一種從除蟲菊中提取的活性物及應用的製作方法
2023-08-13 06:37:51
專利名稱：一種從除蟲菊中提取的活性物及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從除蟲菊中提取的活性物及其應用，屬生物農藥技術領域。
背景技術：
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是世界松林的惡性疫病原，由該線蟲引起的松材線蟲病能造成松林成片枯死，被稱為松樹的「癌症」。該病發病期短、病樹死亡快、易傳播、難防治。目前對松材線蟲的防治主要包括化學防治、抗病育種、防治傳媒昆蟲天牛等，但效果都不明顯或有局限性。因此，研究開發高效低毒的殺松材線蟲(B.xylophilus)劑受到普遍的關注。植物是產生活性天然產物的主要源泉之一，從植物中尋找具有對松材線蟲(B.xylophilus)有毒殺活性的天然代謝產物成為線蟲生物防治研究的重點之一。
除蟲菊(Chrysanthemun cinerariifolium)屬於雙子葉植物綱(Dicotyledoneae)、菊目(Astcrales)、菊科(Asteraceae)、菊屬(Chrysanthemum)，是傳統殺蟲植物之一。因其對人畜安全，對植物無藥害，對環境無汙染而受到市場歡迎。除蟲菊(C.cineraefolium)是多年生草本植物，適應性強，對土壤要求不嚴，一般涼爽乾燥通風的中性或微酸性土壤均適合種植。我國雲南已發展成為世界除蟲菊主產區之一，天然除蟲菊產業在我國迅速發展，其產品逐漸進入殺蟲劑市場，並倍受矚目。但到目前為止，還沒有除蟲菊(C.cinerariifolium)對松材線蟲(B.ylophilus)具有毒殺活性的報導。除蟲菊(C.cineraefolium)主要包括紅花除蟲菊(Pyrethrum coccineum)和白花除蟲菊(Pyrethrum cinerariifolium)，其中白花除蟲菊(P.cinerariifolium)殺蟲效力最大。
發明內容
本發明的目的是從白花除蟲菊(Pyrethrum cinerariifolium)中製備具有強抑制松材線蟲(B.xylophilus)作用的活性提取物，用於開發高效低毒殺松材線蟲(B.xylophilus)的生物製劑。
本發明是這樣實現的1、製備活性提取物
(1)樣品的採集和預處理本實驗使用的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)採自中國科學院昆明植物研究所植物園內。將採集到的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)全株用自來水衝洗，把根部泥土及莖、葉上的塵土洗乾淨，置於50℃烘箱中烘乾備用；(2)粉碎將烘乾的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)莖、根剪成0.5cm長的小段，葉用手粉碎，混勻；(3)裝瓶浸泡分別取30g粉碎後的白花除蟲菊裝於250ml三角瓶中；其中兩瓶分別加入200ml 80％乙醇進行提取，另外兩瓶分別加入200ml 100％甲醇進行提取；對兩種溶劑分別提取的樣品進行兩種處理；其中將一瓶用80％乙醇提取的樣品和一瓶用100％甲醇提取的樣品放在50℃水浴鍋中靜置30小時；另外兩瓶在室溫下靜置72小時；(4)濃縮溶解將上述不同條件下處理後的樣品浸提液分別過濾，在50℃的溫度下濃縮後即為白花除蟲菊(P.cinerariifolium)的活性提取物；用100％甲醇溶解樣品，定量到0.1g/ml，放入冰箱內備用。
2、對照實驗由於植物樣品經過有機溶劑浸泡濃縮後均用甲醇溶解定量並測定活性，所以用未加白花除蟲菊(P.cinerariifolium)提取物、含有5％和10％兩種甲醇濃度(體積比)的線蟲懸浮液為參考進行對照實驗。
3、製備試驗用的松材線蟲(B.xylophilus)將真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接種到馬鈴薯培養基(馬鈴薯200.0g，葡萄糖20g，瓊脂18-20g，水1000ml)平板上，25℃培養至長滿平板，接入一塊帶有松材線蟲(B.xylophilus)的培養基，25℃下培養至菌絲消失，培養基表面有光澤即為線蟲長滿平板，放入4℃冰箱中備用。使用時將載有線蟲的培養基挑出，用擦鏡紙包裹培養基，放入盛有無菌水的乾淨平板中將線蟲洗出，調整線蟲懸浮液的濃度在100條/ml備用。
4、活性測定方法用兩種濃度的提取物分別做活性測定取1.9ml松材線蟲(B.xylophilus)懸浮液和100ul白花除蟲菊(P.cinerariifolium)提取物(0.1g/ml)加到直徑為6cm的培養皿中，此時活性提取物濃度為5mg/ml，輕輕混勻後將培養皿放於室溫下靜置。在解剖鏡下隨機選擇5-7個視野，定時於12小時、24小時、48小時和72小時分別進行觀察，計數死蟲數(以線蟲僵直不動作為標準，輔以機械刺激，如針尖挑刺等)和總線蟲數；另取1.8ml松材線蟲(B.xylophilus)懸浮液和200ul白花除蟲菊(P.cinerariifolium)提取物(0.1g/ml)加到直徑為6cm的培養皿中，此時提取物濃度為10mg/ml，其他實驗方法與5mg/ml濃度的提取物的活性測定方法相同，分別統計不同時間內的線蟲死亡率。每個測試樣品設二個重複，計算測試樣品對線蟲的平均致死率，以平均致死率高低評定樣品對線蟲的毒力。同時做含5％和10％兩種濃度甲醇(體積比)的線蟲懸浮液的對照實驗。線蟲死亡率按下面公式計算
本發明的活性提取物具有成本低，高效低毒等優點，可作為製備生物農藥殺線劑應用。
具體實施例方式實施例一250ml三角瓶裝入30g白花除蟲菊(P.cinerariifolium)烘乾樣品，80％乙醇浸泡，室溫下靜置72h，將浸泡液過濾後，在不高於50℃的溫度下濃縮至衡重，稱量，用甲醇溶解樣品，定量到0.1g/ml，按照上述的實驗方法做5mg/ml濃度和10mg/ml濃度的提取物對松材線蟲(B.xylophilus)的毒殺活性，並分別用相應濃度的有機溶劑作為對照，結果見表1。
表1 室溫靜置時80％乙醇提取物對松材線蟲的致死率(％)
結果表明本發明的白花除蟲菊(P.cineraefolium)活性提取物對松材線蟲(B.xylophilus)有較高的毒殺效果，其80％乙醇提取物對線蟲具有強的抑制作用，48小時達到90.5％(10mg/ml提取物濃度)和55.71％(5mg/ml提取物濃度)。對照說明，有機溶劑對松材線蟲(B.xylophilus)有一定的影響，但致死率在相同時間、相同濃度條件下顯著低於白花除蟲菊(P.cinerariifolium)活性提取物，說明本發明的活性提取物對松材線蟲(B.xylophilus)有較強的毒殺效果。
實施例二基本同實施例一，不同之處是用於提取的有機溶劑為100％甲醇；250ml三角瓶裝入30g白花除蟲菊(P.cinerariifolium)烘乾樣品，甲醇浸泡，室溫下靜置72h，過濾濃縮定量(0.1g/ml)處理後得到的有機溶劑提取物作為測試樣品。活性結果見表2，有機溶劑對照結果見表1。
表2 室溫靜置時100％甲醇提取物對松材線蟲的致死率(％)
結果表明本發明的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)活性提取物對松材線蟲(B.xylophilus)有較高的毒殺作用，其甲醇提取物對線蟲具有較強的抑制作用，48小時達到81.78％(10mg/ml提取物濃度)，72小時達到71.23％(5mg/ml提取物濃度)和97.77％(10mg/ml提取物濃度)。
實施例三基本同實施例一，不同之處是浸泡時的條件是50℃水浴；250ml三角瓶裝入30g白花除蟲菊(P.cinerariifolium)烘乾樣品，80％乙醇浸泡，50℃水浴靜置48h，過濾濃縮定量(0.1g/ml)處理後得到的有機溶劑提取物作為測試樣品。活性結果見表3，有機溶劑對照結果見表1。
表3 50℃水浴提取時80％乙醇提取物對松材線蟲的致死率(％)
結果表明本發明的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)活性提取物對松材線蟲(B.xylophilus)有良好的毒殺作用，48小時達到98.32％(10mg/ml提取物濃度)，72小時達到74.65％(5mg/ml提取物濃度)和100％(10mg/ml提取物濃度)。
實施例四基本同實施例一，不同之處是有機溶劑是100％甲醇，浸泡條件是50℃水浴；250ml三角瓶裝入30g白花除蟲菊(P.cinerariifolium)烘乾樣品，甲醇浸泡，50℃水浴靜置48h，過濾濃縮定量(0.1g/ml)處理後得到的有機溶劑提取物作為測試樣品。活性結果見表4，有機溶劑對照結果見表1。
表4 50℃水浴提取時100％甲醇提取物對松材線蟲的致死率(％)
結果表明本發明的白花除蟲菊(P.cinerariifolium)活性提取物對松材線蟲(B.xylophilus)有良好的毒殺作用，48小時達到60.81％(5mg/ml提取物濃度)和97.18％(10mg/ml提取物濃度)，72小時達到73.91％(5mg/ml提取物濃度)和100％(10mg/ml提取物濃度)。
權利要求
1.一種從除蟲菊中提取的活性物質，其特徵在於該活性物由下列步驟得到a.將採集到的白花除蟲菊全株用自來水衝洗乾淨，置於50℃烘箱中烘乾備用；b.將烘乾的白花除蟲菊莖、根剪成0.5cm長的小段，葉用手粉碎，混勻；c.分別取30g粉碎後的白花除蟲菊裝於250ml三角瓶中；其中兩瓶分別加入200ml80％乙醇進行提取，另外兩瓶分別加入200ml 100％甲醇進行提取；d.對兩種溶劑分別提取的樣品進行兩種處理；其中將一瓶用80％乙醇提取的樣品和一瓶用100％甲醇提取的樣品放在50℃水浴鍋中靜置30小時；另外兩瓶在室溫下靜置72小時；e.將上述不同條件下處理後的樣品浸提液分別過濾，在50℃的溫度下濃縮後即為白花除蟲菊(P.cinerariifolium)的活性提取物；用100％甲醇溶解樣品，定量到0.1g/ml。
2.權利要求1所述活性物質應用，其特徵在於該活性物質作為製備殺松材線蟲B.xylophilus藥物的應用。
全文摘要
本發明涉及一種從除蟲菊中提取的活性物及其應用，屬生物農藥技術領域。由下列步驟得到a.將採集到的白花除蟲菊全株用水洗淨，置於50℃烘箱中烘乾；b.將烘乾的白花除蟲菊莖、根葉粉碎並混勻；c.分別取30g粉碎後的白花除蟲菊裝於250ml三角瓶中；其中兩瓶分別加入200ml 80％乙醇進行提取，另外兩瓶分別加入200ml 100％甲醇進行提取；d.對兩種溶劑分別提取的樣品進行兩種處理；其中將一瓶用80％乙醇提取的樣品和一瓶用100％甲醇提取的樣品放在50℃水浴鍋中靜置30小時；另外兩瓶在室溫下靜置72小時；e.將上述不同條件下處理後的樣品浸提液分別過濾，在50℃的溫度下濃縮後即為白花除蟲菊的活性提取物。本發明具有成本低，高效低毒等優點，可作為製備生物農藥殺線劑應用。
文檔編號A01P5/00GK1907038SQ20061004861
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月11日 優先權日2006年8月11日
發明者張克勤, 王興彪, 李國紅 申請人:雲南大學