一種高效香蕉胚性愈傷誘導和繼代增殖再生的方法
2023-08-13 01:28:36 1
專利名稱：一種高效香蕉胚性愈傷誘導和繼代增殖再生的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體涉及一種香蕉胚性愈傷 組織高效誘導，並通過植物組織培養技術達到長期繼代增殖，以及將 繼代的胚性愈傷誘導成胚和成苗的方法。
背景技術：
香蕉是熱帶、亞熱帶發展中國家一種果糧兼備的重要經濟作物。 作為繼水稻、小麥、玉米之後的世界第四大糧食作物，香蕉產業的健
康發展具有重要的社會經濟地位。1985年中國科學院華南植物研究 所率先將香蕉組培苗生產技術進行成功的工廠化轉化。目前，香蕉組 織培養技術已十分成熟，業已在香蕉種苗生產中得到廣泛應用，取得 了顯著的經濟效益和社會效益，推進了我國香蕉產業快速發展。
而越來越嚴重的病蟲害、霜凍、颱風等因素嚴重威脅著香蕉生產， 特別是香蕉的毀滅性病害——香蕉葉斑病、枯萎病和束頂病，尚無十 分有效的藥劑防治，因此，選育高產、高抗性的優良新品種是香蕉產 業持續發展的根本途徑。香蕉主要栽培品種多為三倍體，高度不育， 傳統雜交育種方法難以進行品種改良，長期以來，突變育種在全球香 蕉新品種培育中佔據了重要地位。基因工程等生物技術的迅速發展為 香蕉品種的定向改良創造了條件。
建立良好的基因轉化受體系統是植物基因工程的基礎。多年來，全世界的科研工作者們在利用生物技術改良香蕉品種方面取得了可 喜的成果，已可以轉化包括原生質體、莖尖分生組織、胚性細胞懸浮 細胞、橫切薄片等幾種組織而得到基因表達，但這些受體系統不完善， 轉化效率較低，將其應用於生產培育抗病、抗逆新品種仍然存在許多 困難。雖然關於香蕉轉化的報導不少，但並沒有相關的得到成熟的香 蕉轉基因品種的報導。
作為外源基因的受體系統與一般生產上的香蕉組織培養繁殖體 系既有聯繫，又有區別，香蕉的受體系統按再生方式可分三類1) 直接分化再生系統，即利用香蕉莖尖頂端分生組織、球莖、低代香 蕉試管苗橫切薄片為外植體，直接分化腋芽及不定芽。此系統不經 過脫分化過程，獲得再生植株的周期短，操作簡便，體細胞無性系 變異小，能較好地保持受體植物的遺傳穩定性，轉化的外源基因也 能實現穩定的遺傳，但該系統轉化頻率較低，產生嵌合體的頻率較 高，但可以通過加大受體材料的數量，多次繼代篩選來加以改善。2) 脫分化愈傷組織再生系統，即利用香蕉的假莖、頂端分生組織、幼 嫩雄花及花序軸等組織為外植體經過脫分化培養愈傷組織，通過再 分化培養獲得再生植株。脫分化細胞易於接受外源基因，因此該系 統的轉化頻率比較高，但無性系變異較大，轉化的外源基因遺傳穩 定性較差，同時，由脫分化愈傷組織分化的不定芽多為多細胞起源， 獲得的轉基因植株也存在高頻率的嵌合體，只是比直接分化再生系 統存在嵌合體的機率小些。3)胚性愈傷組織再生系統，通常以香蕉 幼嫩雄花及花序軸和低代香蕉試管苗分生組織為外植體誘導脫分化愈傷，然後由脫分化愈傷誘導胚性細胞，再誘導體細胞胚。胚性愈 傷具有卵細胞特性，接受外源基因的能力強，其誘導的胚狀體是單 細胞起源不會出現嵌合體，是理想的基因轉化受體系統，如香蕉胚 性細胞懸浮培養方法就是在這個基礎上產生，但目前該系統的建立 還比較困難，主要是胚性愈傷的誘導率不高，而且周期特別長。目 前，實際應用較多的是直接分化的再生系統，其中嵌合體的問題主 要通過擴大遺傳轉化受體材料的群體數量，以及多次繼代選擇培養 來增加得到純合轉基因植株的機率。
胚性愈傷組織再生系統又叫體細胞胚發生途徑，此再生系統的建 立極大促進了香蕉基因轉化的研究。同時，胚性愈傷組織再生系統的 研究促進了原生質體培養的成功。原生質體培養成功的關鍵在於選擇 合適的起始材料，從優良的胚性細胞製備高質量的原生質體是香蕉原 生質體培養成功的關鍵因素。目前，胚性愈傷誘導率低，誘導時間較 長，以及成胚率和成苗率較低，是影響該受體系統廣泛應用的主要瓶 頸。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效香蕉胚性愈傷誘導和繼代增殖再 生的方法，是一種對香蕉胚性組織進行高效誘導和繼代增殖再生植株 的方法，其首先利用香蕉吸芽薄層切片誘導脫分化愈傷，再進一步誘 導易碎胚性愈傷，以易碎胚性愈傷進行繼代增殖，並利用繼代增殖的 胚性愈傷誘導成胚和成苗。該方法具有誘導率高、速度快，繼代增殖 效率高，誘導成胚和成苗率高等特點，適合基因轉化和生產幼態香蕉苗的高效再生體系，在生產和實驗上都能發揮重要的作用。 本發明所採用的技術方案是
一種高效香蕉胚性愈傷組織誘導和繼代增殖再生的方法，包括-誘導脫分化愈傷組織的培養過程、誘導易碎胚性愈傷組織的培養過 程、易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程、胚性愈傷組織的誘導成胚過 程、成熟胚誘導成苗過程。
1、 誘導脫分化愈傷組織的培養過程
選取香蕉剛出土的無病幼嫩吸芽經表面處理後，剝取頂芽切成薄 片，接種到脫分化愈傷組織誘導培養基上進行暗培養，得到白色脫分 化愈傷組織。所述脫分化愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎
培養基，激素選用2、 4-D 、 IAA 、 NAA 、 ZT(玉米素)，並添加谷 氨酸、Vc 。實驗表明吸芽薄片誘導脫分化愈傷較容易，但誘導出 的脫分化愈傷的生長狀況和培養基成分影響易碎胚性愈傷組織的誘 導效率；生長太快的脫分化愈傷不易誘導出胚性愈傷，培養時間太長 的脫分化愈傷不易誘導出胚性愈傷(培養20 30天較適合)，暗培養 有利於脫分化愈傷的誘導，脫分化愈傷見光很快會變綠，不利於進一 步誘導胚性組織。
2、 誘導易碎胚性愈傷組織的培養過程
將經脫分化愈傷誘導過程產生的白色脫分化愈傷，接到胚性愈傷 組織誘導培養基上進行暗培養即能從脫分化愈傷上再生黃色鬆散的 易碎胚性愈傷組織。所述胚性愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為 基礎培養基，其中大量元素減少，微量元素增加，激素選用2、 4-D、ZT、 Picloram，並添加穀氨酸、Vc ，增加糖的用量。實驗表明大 量元素的減少，微量元素和糖的增加促進胚性愈傷組織的誘導；脫分 化愈傷組織的生長狀況和培養時間影響胚性愈傷的誘導效率；在光培 養條件下很難誘導出胚性愈傷，暗培養促進胚性愈傷的誘導；適當降 低培養溫度促進胚性愈傷的誘導，24 28"C是香蕉誘導出胚性愈傷的
較好溫度；誘導期間的繼代不利於胚性愈傷組織的誘導。
3、 易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程
將易碎胚性愈傷組織接到繼代增殖培養基上進行暗培養，可對易 碎胚性愈傷組織進行繼代和增殖。所述繼代增殖培養基是以MS培養 基為基礎培養基，其中微量元素增加，激素選用2、 4-D、 NAA、 ZT、 Picloram，並添加糖、穀氨酸、Vc 。實驗表明易碎胚性愈傷組織 的繼代增殖不要減少大量元素的量，大量元素減少，降低胚性愈傷組 織的增殖效率，並且長期繼代後胚性愈傷組織易水樣化；微量元素的 增倍和糖的增加促進胚性愈傷的繼代；胚性愈傷的繼代，應適當提高 培養溫度，適宜的溫度為26 30°C;暗培養促進胚性愈傷的繼代增 殖。
4、 胚性愈傷組織的誘導成胚過程
取繼代增殖的胚性愈傷組織接到胚誘導培養基上進行暗培養能 逐步誘導形成球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚。所述胚誘導培養基 是以MS培養基為基礎培養基，其中大量元素減少，微量元素增加， 糖減少，激素選用2、 4-D、 ZT、 TDZ、 GA3，並添加穀氨酸、Vc 。實 驗表明繼代增殖多次的胚性愈傷能進一步誘導成成熟胚，通過繼代增殖過程增加了胚性愈傷的數量，因而大大增加了誘導出胚的數量， 胚性愈傷適宜代數的繼代增殖過程不影響進一步誘導成胚情況；大量 元素和糖的減少可以促進成胚過程，但由於其減少容易造成胚發育的
營養不良，通過加快繼代次數可以解決以上問題，每15 20天繼代 一次是適宜的繼代時間；25 28'C是適宜的誘導成胚溫度。 5、成熟胚誘導成苗過程
挑取經誘導成胚過程的子葉胚，接到成苗培養基上進行培養能逐 步誘導成苗，26 3(TC是適宜的誘導成胚溫度。所述成苗培養基是以 MS培養基為基礎培養基，激素選用NAA、 6-BA。實驗表明由正常的 子葉胚誘導出苗較容易，關鍵環節是需要單獨撥取成熟胚培養，撥取 過程要特別小心，儘量保持胚的完整性。
本發明工藝流程簡單，生產成本低，利用香蕉吸芽薄片為外植體 誘導脫分化愈傷，能大大縮短誘導出香蕉胚性組織的時間，提高胚性 組織的誘導效率和增殖效率，解決了胚性組織再生系統胚性愈傷組織 誘導時間長，誘導率低的問題，成胚率高，具有很大的應用價值。
具體實施方式
下面對本發明作進一步說明。
一種高效香蕉胚性愈傷組織誘導和繼代增殖再生的方法，包括 誘導脫分化愈傷組織的培養過程、誘導易碎胚性愈傷組織的培養過 程、易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程、胚性愈傷組織的誘導成胚過 程、成熟胚誘導成苗過程。1) 誘導脫分化愈傷組織的培養過程
選取香蕉剛出土的無病幼嫩吸芽經表面處理後，剝取頂芽切成厚
1 2mm，長寬0.5 lcm的薄片，接種到脫分化愈傷組織誘導培養基上進行暗培養得到白色脫分化愈傷組織，培養溫度為25 30°C，培養時間20 30天。所述脫分化愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，激素為0. 5 4ppm2、4-D 、0 1ppmlAA 、0 1ppmNAA 、0 0. 5ppm ZT，並添加穀氨酸50 100mg/L， Vc0.〇5~0.5 mg/L，PH 5. 3 5. 8。
2) 誘導易碎胚性愈傷組織的培養過程
將經脫分化愈傷誘導過程產生的白色脫分化愈傷，接到胚性愈傷組織誘導培養基上進行暗培養，能從脫分化愈傷組織上再生黃色鬆散的易碎胚性愈傷組織，培養溫度為24 28。C，培養時間40 50天。所述胚性愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中大量元素減少20 50%,微量元素增加1 3倍，激素為0. 2 2ppm 2、4-D 、 0 0. 5ppmZT、 0 4ppm Picloram，並添加糖40g/L、穀氨酸50 100mg/L， VcO. 05 0. 5 mg/L， PH 5. 3 5. 8。
3) 易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程
將易碎胚性愈傷組織接到繼代增殖培養基上進行暗培養，可對易碎胚性愈傷組織進行繼代和增殖，培養溫度為26 30°C，每20 30天繼代一次。所述繼代增殖培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中微量元素增加1 3倍，激素為O. 2 2ppm2、 4-D 、 0 1ppmNM、0 0. 5ppm ZT、 0 4卯m Picloram，並添加糖40g/L、穀氨酸50 100mg/L、 VcO. 05 0. 5 mg/L， PH 5. 3 5. 8。
4) 胚性愈傷組織的誘導成胚過程
繼代增殖的胚性愈傷組織接到胚誘導培養基上進行暗培養，誘導形成成熟胚，培養溫度為25 28。C，每15 20天繼代一次。所述胚誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中大量元素減少20 50%,微量元素增加1 3倍，激素為0 2ppm2、 4-D、 0.2 0.5ppmZT、 0 3ppm TDZ、 0 0. 5ppm GA3，並添加糖20g/L、穀氨酸50 100mg/L、 Vc0.05 0. 5 mg/L， PH 5.3 5. 8。
5) 成熟胚誘導成苗過程
挑取經誘導成胚過程的成熟胚，接到成苗培養基上進行培養能逐步誘導成苗，培養溫度為26 30°C，光照時間為16h，光照強度為1000 lx，每20 30天繼代一次。所述成苗培養基是以MS培養基為基礎培養基，激素為0 0 . 5ppm NAA 、 1 5ppm 6-BA，並添加糖30g/L，PH 5. 3 5. 8。
權利要求
1、一種高效香蕉胚性愈傷組織誘導和繼代增殖再生的方法，其特徵在於包括誘導脫分化愈傷組織的培養過程、誘導易碎胚性愈傷組織的培養過程、易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程、胚性愈傷組織的誘導成胚過程、成熟胚誘導成苗過程；1)誘導脫分化愈傷組織的培養過程選取香蕉剛出土的無病幼嫩吸芽經表面處理後，剝取頂芽切成厚1～2mm，長寬0.5～1cm的薄片，接種到脫分化愈傷組織誘導培養基上進行暗培養得到白色脫分化愈傷組織，培養溫度為25～30℃，培養時間20～30天；所述脫分化愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，激素為0.5～4ppm 2、4-D、0～1ppm IAA、0～1ppm NAA、0～0.5ppm ZT，並添加穀氨酸50～100mg/L，Vc0.05～0.5mg/L，PH 5.3～5.8；2)誘導易碎胚性愈傷組織的培養過程將經脫分化愈傷誘導過程產生的白色脫分化愈傷組織，接到胚性愈傷組織誘導培養基上進行暗培養即能從脫分化愈傷上再生黃色鬆散的易碎胚性愈傷組織，培養溫度為24～28℃，培養時間40～50天；所述胚性愈傷組織誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中大量元素減少20～50％，微量元素增加1～3倍，激素為0.2～2ppm 2、4-D、0～0.5ppm ZT、0～4ppm Picloram，並添加糖40g/L、穀氨酸50～100mg/L，Vc0.05～0.5mg/L，PH 5.3～5.8；3)易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程將易碎胚性愈傷組織接到繼代增殖培養基上進行暗培養，可對易碎胚性愈傷組織進行繼代和增殖，培養溫度為26～30℃，每20～30天繼代一次；所述繼代增殖培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中微量元素增加1～3倍，激素為0.2～2ppm 2、4-D、0～1ppm NAA、0～0.5ppm ZT、0～4ppm Picloram，並添加糖40g/L、穀氨酸50～100mg/L、Vc0.05～0.5mg/L，PH 5.3～5.8；4)胚性愈傷組織的誘導成胚過程將繼代增殖的胚性愈傷組織接到胚誘導培養基上進行暗培養，誘導形成成熟胚，培養溫度為25～28℃，每15～20天繼代一次；所述胚誘導培養基是以MS培養基為基礎培養基，其中大量元素減少20～50％，微量元素增加1～3倍，激素為0～2ppm 2、4-D、0.2～0.5ppmZT、0～3ppm TDZ、0～0.5ppm GA3，並添加糖20g/L、穀氨酸50～100mg/L、Vc0.05～0.5mg/L，PH 5.3～5.8；5)成熟胚誘導成苗過程挑取經誘導成胚過程的成熟胚，接到成苗培養基上進行培養能逐步誘導成苗，培養溫度為26～30℃，光照時間為16h，光照強度為1000 1x，每20～30天繼代一次；所述成苗培養基是以MS培養基為基礎培養基，激素為0～0.5ppm NAA、1～5ppm 6-BA，並添加糖30g/L，PH5.3～5.8。
全文摘要
本發明公開了一種高效香蕉胚性愈傷組織誘導和繼代增殖再生的方法，其工藝過程包括誘導脫分化愈傷組織的培養過程、誘導易碎胚性愈傷組織的培養過程、易碎胚性愈傷組織的繼代增殖過程、胚性愈傷組織的誘導成胚過程、成熟胚誘導成苗過程。本發明工藝流程簡單，生產成本低，胚性組織誘導和增殖率高，可繼代時間長，克服了香蕉組織培養過程中，外植體的胚性反應低，胚性愈傷組織誘導難，誘導成胚率和成苗率低，以及誘導周期長等技術難題，為香蕉轉化技術提供了新的技術路線，也為生產幼態組織培養香蕉苗提供了高效再生體系，具有很大的應用價值。
文檔編號A01H4/00GK101518208SQ20091012977
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月23日 優先權日2009年3月23日
發明者明 彭, 曾會才, 旭 王, 輝 趙 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所