抗衰老短肽及其製備方法

2023-08-13 01:56:01

抗衰老短肽及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域重組蛋白的製備方法，具體是一種新型抗衰老短肽及製備方法。本發明公開了一種抗衰老短肽命名為G13，由13個胺基酸所組成；同時公開了一種利用大腸桿菌發酵的工藝，可以實現工業化大規模的製備重組G13（簡稱rG13）。本發明利用多種生物學手段檢測，證實rG13具有比同類產品更高的生物學活性，能夠刺激細胞大量分泌膠原蛋白，具有抗衰老的能力。本發明所述的抗衰老短肽生物活性顯著，生產工藝簡單，成本低廉，能夠讓抗衰老皮膚營養產品走近百姓的日常生活，具有廣闊的市場應用前景。
【專利說明】抗衰老短肽及其製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域重組蛋白的設計和製備方法，具體是一種新型抗衰老短肽及其製備方法。

【背景技術】
[0002]人和高等動物的皮膚由表皮、真皮、皮下組織組成。表皮沒有血管，細胞的能量和營養必須由真皮微循環提供。真皮層是皮膚的生命源泉，是一層緻密、堅韌且有彈性的組織，主要由纖維成分(膠原蛋白纖維、彈力纖維和網狀纖維)、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等組成。玻尿酸是一種透明的膠狀物質，吸水能力可達500-1000倍，是公認的最佳保溼產品。年輕的皮膚，玻尿酸含量高，皮膚光滑、彈性、水嫩、膨脹飽滿；皮膚老化時，真皮層變薄，減少了真皮層與表皮層之間物質交換的界面，細胞的正常代謝和有絲分裂作用受到阻礙，皮膚萎縮產生皺紋，因此抗衰老要從補充真皮層營養物質(如膠原蛋白和玻尿酸等)開始。膠原蛋白可以彌補基底膜功能，幫助表皮層與真皮層的結合，能夠將水分、養分保送至真皮層。因此，如果能夠補充人體皮膚中的膠原蛋白，將能夠有效地對抗皮膚衰老的問題。
[0003]棕櫚酸五胜肽-3 (Pentapeptide-3)別名五環短肽或五勝月肽，它是由法國著名化妝品公司Sederma公司研發出品的一種人工合成的短肽。它能夠有效促進透明質酸、膠原蛋白和彈力纖維增生，減少肌膚細紋，提高肌膚的含水量，增加皮膚厚度，增強肌膚緊緻感和光澤度。它是膠原蛋白I (Collagen I)碎片與棕櫚酸(Palmitic Acid)結合後得到的對皮膚更具親和性和親水、鎖水性的物質。研究表明，若將棕櫚酸五胜肽-3加入纖維組織母細胞培養皿中，能加強膠原蛋白1、VII (纖維膠原)和纖維黏連蛋白的合成能力，還能促進表皮內的纖維母細胞產生膠原蛋白和玻尿酸等重要成分。可見，棕櫚酸五胜肽-3對減輕皮膚老化有重要作用。試管內測試表明，棕櫚酸五胜肽-3能迅速激活膠原蛋白IV合成能力達到100%?327%，激活玻尿酸的合成能力達到267%。如今，該短肽已經廣泛應用於許多知名品牌的化妝品行列。
[0004]目前，已經有很多國家的知名化妝品品牌的許多系列添加了棕櫚酸五肽-3作為抗衰老的營養成分。我國上海和深圳的一些生物科技公司也有該產品銷售。但是，目前棕櫚酸五胜肽-3的製備方法還都是局限於化學合成，其高額的成本限制了這類產品的廣泛使用。因此，為了能使這類短肽類的皮膚營養產品不斷走近百姓的日常生活，使得普通人擁有安全、穩定、實用的高品質化妝品，有必要設計研發更加高效的抗衰老短肽，並探索大規模製備抗衰老短肽的技術。


【發明內容】

[0005]本發明為了提高現有抗衰老短肽一棕櫚酸五肽-3的生物學活性，同時降低這類美容肽的生產成本，提供了一種新型抗衰老短肽的設計方案，並提供其大規模的製備方法。
[0006]本發明是採用如下技術方案實現的:
一種抗衰老短肽，由13個胺基酸所組成，其胺基酸序列為:Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用單字符號表示為 GPKTTKSLEVLFQ。
[0007]上述G13短肽可以通過多種生產工藝進行製備:
1、利用大腸桿菌發酵的工藝，重組表達製備的G13，簡稱rG13，生產工藝簡單，成本低廉，易於推廣。
[0008]2、利用化學合成的工藝合成G13，簡稱sG13，成本較高，但是具有與rG13類似的生物學功能。
[0009]本發明提供上述的抗衰老短肽的製備方法，包括如下步驟:
(1)、大腸桿菌基因工程菌的構建
1.1、設計 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser (用單字符號表示為LEVLFQGPKTTKS)胺基酸序列為基本重複單元L13構建蛋白序列pL13_n，其中η為1-100的任意數值；
1.2、合成如上所示蛋白序列相對應的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ；
1.3、將核苷酸序列nL13克隆進入表達載體，然後將表達載體轉入大腸桿菌表達菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌；
(2)大腸桿菌基因工程菌的發酵培養
2.1、挑取優選後的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至於LB培養基中35?38°C培養過夜；
2.2、將菌液接种放大培養，35?38°C培養2.5?3小時，加入IPTG進行誘導，15?18°C繼續培養18?22小時，此時表達出的蛋白為GST-pL13-n，離心收集菌體；
(3)重組抗衰老短肽rG13的純化
3.1、用Tris緩衝液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；
3.2、利用穀胱甘肽親和柱從上清液中純化得到抗衰老短肽rG13。
[0010]本發明所述的rG13短肽檢測活性如下:
1、抗衰老短肽rG13理論分子量為1447.65Da,無法通過常規的SDS-PAGE進行檢測，需要利用質譜方法進行鑑定。用基質輔助雷射解析電離-飛行時間質譜儀MALD1-T0FAXIMA-CFR Plus (KRATOS Analytical, Shimadzu corporat1n, Japan)在線性模式下進行分析。分析結果如圖2所示。
[0011]2、細胞分泌膠原蛋白的過程中，TGF-β會大量表達。因此，TGF-β表達量的增高指示著細胞合成膠原蛋白的增強。以大鼠腱細胞為模型，加入不同濃度的短肽(0.2μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小時之後收集大鼠腱細胞上清，直接轉移到TGF-β的檢測試劑盒中進行檢測。分析結果如圖3所示。
[0012]3、利用標準的MTT法檢測抗衰老短肽rG13的細胞毒性。參考標準mtt法的操作方法，加入不同濃度的短肽(0.2 μ g/ml, 2 μ g/ml, 20 μ g/ml, 200 μ g/ml), 24小時之後檢測細胞活性。分析結果如圖4所示。
[0013]4、免疫組化方法檢測抗衰老短肽rG13刺激細胞合成膠原蛋白的效果。以大鼠腱細胞為模型，加入短肽(濃度為20 μ g/ml) 24小時之後，4%多聚甲醛固定，3% BSA封閉，然後用兔抗鼠膠原蛋白的抗體(Novotec, Saint Martin La Garenne, France)進行標記I小時。用螢光顯色，然後鏡下觀察即可。分析結果如圖5所示。
[0014]與現有技術相比，本發明製備的抗衰老短肽rG13具有以下特點:
1、本發明所公開的新型抗衰老短肽G13 (GPKTTKSLEVLFQ)，為長期篩選優化的序列，比市場上同類產品效果顯著提高。
[0015]2、本發明所公開的新型抗衰老短肽rG13的製備方法，採用大腸桿菌表達系統，適於大規模放大，生產成本非常低，而且基因中的序列針對大腸桿菌表達系統進行了密碼子優化，進一步提聞了廣量。
[0016]3、本發明產品經過多項活性檢測，具有目前報導過的最優化的抗衰老效果，可以廣泛應用於生物醫藥和化妝品行業。
[0017]本發明利用多種生物學手段檢測，證實抗衰老短肽rG13具有比同類產品更高的生物學活性，能夠刺激細胞大量分泌膠原蛋白，具有抗衰老的能力。
[0018]本發明所述的抗衰老短肽生物活性顯著,生產工藝簡單，成本低廉，能夠讓抗衰老皮膚營養產品走近百姓的日常生活，具有廣闊的市場應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1表示表達載體pGEX-6p-nL13_9的質粒構建圖譜。
[0020]圖2表示提純產物中抗衰老短肽rG13的質譜鑑定結果。rG13的理論分子量為1447.65Da,與質譜檢測結果完全吻合。
[0021]圖3表示抗衰老短肽rG13刺激TGF-β表達的能力的檢測結果。與空白對照組、棕櫚酸五肽-3 (K5)、合成的G13短肽(sG13)相比，重組表達製備的rG13具有更強的生物學活性。
[0022]圖4表示MTT法檢測抗衰老短肽rG13的細胞毒性。結果顯示，棕櫚酸五肽_3(K5)、本發明的基因工程表達的重組短肽rG13、化學合成的G13短肽(sG13)在所示濃度範圍內，均未發現顯著的細胞毒性。
[0023]圖5表示免疫組化方法檢測抗衰老短肽rG13刺激細胞合成膠原蛋白的效果。結果顯示，rG13可顯著刺激大鼠腱細胞產生膠原蛋白，其活性好於棕櫚酸五肽-3 (K5)及化學合成的G13短肽(sG13)。

【具體實施方式】
[0024]下面對本發明的具體實施例進行詳細說明。
[0025]一種抗衰老短肽的製備方法，包括如下步驟:
(I)、大腸桿菌基因工程菌的構建
1.1、為了酶切之後獲得抗衰老短肽rG13，特別設計胺基酸序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 為基本重複單兀 L13,構建蛋白序列 pL13_n。
[0026]這種單元的重複數目與最終短肽的收穫量成正比關係。通常可以採用1-100個重組單元進行構建，這樣構建的目的蛋白序列(LEVLFQGPKTTKS) n簡寫為pL13_n，其中η為1-100的任意數值；實驗證明當η=9時,抗衰老短肽rG13的得率較高。
[0027]本實施例以9個重複單元為例進行說明，9個重複單元的蛋白序列pL13-9為(LEVLFQGPKTTKS)9:
LEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSLEVLFQGPKTTKSo
[0028]1.2、合成如上所示蛋白序列相對應的核苷酸序列nL13，並按照大腸桿菌有利的密碼子進行優化，獲得核苷酸序列nL13-9如SEQ ID N0.1所示:
ctggaggtgctgttccagggcccgaaaaccacaaagagcctggaggtgctgttccaaggtccgaagaccacc
aagagcctggaggtgctgttccaaggcccgaaaaccaccaaaagcctggaggtgctgttccaaggcccgaagaccac
caagagcctggaagtgctgtttcagggtccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccagggccctaaaacca
ccaagagcctggaggttctgtttcagggcccgaaaaccaccaaaagcctggaagtgctgttccaaggcccgaagacc
accaagagcctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagco
[0029]1.3、將核苷酸序列nL13克隆進入表達載體,然後將表達載體轉入大腸桿菌表達菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌；具體為:
設計引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2:CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC,
將引物稀釋成50ρπιΟ1/μ 1，引物和核苷酸序列進行PCR步驟，瓊脂糖凝膠電泳檢測nL13-9條帶位於350bp左右，回收目的基因。用3m I和通ο I將基因(上述核苷酸序列)酶切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p-l載體，加入T4 DNA連接酶，4°C連接12小時，轉化大腸桿菌DH5ci，用於質粒的擴增；用氨苄青黴素-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的鹼裂解法或者煮沸法提取質粒，利用酶切和PCR的方法鑑定正確，然後核苷酸序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，成功構建pGEX-6p-nL13-9表達載體^fpGEX-6p-nL13-9表達載體，轉化BL21菌(篩選得到大腸桿菌基因工程菌)，用於表達蛋白。
[0030](2)大腸桿菌基因工程菌的發酵培養
2.1、挑取優選後的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至於5ml的LB培養基中35?38°C培養過夜，優選溫度為37°C。
[0031]2.2、將菌液按照1:100接种放大培養，35?38°C培養2.5?3小時，加入IPTG進行誘導，15?18°C繼續培養18?22小時，優選為37°C培養3小時，加入0.5mM IPTG進行誘導，16°C繼續培養20小時；此時表達出的蛋白為GST-pL13-9，離心收集菌體。
[0032](3)重組抗衰老短肽rG13的純化
3.1、用PBS緩衝液洗滌混合後的菌體沉澱，用Tris緩衝液20_40ml體積重懸約500ml菌液沉澱，用溶菌酶配合Triton X-100幫助裂解細菌，在冰水混合物環境下超聲破菌(2s超聲，5s間歇,全長45min,保護溫度44°C ), 12000rpm/min離心20min,收集上清液,此時溶液中即含有大量的GST-pL13-9重組蛋白。
[0033]3.2、用PBS緩衝液清洗穀胱甘肽親和柱(Glutath1ne Sepharose beads),然後將柱材和破菌上清混合共育，室溫或冰上輕搖30min，然後上柱，用含有IM NaCl的PBS溶液洗滌雜蛋白，柱上就剩下了純的GST-pL13-9重組蛋白。
[0034]在柱上加入適量的Presciss1n Protease (簡稱PPase)蛋白酶,於室溫或冰上輕搖2小時，即可將抗衰老短肽rG13從穀胱甘肽親和柱上釋放出來，用PBS溶液洗脫抗衰老短肽rG13，所得產物透析過夜，凍幹為乾粉待用。
[0035]上述方法製備的抗衰老短肽rG13由13個胺基酸所組成，其胺基酸序列為=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr- Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln,用單字符號表不為GPKTTKSLEVLFQ。利用大腸桿菌發酵的工藝，重組表達製備的rG13，生產工藝簡單，成本低廉，易於推廣。該rG13被發現具有顯著的促進細胞合成膠原蛋白的能力，與現有同類短肽相比，效果更強。
【權利要求】
1.一種抗衰老短肽，其胺基酸序列為=Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln0
2.一種製備權利要求1所述的抗衰老短肽的製備方法，其特徵在於:包括如下步驟: (1)、大腸桿菌基因工程菌的構建 1.1、設計 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser 胺基酸序列為基本重複單元L13構建蛋白序列pL13-n，其中η為1-100的任意數值； 1.2、合成如上所示蛋白序列相對應的核苷酸序列nL13, (ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc)n ； 1.3、將核苷酸序列nL13克隆進入表達載體，然後將表達載體轉入大腸桿菌表達菌株中，篩選得到大腸桿菌基因工程菌； (2)大腸桿菌基因工程菌的發酵培養 2.1、挑取優選後的大腸桿菌基因工程菌單菌落，至於LB培養基中35?38°C培養過夜； 2.2、將菌液接种放大培養，35?38°C培養2.5?3小時，加入IPTG進行誘導，15?18°C繼續培養18?22小時，此時表達出的蛋白為GST-pL13-n，離心收集菌體； (3)重組抗衰老短肽rG13的純化 3.1、用Tris緩衝液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液； 3.2、利用穀胱甘肽親和柱從上清液中純化得到抗衰老短肽rG13。
3.根據權利要求2所述的抗衰老短肽的製備方法，其特徵在於:步驟1.1和1.2中，n=9。
4.根據權利要求3所述的抗衰老短肽的製備方法，其特徵在於:步驟1.3具體為，設計引物Pl和P2，
Pl:CGACGGCCAGTGAATTCAGA,
P2: CAGCTATGACCATGCTCGAGTCC, 將引物和核苷酸序列進行PCR步驟，回收目的基因，用I和通ο I將核苷酸序列酶切成粘性末端，同樣處理pGEX-6p-l載體，加入T4 DNA連接酶，4°C連接12小時，轉化大腸桿菌DH5 α ;用氨苄青黴素-LB平板篩選挑出白斑克隆，利用分子克隆的鹼裂解法或者煮沸法提取質粒，利用酶切和PCR的方法鑑定正確，然後核苷酸序列分析含有正確的基因序列閱讀框架，成功構建pGEX-6p-nL13-9表達載體；將pGEX-6p-nL13_9表達載體，轉化BL21菌。
5.根據權利要求4所述的抗衰老短肽的製備方法，其特徵在於:步驟2.2具體為，將菌液按照1: 100接种放大培養，37°C培養3小時，加入0.5mM IPTG進行誘導，16°C繼續培養20小時,離心收集菌體。
6.根據權利要求5所述的抗衰老短肽的製備方法，其特徵在於:步驟3.1具體為，用PBS緩衝液洗滌混合後的菌體沉澱，用Tris緩衝液重懸菌液沉澱，用溶菌酶配合TritonX-100幫助裂解細菌，在冰水混合物環境下超聲破菌，12000rpm/min離心20min，收集上清液，此時溶液中即含有大量的GST-pL13-9重組蛋白； 步驟3.2具體為，用PBS緩衝液清洗穀胱甘肽親和柱，然後將柱材和破菌上清混合共育，室溫或冰上輕搖30min,然後上柱,用含有IM NaCl的PBS溶液洗漆雜蛋白，柱上就剩下了純的GST-pL13_9重組蛋白；在柱上加入Presciss1n Protease蛋白酶,於室溫或冰上輕 搖2小時，即可將抗衰老短肽rG13從穀胱甘肽親和柱上釋放出來。
【文檔編號】A61P17/16GK104402975SQ201410755706
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月11日 優先權日:2014年12月11日
【發明者】楊霞 申請人:太原錦波生物醫藥科技有限公司