血清dkk1在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途

2023-08-13 03:06:01 2

血清dkk1在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途
【專利摘要】本發明涉及血清DKK1在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途。本發明人通過分析大量的肝細胞癌樣本，從中分析了DKK1和AFP的表達情況，首次發現血清DKK1診斷AFP陰性肝細胞癌具有較高的靈敏度和特異性。
【專利說明】血清DKK1在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域；更具體地，本發明涉及血清DKKl在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途。
【背景技術】
[0002]肝臟原發性腫瘤包括肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、肝內膽管癌、混合性肝細胞癌、膽管囊腺瘤、肝母細胞瘤、血管瘤、類癌、淋巴癌、上皮樣血管內皮瘤、鱗狀細胞癌、畸胎瘤、以及平滑肌肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤等其它肝臟肉瘤。目前，肝細胞癌的病因尚未完全明確，其發生是一個涉及多因素、多階段和多基因累積變異的過程，主要的因素有病毒感染、黃麴黴毒素的攝入、酒精中毒、水汙染、肝螺旋桿菌以及肝硬化等。B型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝細胞癌的主要致病因素，尤其是在亞洲和非洲；C型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染呈世界性分布，是歐美等西方國家肝細胞癌發病率升高的主要因素。肝硬化是肝細胞癌發生最危險的因素，也是肝硬化病人主要的死因。由於大多數肝細胞癌患者就診時已屬中晚期，失去了最佳治療時機，目前僅有30-40%的肝細胞癌患者能實施有效手術治療，五年生存率僅3-5%。所以及時有效的診斷肝細胞癌是提高患者生存率的關鍵之一。
[0003]目前，篩查和診斷肝細胞癌最常用的方法是影像學和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)檢測。影像包括超聲、CT、MRI等,但影像檢測花費昂貴,難以廣泛應用，且易受操作者經驗影響，而且難以區分肝癌和非惡性增生。AFP是當前全世界應用最廣泛的肝細胞癌標誌物。當其界值為20ng/mL時，AFP診斷肝細胞癌的靈敏度僅為55-60%,產生約40%的假陰性率。這部分AFP陰性肝細胞癌病人在臨床上難以診斷，難以評估其治療效果和疾病進程。因此發現新的可靠的能彌補AFP不足的肝細胞癌診斷標誌物，可極大提高和改善臨床綜合治療效果，有助於肝細胞癌患者生存期的延長和生存質量的提高。理想的腫瘤標誌物需要有較高的特異性，能夠將肝細胞癌與肝炎、肝硬化、肝臟再生結節等區別開來，同時還需有較高的靈敏度，能夠診斷早期肝細胞癌，且具有易檢測、可重複、非侵入性的特點。
[0004]人類基因組計劃的完成，高通量基因表達檢測方法的發展和大規模數據分析能力的提高，使人們可以更深入地研究肝細胞癌發生發展過程中基因表達的改變，更好地理解肝細胞癌的發病機制，篩選並獲得可應用於臨床的生物標誌物和藥物靶點。本發明人前期通過 cDNA 表達譜晶片(Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array)技術分析了肝癌患者癌組織及對應癌旁肝組織基因表達譜存在差異。進一步發現DKKl在正常成年人的多種組織中不表達，僅在胎盤組織中表達，具有腫瘤特異性。
[0005]DKKl是Wnt信號通路的抑制因子，最早克隆於1998年，發現其在非洲爪蟾早期發育中能夠抑制fct誘導的軸的複製而參與頭部的形成。Wnt通路是一條對胚胎發育起重要調節作用的信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡、細胞極性和運動等過程，其通路中信號分子的突變或異常表達與多種疾病及癌症相關。fct通路受幾種分泌蛋白的調控，包括DKK、WIF(ffnt-1nhibitor factor)和 SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK 家族包含進化上相對保守的4個成員(DKK1-4)。DKKl編碼一個分泌型糖蛋白，含有兩個富含半胱氨酸的保守區域(Cysl、Cys2),能夠與低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 (low_densitylipoprotein receptor-related protein 5/6,LRP5/6)結合，並在膜蛋白 Kremenl/2 參與下通過引起LRP5/6內吞,抑制Wnt-Frizzled_LRP5/6複合體的形成,而抑制經典的fct信號通路。
[0006]隨後本發明人採用ELISA方法，首次在10種不同類型人腫瘤細胞培養上清中檢測出高濃度的DKKl蛋白，提示多種人腫瘤細胞分泌和高表達DKKl，DKKl可用於人類惡性腫瘤的臨床血清診斷。於是2005年本發明人申報了國家發明專利(CN200510110298.2)和國際PCT專利(PCT/CN2006/000382)。DKKl用於癌症血清診斷的中國專利和國際專利均為本發明人首次在國內和國際上提出申請。儘管針對DKKl已經有在先的研究，但是本領域目前對血清DKKl的臨床意義，特別是對AFP陰性(血清AFP ( 20ng/ml)肝細胞癌患者的診斷能力並不清楚。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供血清DKKl在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途。
[0008]在本發明的第一方面，提供DKKl蛋白或其編碼基因在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途。
[0009]在本發明的另一方面，提供DKKl在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑盒中的用途。
[0010]在一個優選例中，所述的診斷試劑選自(但不限於):
[0011]特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或
[0012]特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或
[0013]特異性抗DKKl蛋白的抗體。
[0014]在另一優選例中，所述的特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物是引物對，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示。
[0015]在本發明的另一方面，提供一種用於測定甲胎蛋白陰性肝細胞癌的試劑盒，所述的試劑盒中含有:
[0016](I)檢測甲胎蛋白或其編碼基因(較佳地，為血清中的甲胎蛋白或其編碼基因)的表達情況或表達量的診斷試劑；和
[0017](2)檢測DKKl蛋白或其編碼基因(較佳地，為血清中的DKKl蛋白或其編碼基因)的表達情況或表達量的診斷試劑。
[0018]在一個優選例中，所述的試劑盒中，先使用⑴的診斷試劑檢測待測樣品(較佳地，為血清)中甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量；再使用(2)的診斷試劑檢測待測樣品(較佳地，為血清)中的DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量，當甲胎蛋白檢測為陰性時，若檢測為DKKl陽性，則該待測樣品的提供者為肝細胞癌高危。
[0019]在另一優選例中，所述的檢測甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑選自(但不限於):
[0020]特異性擴增甲胎蛋白的編碼基因的引物；或
[0021]特異性識別甲胎蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或
[0022]特異性抗甲胎蛋白的抗體。
[0023]在另一優選例中，所述的特異性擴增甲胎蛋白的編碼基因的引物是引物對，核苷酸序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0024]在另一優選例中，所述的檢測DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑選自(但不限於):
[0025]特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或
[0026]特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或
[0027]特異性抗DKKl蛋白的抗體。
[0028]在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括:
[0029]核酸抽提試劑(如核酸抽提液)；和/或
[0030]聚合酶鏈反應試劑(如dNTP，Taq酶)；和/或
[0031]蛋白免疫印跡試劑；和/或
[0032]酶鏈免疫反應試劑(如顯色液或雜交液)。
[0033]在本發明的另一方面，提供一種測定甲胎蛋白陰性肝細胞癌的方法，所述方法包括:
[0034](a)檢測待測樣品中甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量；和
[0035](b)檢測待測樣品中的DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量，當甲胎蛋白檢測為陰性時，若檢測為DKKl陽性，則該待測樣品的提供者為肝細胞癌高危。
[0036]在一個優選例中，使用所述的試劑盒進行測定。
[0037]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1.DKKl和AFP在肝組織及相應血清中表達情況的比較分析。
[0039]通過sem1-qPCR檢測4例正常肝組織(healthy controls, HC)、8例肝硬化組織(liver cirrhosis, LC)和 16 例肝細胞癌組織(hepatocellular carcinoma, HCC)中DKKl (圖A)和AFP (圖D)的mRNA表達情況，以及通過qRT-PCR檢測DKKl (圖B)和AFP (圖E)的mRNA表達情況。ELISA檢測這28例肝組織相應血清中DKKl (圖C)和AFP (圖F)的蛋白水平。
[0040]圖2.DKKl是否可作為診斷標誌物的研究的流程設計。
[0041]正常人(healthycontrols, HC);慢性B型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)；肝硬化(liver cirrhosis, LC);肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC);酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);受試者工作特徵(receiveroperating characteristics, ROC) ；DKK1:dickkopf-l ；AFP: alpha-fetoprotein。
[0042]圖3.測試集和驗證集各組中血清DKKl蛋白和血清AFP蛋白的濃度。
[0043]圖A和C為正常對照組(healthy controls, HC)、慢性B型肝炎組(chronichepatitis B，CHB)、肝硬化組(liver cirrhosis, LC)和肝細胞癌組(HCC)中血清 DKKl 蛋白的濃度。圖B和D為血清AFP蛋白在這4組中的濃度，當血清AFP濃度高於1210ng/ml時，其濃度以1210ng/ml計算。*，Ρ〈0.001。
[0044]圖4.血清DKKl診斷肝細胞癌cutoff值的確定。
[0045]以肝細胞癌(HCC)為病人組，以正常人(healthy controls, HC)、慢性B型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和肝硬化(liver cirrhosis, LC)患者為對照組製作ROC曲線，確定血清DKKl診斷肝細胞癌的cutoff值、敏感性(sensitivity)、特異性(specificity)和曲線下面積(aera under the curve, AUC)。
[0046]圖5.血清DKKl對AFP陰性((20ng/ml)肝細胞癌的診斷能力。
[0047]圖A和C為在AFP陰性肝細胞癌(AFp--HCC)和AFP陽性肝細胞癌(AFP+-HCC)中血清DKKl的濃度。圖B和D為以AFP陰性肝細胞癌(AFP-negative HCC)為病人組，以正常人(healthy controls, HC)、慢性B型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)和肝硬化(livercirrhosis, LC)病人為對照組，製作ROC曲線，評價血清DKKl對AFP陰性肝細胞癌的診斷價值。
【具體實施方式】
[0048]本發明人通過分析大量的肝細胞癌樣本，從中分析了 DKKl和AFP的表達情況，首次發現血清DKKl診斷AFP陰性肝細胞癌具有較高的靈敏度和特異性。因此，DKKl可非常有效地用於診斷AFP陰性肝細胞癌。
[0049]本發明中，本發明人首先在組織水平平行分析了 DKKl和AFP的表達情況，隨後設計了大樣本多中心隊列研究，通過檢測測試集隊列(包括213例正常人、98例慢性B型肝炎患者、96例肝硬化患者和424例肝細胞癌患者(其中179例為AFP陰性))血清中的DKKl蛋白濃度，在國內外首次發現血清DKKl診斷AFP陰性肝細胞癌具有較高的靈敏度和特異性，並在驗證集(包括99例正常人、73例慢性B型肝炎患者、72例肝硬化患者和209例肝細胞癌患者(其中69例為AFP陰性))中驗證了血清DKKl對AFP陰性肝細胞癌的診斷價值。
[0050]如本文所用，「AFP陰性肝細胞癌」是指一種適應症，其是一種肝細胞癌，但其AFP基本上不表達或血清AFP低於20ng/ml。AFP是當前應用最廣泛的肝細胞癌標誌物，根據現有技術，當AFP界值為20ng/mL時，AFP診斷肝細胞癌的靈敏度僅為55_60%，產生約40%的假陰性率。這部分AFP陰性肝細胞癌病人在臨床上難以診斷，難以評估其治療效果和疾病進程。
[0051]目前臨床上，肝癌主要分為以下幾類:(1)肝細胞癌，起源於肝細胞的惡性腫瘤；
(2)膽管癌，起源於肝內外膽管上皮細胞的惡性腫瘤，約佔原發性肝癌的20%，近年來發病率逐年升高；(3)混合性原發性肝癌，同一肝癌腫塊內，肝細胞癌與膽管細胞癌並行；(4)肝血管瘤，較為常見的肝臟良性腫瘤，佔肝良性腫瘤的5-20% ； (5)肝腺瘤:在肝臟良性腫瘤中，其發病率僅次於肝血管瘤，發病機理可能與性內分泌紊亂有關，主要發於女性；(6)肝臟局灶性結節性增生，肝臟良性病變，發病原因暫不清；(7)肝類癌，惡性腫瘤原發性肝類癌較少見，繼發性肝類癌主要有消化道等臟器的類癌轉移所致，較常見；(8)肝母細胞瘤:一種具有多種分化方式的惡性胚胎性腫瘤，是兒童中最常見的肝腫瘤；(9)轉移性肝癌:原發灶在身體其它部位，轉移至肝生長的惡性腫瘤。
[0052]此外，還有慢性肝病(例如肝炎、肝硬化)也表現為肝部不適，易於被診斷為肝癌。根據以上肝癌以及肝病的特點可知，在臨床上肝癌存在複雜性，如何進行區分認定、提高臨床診斷準確性是人們亟待解決的問題，臨床上非常需要能夠準確診斷肝細胞癌(特別是常規難以準確診斷的AFP陰性肝細胞癌、早期肝細胞癌或小肝細胞癌)的標誌物。而AFP儘管已經被作為一種經典的肝癌標誌物，但其卻不能夠完全解決臨床上準確細分、診斷的難題，誤診率居高不下。而DKKl這一標誌物，儘管本發明人在先已經將之與癌症相關聯，然而其是否可以對肝癌的類型進行細分是以往的研究中未知的。
[0053]在本發明中，術語「DKK1蛋白」的胺基酸序列與GenBank登錄號AAQ89364提供的蛋白序列基本上相同，也包括DKKl蛋白的同源蛋白。「DKK1蛋白的編碼基因」的核苷酸序列與GenBank登錄號NM_012242.2提供的核苷酸序列基本上相同或其簡併的變異體，也包括DKKl基因的同源基因。術語「AFP蛋白」的胺基酸序列與GenBank登錄號AAH27881.1提供的蛋白序列基本上相同。「AFP蛋白的編碼基因」的核苷酸序列與GenBank登錄號NM_001134.1提供的核苷酸序列基本上相同或其簡併的變異體。
[0054]基於本發明人的新發現，可以以DKKl蛋白或其編碼基因作為測定肝細胞癌、特別是AFP陰性肝細胞癌的標誌物(標記物)。通過分析待測樣品(樣本)中DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況，從而得知受試者的患病狀況，為疾病的診斷或預後提供依據。所述的待測樣品或待測樣本是患者的體液，較佳地是血清。
[0055]可採用各種技術來檢測DKKl的表達情況，這些技術均包含在本發明中。檢測核酸可用的已有技術如(但不限於):基因晶片技術、探針雜交技術、聚合酶鏈反應(PCR)、Northern Blot等方法。檢測蛋白可藉助於質譜分析儀器等，或可通過Western Blot或ELISA等方法。
[0056]作為本發明的一種選擇方式，通過定量或半定量的聚合酶鏈反應(PCR)法來分析樣品中DKKl基因的表達情況以及表達量，從而可做出判斷。較佳地，通過實時定量Realtime-PCR 實現檢測。
[0057]基於本發明的新發現，本發明還提供了特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試齊U。任何可識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑均包含在本發明中，用作檢測AFP陰性肝細胞癌的標誌物。所述的特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑例如是:特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗DKKl蛋白的抗體。
[0058]本發明還提供了一種特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑的用途，用於檢測AFP陰性肝細胞癌或AFP陰性肝細胞癌高危人群。
[0059]作為本發明的一種實施方式，所述的試劑是抗DKKl的抗體；更特別的例如是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0060]本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的抗原可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生，所述的動物如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
[0061]本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備。[0062]所述的抗體可用於免疫化學技術中，檢測標本中的DKKl水平，從而用於診斷AFP陰性肝細胞癌或判斷患病風險(易感性)。
[0063]作為本發明的另一種實施方式，所述的試劑是特異性擴增DKKl基因的引物，在得知了 DKKl的核苷酸序列後，人們易於基於此設計出引物。作為本發明的更優選方式，所述的引物是引物對，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述的引物對能夠擴增獲得合適長度的擴增產物，檢測的特異性良好。
[0064]也可利用基因晶片技術來進行DKKl的檢測。在得知了 DKKl的核苷酸序列後，人們易於基於此設計出探針。例如，如果固相載體採用的是修飾玻片或矽片，探針的5』端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配製成溶液，然後點樣儀將其點在修飾玻片或矽片，排列成預定的序列或陣列，然後通過放置過夜來固定，就可得到本發明的基因晶片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其製備方法也可參照現有公知技術。
[0065]利用所述的抗體、探針或引物，可以檢測體液中DKKl的水平，因而可用於檢測AFP陰性肝細胞癌，可用於預測早期AFP陰性肝細胞癌的發生，或者用於製備檢測AFP陰性肝細胞癌的製劑或試劑盒等，用於製備預測早期AFP陰性肝細胞癌的發生的製劑或試劑盒等。
[0066]本發明還提供了用於診斷AFP陰性肝細胞癌的試劑盒，該試劑盒包括:特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑。更佳地，所述的試劑盒還包括:特異性識別AFP蛋白或其編碼基因的試劑；從而可通過先檢測待測樣品中AFP的表達情況來確定AFP陰性的樣品；進一步地檢測DKKl的表達情況；這種檢測手段將使得肝細胞癌的檢測更為準確、可極大地減少誤診漏診。所述的試劑例如是:所述的特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑例如是:特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗DKKl蛋白的抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)。所述的特異性識別AFP蛋白或其編碼基因的試劑例如是:特異性擴增AFP蛋白的編碼基因的引物；或特異性識別AFP蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或特異性抗AFP蛋白的抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)。
[0067]所述的試劑盒中還可含有:核酸抽提試劑(如核酸抽提液)；和/或聚合酶鏈反應試劑(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印跡試劑；和/或酶鏈免疫反應試劑(如顯色液或雜交液)。
[0068]作為一種優選方式，所述的試劑盒中還可含有:用於免疫化學分析的試劑，所述的試劑例如:第二抗體、染色齊U、顯色劑等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等。更具體地，所述的試劑盒可以是一種基於酶聯免疫反應(ELISA)技術的試劑盒，用於檢測AFP陰性肝細胞癌或預測早期AFP陰性肝細胞癌的發生。ELISA技術以及基於該技術的檢測試劑對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。
[0069]作為另一種優選方式，所述的試劑盒中還可含有:(A)各種PCR反應用試劑，例如但不限於:Taq酶，PCR緩衝液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各種提取DNA或RNA (即製備PCR反應模板)所需的試劑，例如但不限於氯仿、異戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的試劑盒。
[0070]所述的特異性識別DKKl蛋白或其編碼基因的試劑、或特異性識別AFPl蛋白或其編碼基因的試劑也可固定於試紙上，製備成免疫膠體金試紙或類似檢測材料。
[0071]此外，所述的試劑盒中還可含有本發明的試劑盒的使用說明書和/或標準操作程序。
[0072]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0073]1、材料和方法
[0074]1、肝組織標本及相應血清收集
[0075]肝組織標本共28例，其中正常人肝組織4例，來自復旦大學肝癌研究所肝外科肝移植捐贈者；肝硬化患者肝組織8例，來自蘇州大學第一附屬醫院感染科肝硬化活檢患者；肝細胞癌患者肝癌組織16例(其中8例患者血清AFP ( 20ng/ml，8例AFP>20ng/ml)，來自復旦大學肝癌研究所肝外科肝癌手術切除患者。並同時收集其相應血清28例。
[0076]2、RNA 抽提
[0077]用Trizol試劑抽提細胞總RNA,加入Trizol後充分吹打至不粘稠，按每毫升Trizol加200 μ I氯仿,劇烈振蕩15秒後室溫靜置5min ；4°C, 10, OOOrpm高速離心15min ；小心將無色上層水相移入一新的RNase-Free的離心管中，按每毫升Trizol體積加500 μ I異丙醇，室溫靜置IOmin, 4°C, 10, OOOrpm離心IOmin ;棄上清,75%酒精(按每毫升Trizol至少用lml75%酒精)洗漆，4°C,8，OOOrpm離心IOmin,棄上清；室溫乾燥RNA沉澱5_10min(勿使RNA完全乾燥)，用RNase-Free的H2O於55_60°C溶解lOmin，立即至於冰上。分光光度計法定量並檢測純度，取少量總RNA進行甲醛變性電泳，檢查RNA完整性。
[0078]3、逆轉錄
`[0079]逆轉錄反應體系:按20 μ I反應體積、細胞總RNA I μ g量(表1)進行。
[0080]表1、逆轉錄反應體系
[0081]
__WU_
5 X PrimeScriptlM Buffer4 μ!
Random 6 primers (100 μΜ)I μ!
PrimeScriptINl RT Enzyme Mix II μ!
Oligo dT Primer (50 μΜ)I μ].(? RNAI ng
_RNase Free CidH2Q_加節 20 μ I_
[0082]反應條件:37°C 45min(反轉錄反應)，85°C 5sec(反轉錄酶的失活反應)，4°C保存。可加入ddH20稀釋40倍備用。
[0083]4、半定量 PCR
[0084]以稀釋後的cDNA模板進行半定量PCR擴增，PCR反應體系如表2。
[0085]表2.半定量PCR反應體系
[0086]
【權利要求】
1.DKKl蛋白或其編碼基因在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑中的用途。
2.DKKl在製備甲胎蛋白陰性肝細胞癌的診斷試劑盒中的用途。
3.如權利要求1或2所述的用途，其特徵在於，所述的診斷試劑選自: 特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或 特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或 特異性抗DKKl蛋白的抗體。
4.如權利要求3所述的用途，其特徵在於，所述的引物是引物對，核苷酸序列如SEQIDNO:1 和 SEQ ID NO: 2 所示。
5.一種用於測定甲胎蛋白陰性肝細胞癌的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒中含有: (1)檢測甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑；和 (2)檢測DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的檢測甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑選自: 特異性擴增甲胎蛋白的編碼基因的引物；或 特異性識別甲胎蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或 特異性抗甲胎蛋白的抗體。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述的檢測DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量的診斷試劑選自: 特異性擴增DKKl蛋白的編碼基因的引物；或 特異性識別DKKl蛋白的編碼基因或其轉錄本的探針；或 特異性抗DKKl蛋白的抗體。
8.如權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，其中還包括: 核酸抽提試劑；和/或 聚合酶鏈反應試劑；和/或 蛋白免疫印跡試劑；和/或 酶鏈免疫反應試劑。
9.一種測定甲胎蛋白陰性肝細胞癌的方法，其特徵在於，所述方法包括: (a)檢測待測樣品中甲胎蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量；和 (b)檢測待測樣品中的DKKl蛋白或其編碼基因的表達情況或表達量，當甲胎蛋白檢測為陰性時，若檢測為DKKl陽性，則該待測樣品的提供者為肝細胞癌高危。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，使用權利要求5所述的試劑盒進行測定。
【文檔編號】G01N33/574GK103487581SQ201210190024
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月8日 優先權日:2012年6月8日
【發明者】覃文新, 沈秋瑾, 顧健人, 楊勝利 申請人:上海市腫瘤研究所