超聲波處理花粉介導植物基因轉化方法

2023-08-13 06:12:46

專利名稱：超聲波處理花粉介導植物基因轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種植物基因轉化的方法，屬於生物工程技術領域。
隨著人口增長、環境汙染、土地貧瘠造成的可耕地面積不斷縮小及原材料的逐漸減少，人類對作物品質改良的要求也越來越緊迫。過去傳統的雜交育種方式，主要從降低株高、縮短生長發育時間和利用雜種優勢大幅度地提高產量。但是在現階段，改良作物品質已經不能單純依靠傳統的雜交育種手段，以分子生物學為基礎的生物技術近幾年來進展迅速，成為農業、食品、化學材料、醫藥、環境等研究領域的重要發展動力。
自1983年第一例轉基因植物問世以來，雖然只有16年的時間，但植物基因工程的發展卻日新月異，碩果纍纍。植物基因工程使作物育種從雜交育種走向了基因育種，極大地拓寬了作物育種的深度和廣度。人們已能夠跨越物種間的界限，定向地改造作物性狀，從而使作物育種的進度大大加快。迄今為止，利用植物轉基因技術已在培育抗病、抗蟲作物品種、改良作物品質、提高作物產量和抗逆性等方面取得了顯著進展，已有一批轉基因植物投入生產。
在農作物基因轉化研究中，植物基因轉化方法對遺傳轉化是至關重要的，它決定了如何高效地將外源基因導入植物細胞，並再生出轉基因植株。農桿菌質粒載體介導轉化方法是目前研究最多、理論機理最清楚、技術方法最成熟的基因轉化方法。但是該方法存在著宿主範圍小、菌株特異性強等問題，其最大的缺點是僅適用於大多數的雙子葉植物，對於單子葉植物，特別是禾本科植物不敏感，從而限制了它的適用範圍。然而，由於主要的禾穀類糧食作物都屬於單子葉植物，因此，單子葉植物的基因轉化研究更具有重大的意義。
原生質體轉化法，包括PEG介導法、電擊法、微針注射法等的最大優點是無宿主範圍，適用於各種作物，特別是能應用於單子葉植物。其另一個重要特點是通過原生質體轉化獲得的再生植物無嵌合體發生，有利於生產實踐的應用。而且能夠一次處理很多原生質體，是瞬間表達研究的較好系統。但是目前對於大多數的植物而言，原生質體培養仍然比較困難，再生頻率低，重複性差，不易獲得轉化植株，特別是單子葉植物原生質體的培養更困難，因此，這種轉化方法比以組織或器官為受體的轉化方法要複雜得多，困難得多。
基因槍法是近年來迅速發展起來的轉化方法，它克服了以原生質體為受體細胞的缺點，可適用於任何植物和材料。但是應該看到，這種轉化方法設備複雜昂貴，耗資大，轉化率低，不易得到穩定轉化，而且該方法也是以組織培養為基礎，實驗周期較長。該項技術目前還不成熟，外源DNA整合的機理尚不清楚，整合的外源DNA結構變化複雜，拷貝數較多，遺傳性較差等問題，尚需進一步的完善和深入研究。而且這種方法的關鍵取決於受體外植體的選擇，所選擇的轟擊受體，一定要具有強的器官分化潛能。
許寧等進行了超聲波誘導動植物細胞外源基因導入的實驗，並且在WO專利91/00358研究的基礎上，給出了一種超聲波誘導植物組織基因轉移的方法CN1180746A。該方法是將植物組織塊經預處理後放入盛著適合於植物組織培養且含外源DNA的緩衝液的容器中，再將超聲波探頭置於容器壁上或直接伸入溶液中，開啟超聲波，在脈衝型超聲波的作用下，將外源基因導入植物組織塊中。這種基因導入的方法既適合雙子葉植物，也適合於單子葉植物，特別是禾穀類作物的基因轉化，具有設備便宜，轉化效率高的優點。但是，該方法仍需要用組織培養的方法誘導產生愈傷組織，依然擺脫不了進行植物組織的離體培養這一複雜的操作過程。
德國專利DE 3724154公開了一種將基因轉入植物的方法，該專利在否定了成熟的花粉粒能夠作為外源基因導入的載體的前提下，提出了一種利用未成熟的花粉粒作為靶細胞的新的植物基因轉移方法。該方法是在營養溶液中從花葯分離未成熟的花粉粒，並移除它們所附著的組織，在一種營養溶液中培養這些分離的未成熟的花粉粒，在體外培養和成熟過程中轉移外源遺傳物質至花粉粒，在體外使轉化的花粉粒完全成熟，最後，用轉化的花粉粒向受體植物傳粉，並從受體植物得到種子。該方法由於細胞培養期大大縮短，與其他方法比較，步驟大大簡化，特別是省去了伴有較麻煩的體細胞克隆變異現象的再生階段。而且該方法採用來成熟的花粉粒，避免了花粉粒立即產生花粉管，使基因不能轉化的缺點，延長了外源基因進入花粉粒的時間，使轉化率得以提高。但是，該轉化方法的實質只是利用花粉粒作為一種基因導入的中間體，外源基因的導入仍需使用諸如農桿菌共培養、電激法、微針注射法等轉化方法進行，實驗操作仍然複雜。
Van der Leede-plegt等和董雲洲等曾用基因槍直接轟擊花粉獲得了轉基因植株。但是基因槍直接轟擊花粉時，花粉容易濺起，而很不易操作。而且由於未遭受基因槍轟擊的花粉粒較基因槍轟擊過的轉化花粉在授粉時具有較強的競爭力，而容易受精，使得轉化效率降低。
本發明的目的是提供一種新的植物基因轉化方法，即利用超聲波誘導，採用花粉介導，促使外源DNA導入到植物細胞中，進行植物基因轉化的方法。
本發明的具體方案是在植物盛花期，取當天開花的新鮮花粉，置於由5-15％蔗糖溶液組成的介質溶液中，與外源質粒DNA相混合，並輔以超聲波處理，然後將處理過的花粉授於植物柱頭上，套袋掛牌標記，並最終從受體上收穫種子，在後代中篩選轉化植株。
超聲波處理的方法是採用聲強為200-300W的超聲波處理溶液，每次處理5秒，間隔10秒，共處理5-8次。
由於花粉粒在溶液中極易吸脹破裂而失去生活能力，因此，不能直接將質粒DNA溶液與花粉混合，必須選擇含一定溶質的溶液作為介質，使質粒DNA吸附於花粉粒上或進入到花粉粒中，並維持花粉粒正常的膨壓。一定濃度的蔗糖溶液能夠維持花粉粒內外的滲透壓，防止花粉粒吸水膨脹而喪失生活力，而且能促進花粉粒萌發。然而隨著溶液中蔗糖濃度的提高，花粉粒的受損率也會增加，因此，我們選擇5％-15％的蔗糖溶液作為花粉介導轉化的介質溶液。
為達到一定的基因轉化效率，外源質粒DNA的濃度應不低於40ug/L。
研究發現，超聲波的空化效應是造成外源基因進入細胞的重要機制。所謂空化效應，就是液體中存在的一些小氣泡在超聲波作用下表現出的空泡湮滅過程。空化效應發生時，在空化中心會產生局部的高溫高壓，甚至產生電離效應及放電，導致空泡周圍的細胞壁產生局部的穿孔以及質膜產生破損或局部和暫時的結構改變。從而使溶液中的DNA分子籍此擴散進入細胞。超聲波所特有的這種空化作用以及穿透力大，在液體和固體中傳播時衰減小，界面反射使物質受超聲波作用面積較大等特點，極可能是造成高效、瞬間表達和穩定轉化的重要原因。這些特點使得超聲波基因轉化具有操作簡單、設備便宜、不受宿主範圍限制、轉化率高等優勢。因此，我們利用超聲波的這種瞬間釋放出的高能和空化作用，促使外源質粒DNA進入到花粉的細胞核中。但是我們發現，在花粉粒的表面有一些核酸酶，如果將花粉粒與外源DNA直接混合，花粉粒表面的核酸酶會在幾分鐘內將外源DNA降解掉而不能實現外源DNA的遺傳轉化。
進而我們又發現超聲波處理不僅能夠促進外源質粒DNA進入到花粉的細胞核內，而且超聲波的高能作用還可以將花粉表面的核酸酶破壞掉，以防止核酸酶在介質溶液中降解外源DNA。有效地保護外源DNA進入植物細胞，實現外源基因轉化。
本發明利用超聲波的高能和空化作用，將外源質粒DNA成功地通過花粉導入到植物細胞中，成為一種利用花粉作為載體的新的外源基因導入方法。
利用花粉作為載體介導外源基因轉化，既避免了傳統的農桿菌共培養法所要求的組織培養技術，以及長期組織培養所帶來的再生困難，幼苗早期夭亡、後代育性不正常、易產生變異等一系列問題，又避免了轉化體細胞所帶來的易形成嵌合體的問題，同時也避免了基因槍法轉化所帶來的耗資大、組織培養複雜、轉化率低以及原生質體轉化法原生質體分離困難等問題。因此，本發明的基因轉化方法簡便、有效、實用性強，所用儀器設備簡單、易操作、耗資少，具有較好的應用前景。
我們採用本發明的基因轉化方法，首先在玉米上進行遺傳轉化獲得了成功。
玉米是重要的糧食作物，其遺傳轉化在國內外都非常重視。目前已用超聲波法、基因槍法、農桿菌介導法、電激法等方法獲得了轉基因植株。但是這些方法都需要用愈傷組織甚至是原生質體作為受體進行基因轉移，玉米從愈傷組織到分化出再生植株，常出現變異，而且轉化植株在從試管移到田間(溫室)的過程中也易受損失，如植株夭亡和產生不育株等，使這些方法的應用受到了很大限制。本發明提出的由花粉介導的、經超聲波處理的轉基因方法，給玉米的遺傳轉化提供了一種簡便、有效的基因轉化新技術。
下面是本發明應用於玉米基因轉化的具體應用實例。
供體質粒DNA的製備以質粒pGLII-RC-1為基因供體材料。該質粒攜帶有幾丁質酶(chitinase)基因和潮黴素的抗性(hph)基因，其中hph基因為選擇標記基因，它賦予植物以對潮黴素的抗性。幾丁質酶基因片段大小為1.1kb。其物理圖譜如

圖1所示。質粒DNA的製備採用裂解法。
受體材料太9101，E28，太早9505，5003，太早921，黃早4，海921，422，綜31，太411，自330等玉米(Zea may L.)自交系。
轉化方法供試玉米自交系在5月上旬播種，7月上、中旬抽穗、開花。抽絲前套袋隔離。在盛花期選取當天開花的玉米花粉，於5％蔗糖溶液中與質粒DNA混合，並採用寧波新芝科器研究所的JY92-II型超聲波細胞粉碎儀；以300W聲強的超聲波處理溶液8次，每次處理時間5秒，間隔10秒。之後將處理過的花粉授於剪短的玉米花絲上，並套袋掛牌標記。
轉化結果按上述轉化方法，對供試材料進行了遺傳轉化處理。共處理155穗，結實21穗，每穗結實粒數1-20粒不等，共收穫種子56粒，見表1。
表1轉化處理及結實情況<
轉化處理後的種子第二年春天播種，出苗54株(T1代)。在植株長到五、六片葉時取幼嫩葉片，提取總DNA，進行分子檢測以確定轉化率。DNA斑點雜交轉化處理後第一代植株，採用Pich和Schubert的方法，提取單株葉片的總DNA，用地高辛標記幾丁質酶基因，用BamHI和HindIII雙酶切pGLII-RC-1質粒，並回收1.1kb的幾丁質酶基因片段，採用德國寶靈曼公司的Dig DNA Labeling and Detection Kit進行幾丁質酶基因的探針標記和斑點雜交。用10ug的總DNA點於尼龍膜上，80℃烘烤2小時，68℃雜交。對28個轉化單株總DNA以及未轉化的對照株進行DNA斑點雜交，結果有14株呈陽性，未轉化的對照株均為陰性。DNA斑點雜交結果見表2。
表2 DNA斑點雜交結果
圖2是其中13個轉化單株和未轉化的對照株進行DNA斑點雜交的結果。其中1A為太9101未轉化株；2A-3C分別為太9101不同的轉化單株，其中陽性斑點分別是太9101-11、太9101-18、太9101-3；4C-2D為綜31不同的轉化單株，分別是綜31-2、綜31-4、綜31-1；3D為綜31未轉化單株；4D為陽性對照(質粒)。
PCR擴增結果根據幾丁質酶基因的核苷酸序列，分別取5′端和3′端20bp的核苷酸對設計引物，進行PCR擴增。引物合成由上海生工生物工程公司完成。兩引物間的基因片段大小為923bp。PCR擴增用大連寶生物公司的TaKaRa TaqTM試劑盒和PTC-200型PCR儀完成。對DNA斑點雜交呈陽性的太9101-3、太9101-11、太9101-18、綜31-4、綜31-2、綜31-1等單株，用100-150ng總DNA進行PCR擴增，PCR反應條件為94℃5分鐘，94℃30秒，50℃30秒，72℃1分30秒，擴增30個循環，然後72℃延伸10分鐘。PCR的檢測結果均為陽性，而未轉化對照單株為陰性，說明幾丁質酶基因確實已導入到玉米植株中。PCR擴增試驗結果見圖3。
圖3為PCR擴增產物的電泳分析(1.5％瓊脂糖凝膠)圖，其中1為分子量標記；2為綜31未轉基因株；3、4、5分別為綜31轉基因株綜31-2、綜31-4、綜31-1；6為太9101未轉基因株；7、8、9分別為太9101轉基因株太9101-11、太9101-18、太9101-3；10為陽性對照(質粒)。
利用本發明方法對玉米11個自交系進行遺傳轉化，根據DNA斑點雜交試驗和PCR擴增試驗結果證明，外源基因的確已導入到受體植物上，而且轉化率達到了48.28‰。
權利要求
1.一種超聲波處理花粉介導植物基因轉化方法，其特徵在於該方法是取盛花期的植物新鮮花粉，於介質溶液中與外源DNA混合，並對此溶液進行超聲波處理，將處理後的花粉授於植物柱頭上，並從受體上收穫種子，在後代中篩選轉化植株。
全文摘要
本發明是一種利用超聲波處理的花粉介導植物基因轉化方法。具體是將盛花期的新鮮花粉與質粒DNA混合,並附加超聲波處理,然後輔以人工授粉的方法將外源基因導入到受體中。轉化結果經DNA斑點雜交和PCR擴增檢測得以證實。本發明轉化方法簡便、易操作,具有很強的實用性。
文檔編號C12N15/87GK1250100SQ9912115
公開日2000年4月12日 申請日期1999年10月19日 優先權日1999年10月19日
發明者孫毅, 王景雪, 崔貴梅 申請人:山西省農業生物技術研究中心