短瓣金蓮花總黃酮和幾種高純度藥用物質的製備工藝的製作方法

2023-08-13 01:34:31

專利名稱：短瓣金蓮花總黃酮和幾種高純度藥用物質的製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及中藥有效成分的分離純化方法，即提供一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的製備工藝。
背景技術：
金蓮花又名旱金蓮，是毛茛科植物金蓮花(Trollius ledebouri Reichb)的乾燥花，以東北、華北和內蒙古為主產。金蓮花始見於《本草綱目拾遺》，對革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌、甲型鏈球菌、卡他氏茵、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌等有明顯的抑制作用。臨床主要用於治療急性闌尾炎、細菌性痢疾、上呼吸道感染、泌尿系感染等。其主要的化學成分為生物鹼、黃酮、有機酸、揮髮油等，其中黃酮類化合物為其主要活性成分，如葒草苷(orientin)、牡荊苷(vitexin)和槲皮素-新橙皮糖苷(quercetin-3-O-neohesperidoside)等[辛春蘭，潘海峰.金蓮花的研究進展.承德醫院學報，2003，20(4)348；黃文哲，王磊，等.短瓣金蓮花化學成分的研究.中草藥，2000，31(10)731；康少文，於永芳，等.金蓮花化學成分的研究.中草藥，1984，15(6)247]。它們的結構式如下 葒草苷
牡荊苷 槲皮素-新橙皮糖苷用大孔吸附樹脂純化金蓮花總黃酮亦有報導，但所得總黃酮含量較低(低於40％)，同時未見有製備色譜技術用於金蓮花中高純度單體化合物分離製備的報導，也未見有相關專利。
目前，國內外多為採用柱色譜法和重結晶等傳統的分離製備方法分離植物中的有效單體，費時費力、汙染環境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45786；W.M.Yan，Acta Botanica Sinica，1979，2054；J.J Liu，G.L.Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9246]，而且所用固定相對樣品有不可逆性吸附作用等不足之處。
因此，人們對採用效果更好的分離技術來解決上述問題存在需求。本發明的目的是提供一種從短瓣金蓮花中提取純度高於60％的總黃酮和幾種高純度藥用單體(葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷)的製備工藝。
高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一種較新的液液分配色譜技術，它不用任何固體支撐體或載體而克服了傳統分離方法對樣品的不可逆性吸附作用，因而樣品回收率高，同時還具有應用範圍廣、儀器操作簡單、分離量大等優點，因此被廣泛應用於天然產物的分離製備當中。我們採用高速逆流色譜法製備得到純度高於98％的葒草苷、牡荊苷與純度為85％的槲皮素-新橙皮糖苷，並通過製備液相色譜進一步純化得到了純度高於98％的槲皮素-新橙皮糖苷。

發明內容
為了解決上述技術問題，本發明的技術方案如下一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，具體包括藥材提取、總黃酮製備及單體化合物的分離純化三道工序，其特徵在於藥材提取工序(1)中，將短瓣金蓮花用50％～70％藥用乙醇回流提取，減壓回收乙醇後獲取提取液，總黃酮製備工序(2)中，提取液過大孔吸附樹脂，用水和25％～35％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮乾燥後可得總黃酮，單體化合物分離純化工序(3)中，採用高速逆流色譜法對所得總黃酮進行分離純化，它包括配製構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使柱子轉動，再將流動相泵入柱內，由進樣閥進入製備好的粗提物樣品，根據檢測器譜圖接收目標成分「I」、「II」、「III」，並應用製備液相色譜再次分離純化流份「I」得到流份「IV」。
工序(1)藥材提取取乾燥金蓮花葯材用50％～70％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，減壓濃縮(60℃)至無醇味，為濃縮後的提取液。
工序(2)總黃酮製備取濃縮後的提取液加適量水混懸後，過大孔吸附樹脂，用水和25％～35％乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮乾燥(60℃)後可得純度高於60％的金蓮花總黃酮。
工序(3)單體化合物分離純化應用高速逆流色譜對總黃酮進行分離純化，它包括配製構成固定相、流動相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使柱子轉動，再將流動相泵入柱內，所用溶劑體系由乙酸乙酯、正丁醇、水組成，用量比為2∶1∶3，由進樣閥進樣，根據檢測譜圖接收目標成分「I」、「II」、「III」。此法可製備含有85％槲皮素-新橙皮糖苷的流份「I」與純度高於98％的流份「II」(葒草苷)、流份「III」(牡荊苷)。
製備液相分離純化應用製備液相色譜對經高速逆流色譜分離純化所得流份「I」進行進一步純化，可得純度高於98％的槲皮素-新橙皮糖苷，即流份「IV」。
分離物的純度檢測與結構鑑定，採用高效液相色譜法對分得組分進行純度檢測(峰面積歸一化法)，揮幹溶劑後進行MS、1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認。
本發明是採用高速逆流色譜和製備液相色譜結合對中藥粗提物進行分離純化，簡便、快速，同時也避免了樣品損失。克服了傳統製備方法操作繁瑣、分離周期長等缺點，並具有製備量大、分離效率高、產品純度好、簡便易行等優點，易於推廣使用。


圖1為金蓮花總黃酮製備流程2為金蓮花總黃酮半製備型高速逆流色譜(HSCCC)的色譜3為槲皮素-新橙皮糖苷製備液相色譜的色譜4-1為金蓮花總黃酮高效液相色譜(HPLC)的色譜4-2為高速逆流分離所得流份「II」(葒草苷)高效液相色譜(HPLC)的色譜4-3為高速逆流分離所得流份「III」(牡荊苷)高效液相色譜(HPLC)的色譜4-4為高速逆流份離所得流份「I」(含槲皮素-新橙皮糖苷的流份)高效液相色譜(HPLC)的色譜4-5為製備液相色譜流份「IV」(槲皮素-新橙皮糖苷)高效液相色譜(HPLC)的色譜圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例及附圖對本發明進行說明實施例1如圖1金蓮花總黃酮製備流程圖所示1.藥材提取稱取乾燥金蓮花葯材300g，用10倍量60％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，減壓濃縮(60℃)至無醇味，得濃縮後的提取液。
2.總黃酮製備取濃縮後的提取液，加水混懸後(總體積為900ml)。加入到裝有500g經預處理過的1300大孔吸附樹脂的層析柱上，上樣完畢後吸附1.0小時。用1200ml水洗脫(棄去)。再用2000ml 30％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮後，真空乾燥(60℃)，得總黃酮粉末16.7g，提取得率為5.57％，總黃酮純度為61.6％。
3.單體化合物的分離純化3.1應用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司產品)分離純化總黃酮。溶劑體系及用量體積比為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，上相為固定相，下相為流動相，逆流色譜柱體積為300ml，固定相保留率47％，流速2.0ml/min，轉速800rpm，檢測波長254nm，取總黃酮粉末500mg溶解於15ml下相中，進樣後在此情況下記錄的色譜圖見圖2。
具體的操作步驟是按上述溶劑體積比配製溶劑體系，在分液漏鬥中充分振搖後靜止分層，分取上下相，上相為固定相，下相為流動相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使主機轉動，再泵入流動相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收目標成分「I」、「II」、「III」。
分離物的純度檢測與結構鑑定，採用高效液相色譜法對分得組分進行純度檢測(峰面積歸一化法)，揮幹溶劑後進行MS、1HNMR和13CNMR分析，根據所得數據進行結構確認。
經高效液相分析表明流份「II」、「III」為單一色譜峰，峰純度分別為99.6％、98.1％，流份「I」中峰純度為85.1％。經結構鑑定表明流份「II」為葒草苷，「III」為牡荊苷。
3.2應用製備液相色譜分離純化流份「I」。色譜條件為0.1％醋酸水溶液∶四氫呋喃∶異丙醇∶乙腈(460∶30∶20∶10)；流速3.0ml/min；色譜柱YWG C18(10.0×200mm i.d.10μm)，柱溫30℃，檢測波長254nm。根據檢測器譜圖接收目標成分，即流份「IV」，對該流份進行高效液相分析表明其為單一色譜峰，峰純度為98.3％。製備液相色譜圖見圖3。經結構鑑定表明流份「IV」為槲皮素-新橙皮糖苷。
HPLC分析條件色譜柱Hypersil C18(4.0×200mm i.d.5μm)；流動相0.05％磷酸水溶液∶四氫呋喃∶異丙醇∶乙腈(420∶30∶20∶30)；流速0.5ml/min；柱溫30℃，檢測波長254nm。在此條件下總黃酮、高速逆流色譜及製備液相色譜分離部分色譜圖見圖4-1至圖4-5(峰1為槲皮素-新橙皮糖苷，峰2為葒草苷，峰3為牡荊苷)。其中圖4-1為總黃酮色譜圖，圖4-2為HSCCC分離流份「II」(葒草苷)色譜圖，圖4-3為HSCCC分離流份「III」(牡荊苷)色譜圖，圖4-4為流份「I」(高速逆流份離所得含槲皮素-新橙皮糖苷的流份)色譜圖，圖4-5為製備液相色譜流份「IV」(槲皮素-新橙皮糖苷)色譜圖。
結構鑑定對分離得到的槲皮素-新橙皮糖苷、葒草苷和牡荊苷在VarianINOVA-500型核磁共振儀和Varian MAT-212型質譜儀上，進行1HNMR、13CNMR和MS分析，所得數據如下。
葒草苷，黃色粉末，UVλmax(nm MeOH)345，270，255。ESI-MS448(M+)，430(M-H2O)，412(M-2H2O)，394(M-3H2O)，299(苷元+CH2+)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ4.92(1H，d，J＝10.0Hz，H-1″)，6.51(1H，s，H-6)，6.88(1H，s，H-3)，7.10(1H，d，J＝8.0Hz，H-5＇)，7.50～7.94(2H，m，H-2′，6′)，13.55(1H，brs，5-OH)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ163.01(C-2)，103.99(C-3)，182.03(C-4)，160.47(C-5)，98.31(C-6)，164.16(C-7)，104.65(C-8)，156.27(C-9)，102.41(C-10)，121.97(C-1′)，114.07(C-2′)，145.95(C-3′)，149.90(C-4′)，115.78(C-5′)，119.45(C-6′)，73.50(C-1″)，70.90(C-2″)，78.88(C-3″)，70.83(C-4″)，82.04(C-5″)，61.76(C-6″)。
牡荊苷，黃色粉末，UVλmax(nm MeOH)330，301(肩)，269。ESI-MS432(M+)，414(M-H2O)，396(M-2H2O)，283(苷元+CH2+)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ3～4(6H，m，糖上質子)，4.94(1H，d，J＝10.0Hz，H-1″)，6.54(1H，s，H-6)，7.04(1H，s，H-3)，7.15(2H，d，J＝8.0Hz，H-3′，5′)，8.26(2H，d，H-2′，6′)，10.35(1H，s，4′-OH)，10.83(1H，s，7-OH)，13.17(1H，s，5-OH)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ162.98(C-2)，104.51(C-3)，182.73(C-4)，156.64(C-5)，98.95(C-6)，164.31(C-7)，104.56(C-8)，160.28(C-9)，105.07(C-10)，122.07(C-1′)，128.99(C-2′，6′)，115.01(C-3′，5′)，161.32(C-4′)，73.93(C-1″)，71.03(C-2″)，79.01(C-3″)，70.20(C-4″)，81.99(C-5″)，61.76(C-6″)。
槲皮素-新橙皮糖苷，黃色粉末，ESI-MS610(M+)，301(苷元)。1HNMR(500MHz，DMSO-d6)δ1.44(3H，d，rha-CH3)，3.90～4.47(10H，m，糖上質子)，5.27(1H，d，rha-C1-H)，5.93(1H，d，GluC1-H)，6.55(1H，d，J＝2Hz，H-6)，6.59(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.28(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，8.04(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.0Hz，H-6′)，8.26(2H，d，H-2′)。13CNMR(500MHz，DMSO-d6)δ146.94(C-2)，134.08(C-3)，177.88(C-4)，156.32(C-5)，98.28(C-6)，164.02(C-7)，93.44(C-8)，160.94(C-9)，103.27(C-10)，135.96(C-1′)，115.84(C-2′)，147.95(C-3′)，145.18(C-4′)，115.16(C-5′)，120.15(C-6′)，99.4(C-1″)，77.6(C-2″)，77.4(C-3″)，69.6(C-4″)，77.1(C-5″)，60.5(C-6″)，100.7(C-1)，70.6(C-2)，71.3(C-3)，70.9(C-4)，71.7(C-5)，18.1(C-6)。
實施例21.稱取乾燥金蓮花葯材300g，用10倍量50％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，減壓濃縮(60℃)至無醇味，得濃縮後的提取液。
2.取濃縮後的提取液，加水混懸後總體積為900ml。加入到裝有500g經預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂的層析柱上，上樣完畢後吸附1.0小時。用1400ml水洗脫(棄去)。再用2200ml 25％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮後，真空乾燥(60℃)，得粉末量16.3g，得率為5.43％，總黃酮純度為62.2％。
3.總黃酮中槲皮素-新橙皮糖苷、葒草苷和牡荊苷的分離純化、純度檢測以及結構鑑定的方法、步驟及其結果同實例1。
實施例31.稱取乾燥金蓮花葯材300g，用10倍量70％乙醇回流提取2次，每次2小時，過濾，合併濾液，減壓濃縮(60℃)至無醇味，得濃縮後的提取液。
2.取濃縮後的提取液，加水混懸後總體積為900ml。加入到裝有500g經預處理過的AB-8型大孔吸附樹脂的層析柱上，上樣完畢後吸附1.0小時。用1400ml水洗脫(棄去)。再用2000ml 35％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫流份減壓濃縮後，真空乾燥(60℃)，得總黃酮粉末量18.6g，得率為6.20％，總黃酮純度為63.3％。
3.總黃酮中槲皮素-新橙皮糖苷、葒草苷和牡荊苷的分離純化、純度檢測以及結構鑑定的方法、步驟及其結果同實例1。
權利要求
1.一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，具體包括藥材提取、總黃酮製備及單體化合物的分離純化三道工序，其特徵在於藥材提取工序(1)中，將短瓣金蓮花用50％～70％藥用乙醇回流提取，減壓回收乙醇後獲得提取液，總黃酮製備工序(2)中，提取液過大孔吸附樹脂，用水和25％～35％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮乾燥後可得總黃酮，單體化合物分離純化工序(3)中，採用高速逆流色譜法對所得總黃酮進行分離純化，它包括配製構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然後使柱子轉動，再將流動相泵入柱內，由進樣閥進入製備好的總黃酮樣品，根據檢測器譜圖接收目標流份「I」、「II」、「III」，並應用製備液相色譜對流份「I」進一步純化，得到流份「IV」。
2.按照權利要求1所述的一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特徵在於藥材提取工序(1)中，將短瓣金蓮花用10倍量60％藥用乙醇回流提取2次，減壓回收乙醇後得到提取液。
3.按照權利要求1所述的一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特徵在於總黃酮製備工序(2)中大孔吸附樹脂型號可以為1300或AB-8型大孔吸附樹脂，用水和30％藥用乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮乾燥後可得總黃酮。
4.按照權利要求1所述的一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特徵在於單體化合物分離純化工序(3)中，應用高速逆流色譜法對總黃酮進行分離純化，所用的兩相溶劑系統為乙酸乙酯∶正丁醇∶水，兩相溶劑系統乙酸乙酯∶正丁醇∶水的最佳配比為2∶1∶3。
5.按照權利要求1或4所述的一種從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素-新橙皮糖苷的方法，其特徵在於應用製備液相色譜對高速逆流色譜所得流份「I」進一步純化，得到純品。
全文摘要
本發明提供從短瓣金蓮花中提取總黃酮並且從總黃酮中分離純化高純度葒草苷、牡荊苷和槲皮素－新橙皮糖苷的方法，包括藥材提取、總黃酮製備及單體化合物的分離純化三道工序，將短瓣金蓮花用50％～70％藥用乙醇回流提取，減壓回收乙醇後獲取提取液，提取液過大孔吸附樹脂，用水和25％～35％藥用乙醇洗脫，醇洗脫液濃縮乾燥後得總黃酮，用高速逆流色譜法(HSCCC)和製備液相色譜對總黃酮分離純化，得到純度高於98％的葒草苷、牡荊苷、槲皮素－新橙皮糖苷。具有簡便、快速、製備量大、樣品損失少等優點，易於推廣使用。
文檔編號C07H1/08GK1660864SQ20041009312
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月16日 優先權日2004年12月16日
發明者範國榮, 周欣, 彭金詠, 曲麗萍, 吳玉田, 柴逸峰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學