。 所得三個Ka值的算術平均值即為抗體的親和常數，單位為摩爾濃度的倒數，即L/mol。2結果與分析2. IV基因突變與組裝參照文獻報導的半胱氨酸引入位點分別對抗氯黴素抗體Vh和\基因進行定點突 變，突變V基因經測序確證後採用重疊延伸PCR法組裝成VH-linker-\型sdsFVeAP，其中的 linker序列為(Gly4Ser)3。突變的胺基酸殘基位點如圖1所示，Vh的突變位點為第2框架 區的第49位胺基酸，與Kabat資料庫Vh的保守序列第44位胺基酸殘基相對應；\的突變位 點為第4框架區的第120位胺基酸，與\的保守序列第100位胺基酸殘基相對應。SdsFVfflp 基因組裝結果如圖2所示，經重疊延伸PCR所得sdsFVCAP基因片段與理論大小一致，大小約 為790bp，經序列分析與設計序列一致，定名為sdsFV。^ (GenBank ID ⑶258050)。專利中， 單純基因序列的表示有一個專門的序列表格式，不可以放到說明書附圖中。2. 2sdsFVCAP-l基因克隆與表達上述sdsFVcn基因組裝產物克隆於表達載體pET21a和pET32a，以便在宿主菌大 腸桿菌BL21(DE3)中進行獨立表達或融合表達。表達誘導結果如圖3所示，結果表明，在強 啟動子T7驅動下，SCIsFVqum基因不能有效單獨表達，但當其5』端融合於硫氧環蛋白(Trx) 基因之後時即可高效表達，表達產物大小約為45KD，與理論值一致。通過PCR引物對SCIsFVqum基因5』端進行同義突變，以便優化目的基因。將 30bp序列內所有密碼子中的第3位鹼基G或C全部置換成A或T，得到同義突變型基因 sdsFVCAP_2 (GenBank ID :GU258050)。所獲 sdsFVCAP_2 基因 5，端 30bp 序列內的 GC 含量由 60% 降至36 %，克隆於表達載體pET21a後獨立表達時即可高效表達(圖4)，表達產物大小約為 28KD，與理論值一致，表達水平與融合表達相似，達到30%以上。2. 3sdsFVCAP-2基因表達產物分離純化與分析sdsFVCAP_2基因表達產物分離純化結果如圖5所示。結果表明，sdsFVeAP_2基因表 達產物主要以包涵體蛋白存在，因為目的大小的蛋白主要出現在菌體超聲破碎沉澱中。包 涵體經含2mol/L尿素的緩衝溶液簡單洗滌後純度達到90%以上，但所獲包涵體蛋白經變 性後以HisTrap預裝柱進行基於His標籤的親和層析純化並未見純度顯著提高。包涵體蛋 白可完全被8mol/L尿素溶液裂解，變性蛋白採用常規的稀釋復性法復性時絕大部分目的 蛋白被聚沉，但採用環糊精分子伴侶系統復性未見顯著沉澱。所獲復性溶液與純度相 近(90%)的母本抗體所進行的平行分析結果表明，SdSFvau^f氯黴素的親和力與母本抗體 4D10的相似，二者的親和力常數分別為7. OX 10_9L/mOl和4. 5X 10_9L/mOl。
權利要求
一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體，其特徵在於其胺基酸序列如SEQID NO1所示。
2.一種編碼權利要求1所述二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體的cDNA，其特徵在於其核 苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權利要求1所述二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體的構建方法，其特徵在於是以抗氯 黴素抗體可變區基因為模板，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區分別加入一個半胱 氨酸定點突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體基因，再通過引物 突變PCR在目的基因的5』端30bp序列內引入同義突變，以降低該序列內的GC含量，將該 基因轉導入大腸桿菌表達系統中，表達的蛋白即為二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。
4.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中包含權利要求1所述二硫鍵穩定的抗氯黴素 單鏈抗體。
5.權利要求1所述二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體在殘留氯黴素的檢測中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體及其構建方法和應用。本發明抗氯黴素單鏈抗體的胺基酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明以抗氯黴素抗體可變區基因為模板，通過引物突變PCR在輕鏈和重鏈的可變區分別加入一個半胱氨酸定點突變，以重疊延伸PCR組裝成二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體基因，通過引物突變PCR在基因的5』端30bp序列內引入同義突變後，將基因轉導入大腸桿菌表達系統中，表達的蛋白即為二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體。本發明抗氯黴素單鏈抗體通過模擬天然抗體的結構，在單鏈抗體的基礎上引入一對二硫鍵的構建形式，可以提高抗體的穩定性。本發明二硫鍵穩定的抗氯黴素單鏈抗體可以取代單克隆抗體用於氯黴素殘留檢測。
文檔編號C12N15/70GK101935350SQ20101023695
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者唐偉, 李黃金, 柴偉佳, 趙林, 陳偉 申請人:廣東藥學院