腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及檢測方法
2023-07-10 03:58:11
專利名稱：：腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，公開了一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：手足口病(Hand,footandmouthdisease，HFMD)是由腸道病毒(Enterovirus,EV)引起的傳染病，多發生於5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等併發症。個別重症患兒病情發展快，導致死亡。引發手足口病的腸道病毒有20多種，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以柯薩奇病毒A16型(Coxsackieviruses16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)最為常見。腸道病毒感染的特異性診斷方法有三種，即病毒分離鑑定、血清學檢測和分子生物學技術。病毒的分離培養和血清學方法，繁雜費時，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。分子生物學的進展開拓了腸道病毒的快速診斷技術，特別是PCR技術，由於其檢測材料用量少、快速、靈敏度高且具有很高的特異性，在病毒感染的診斷中發揮越來越多的重要作用。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術已成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段。傳統的RT-PCR技術需要兩步反應，整個過程需要6-8小時，時間消耗大，不能滿足爆發時期的檢測需求；另外，該技術還存在交叉汙染的風險，檢測實驗室在一段時間之後不可避免的出現假陽性結果。實時螢光定量PCR技術，是在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR汙染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。
發明內容本發明的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供了一種利用實時螢光定量PCR技術並具有特異、靈敏、快速、操作簡便的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及檢測方法。為了實現上述目的本發明採取的技術方案是提供一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，該試劑盒含有(l).PCR反應酶，其中包括熱啟動Taq酶、MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑；(2).PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10XPCRBuffer、腸道病毒71型正向引物、腸道病毒71型反向引物、腸道病毒71型探針；腸道病毒71型正向弓l物序列如序列表中SEQIDNO.1所示5'-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC--3'，腸道病毒71型反向引物序列如序列表中SEQIDNO.2所示5'"GAGCMTTGTGGGACRAYTTC-3'，腸道病毒71型探針序列如序列表中SEQIDNO.3所示5'-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3';(3).陰性質控品，為DEPC處理水；(4).陽性質控品，為採用T7RNA聚合酶製備的體外轉錄RNA。3所述探針5'端標記FAM(螢光報告基團)，3'端標記ECLIPSE(螢光淬滅基團)。所述PCR反應酶中各組分含量的配比為濃度為5U/L的熱啟動Taq酶用量0.25iiL;濃度為200U/iiL的MLV逆轉錄酶用量0.5yL;40U/yL的RNA酶抑制劑的用量0.25iiL;所述PCR反應液中各組分含量的配比為DEPC處理水用量16iiL;2.5mMdNTPs用量2iiL;10XPCRBuffer用量2.5iiL;10iiM引物混合溶液用量liiL;10iiM探針用量0.5iiL。本發明還提供一種利用上述試劑盒檢測腸道病毒71型核酸的檢測方法，包括下列步驟(l)RNA提取採用商業化病毒RNA提取試劑盒如QIAampViralRNAMiniKit提取；(2)PCRMix配製及分裝按22iiL:1yL的比例，分別吸取PCR反應液和PCR反應酶，充分混勻，12，000rpm離心10s，配製成PCRMix，取出PCR反應管，給每個反應管中加入23ii上述PCRMix;每次檢測需要設一個陽性質控PCR反應管和一個陰性質控PCR反應管，其餘為被測樣品的PCR反應管；(3)加樣向上述的反應管中分別加入提取的樣本RNA，陽性質控品及陰性質控品2iiL，12，OOOrpm離心10s;(4)PCR擴增將各反應管放入螢光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記螢光基團種類、樣本名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；42°C45min;95°C2min;95°C10s，60°C30s;40個循環；在反應程序的第三步的終了讀取螢光值；(5)分析判斷Ct值小於等於35的為陽性；Ct值大於37的為陰性；Ct值在35_37之間的為灰區，需要進行重複試驗，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽性，否則為陰性。本發明的有益效果是本發明採用實時螢光定量PCR技術檢測腸道病毒71型核酸序列的方法，具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優點。圖1是實施例1實驗結果圖；圖2是實施例2實驗結果圖。具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，但不作為對本發明的限定。本發明提供了一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，該試劑盒含有PCR反應酶，其中包括熱啟動Taq酶、MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑；PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10XPCRBuffer、腸道病毒71型正向引物、腸道病毒71型反向引物、腸道病毒71型探針；陰性質控品，為DEPC處理水；陽性質控品，為採用T7RNA聚合酶製備的體外轉錄RNA。試劑盒的製造41.試齊[J本試劑盒製造過程中所用的試劑主要購自寶生物工程(大連)有限公司(Takara)，其餘購自普洛麥格公司、北京全式金生物技術有限公司、北京化工廠。2.PCR反應液製備(1)引物及探針設計與合成從Genbank上下載國內不同年份和地區的EV71全基因組序列，通過生物學軟體AlignX進行多序列比對，在VPl基因區選擇一段保守序列，依據引物和探針設計原則，採用PrimerExpress軟體設計EV71特異性引物及探針。設計結果如下表所示tableseeoriginaldocumentpage5注formulaseeoriginaldocumentpage5表中F:forward，正向；EV71-F表示腸道病毒71型正向引物。R:reverse，反向；EV71-R表示腸道病毒71型反向引物。P:probe，探針；EV71-P表示腸道病毒71型探針。FAM:螢光報告基團。ECLIPSE:螢光淬滅基團。按照上表的設計結果，分別委託Invitrogen公司和Takara公司合成引物和探針。(2)引物及探針的溶解取凍存的腸道病毒71型引物(EV71-F和EV71-R)、探針(EV71-P)乾粉管，12，000rpm離心2min，按照引物探針溶解說明書加入TEBuffer將乾粉溶解，使探針濃度為10yM，兩種引物濃度各為20iiM，等量取兩種引物溶液到1.5mLEP管中混合，配製成10i!M引物混合溶液，振蕩混勻離心，備用；(3)PCR反應液配製按下述比例DEPC處理水16iiL、2.5mMdNTPs2iiL、10XPCRBuffer2.5iiL、10iiM引物混合溶液1yL和10iiM探針0.5iiL，配製成PCR反應液。3.PCR反應酶製備濃度為5U/iiL的熱啟動Taq酶0.25iiL、濃度為200U/iiL的MLV逆轉錄酶0.5iiL和40U/iiL的RNA酶抑制劑的0.25iiL混合製備成PCR反應酶。4.陰性質控品製備陰性質控品的作用是用來防止因汙染而產生的假陽性。本發明採用DEPC處理水作為陰性質控品，對整個實驗過程進行監控。5.陽性質控品製備陽性質控品的作用是監控試劑是否失效及性能是否下降。本發明採用腸道病毒71型體外轉錄的RNA作為陽性質控品。按照本
技術領域：
中常用的分子克隆技術，其製備方法如下(1)重組質粒的構建和提取首先在EV71-F、EV-71-R的外側設計以下引物對腸道病毒71型陽性菌株的基因組DNA序列進行PCR擴增上遊引物如序列表中SEQIDNO:5所示ATATAATAGCACTAGCGGCAGC下遊引物如序列表中SEQIDNO:6所示TACAAGATTTGCCCAATCAAT然後採用博邁德《多功能DNA純化回收試劑盒》回收PCR產物作為目的片段；採用全式金公司的pEAZY-T3CloningVector試劑盒，將上述目的片段插入含有T7啟動子的載體pEAZY-T3中，構建重組質粒，通過轉化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質粒的陽性克隆菌；該陽性克隆菌經過擴大培養後，用博邁德《高純度質粒提取試劑盒》提取培養菌液中的質粒並用紫外分光光度計進行定量。(2)體外轉錄RNA質控品的製備用Takara公司的SACI酶對上述提取的質粒進行酶切使其線性化後，採用Takara公司的T7RNA聚合酶對上述酶切反應液進行體外轉錄，所得的體外轉錄反應液用Takara公司的DNaseI進行消化以除去其中的質粒DNA，隨後採用全式金公司的TransZol提取該消化液中的RNA，此即體外轉錄RNA;採用紫外分光光度計對其進行定量後，將其稀釋到濃度為105拷貝/iiL作為體外轉錄RNA質控品。重組質粒中插入的腸道病毒71型特異性目的片段序列如序列表中SEQIDNO.4實施例1用本發明的試劑盒在ABI7300螢光定量PCR儀上檢測腸道病毒71型核酸的方法(l)RNA提取採用QIAampViralRNAMiniKit提取，(2)PCRMix配製按22iiL:1PL的比例，分別吸取PCR反應液和PCR反應酶，充分混勻，12，000rpm離心lOs，取出PCR反應管，其中一個為陽性質控品反應管，一個為陰性質控品反應管，另一個為被測樣品反應管，給每個反應管中加入23L上述配製的PCRMix;PCRMix配製方法如下表所示tableseeoriginaldocumentpage7(3)加樣向3個反應管中分別加入提取的樣本RNA2yL，陽性質控品2yL及陰性質控品2iiL，混勻後12，OOOrpm離心10s;(4)PCR擴增將各反應管放入螢光定量PCR儀的反應槽內，按對應順序設置未知標本、陽性質控品品和陰性質控品，並設置樣品名稱、標記螢光基團種類，按下表設置反應程序進行PCR擴增。tableseeoriginaldocumentpage7注報告基團設為FAM，淬滅基團設為none,PassiveReference設為none;在反應程序的第三步的終了讀取螢光值。(5)質控標準陰性質控品陰性；陽性質控品陽性且Ct值小於35。以上條件應同時滿足，否則，此次試驗視為無效，全部試驗應重新進行。(6)分析判斷Ct值小於等於35的為陽性；Ct值大於37的為陰性；Ct值在35_37之間的為灰區，需要進行重複試驗，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽性，否則為陰性。本發明實施例1的試驗結果如圖1所示，檢測結果為陽性，Ct值為32.28。本發明實施例所用的試劑及材料分別如下(1)試劑QIAampViralRNAMiniKit,購自德國QIAGEN公司;腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，本發明產品。(2)材料移液器槍頭0.2mL、0.5mL、1.5mL，購自AXYGEN公司；PCR反應管0.2mL薄壁管，購自AXYGEN公司。(3)儀器ABI7300螢光定量PCR儀，購自AB公司。實施例2用本發明的試劑盒按照實施例1的方法檢測未知樣本。未知樣本來源XX醫院病人待測定的樣品，本發明實施例2的試驗結果如圖2所示，檢測結果為陽性，Ct值為23.87。以上所述的實施例，只是本發明較優選的具體實施方式的一種，本領域的技術人員在本發明技術方案範圍內進行的通常變化和替換都應包含在本發明的保護範圍內。權利要求一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒含有(1).PCR反應酶，其中包括熱啟動Taq酶、MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑；(2).PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCRBuffer、腸道病毒71型正向引物、腸道病毒71型反向引物、腸道病毒71型探針；腸道病毒71型正向引物序列為5』-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC-3』，腸道病毒71型反向引物序列為5』-GAGCAATTGTGGGACRAYTTC-3』，腸道病毒71型探針序列為5』-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3』；(3).陰性質控品，為DEPC處理水；(4).陽性質控品，為採用T7RNA聚合酶製備的體外轉錄RNA。2.根據權利要求1所述的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，其特徵在於所述探針5'端標記FAM螢光報告基團，3'端標記ECLIPSE螢光淬滅基團。3.—種利用權利要求1或2所述的試劑盒檢測腸道病毒71型核酸的檢測方法，其特徵在於，包括下列步驟(1)RNA提取採用商業化病毒RNA提取試劑盒提取；(2)PCRMix配製及分裝按22iiL:1PL的比例，分別吸取PCR反應液和PCR反應酶，充分混勻，12，OOOrpm離心10s，配製成PCRMix，取出PCR反應管，給每個PCR反應管中加入23iiL上述配製的PCRMix;(3)加樣向上述的PCR反應管中分別加入提取的樣本RNA，陽性質控品及陰性質控品2iiL，12，000rpm離心10s;(4)PCR擴增將各反應管放入螢光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記螢光基團種類、樣本名稱及類型，按下列條件進行PCR擴增；`42°C45min;95°C2min;`95°C10s，6(TC30s;40個循環；在反應程序的第三步的終了讀取螢光值；(5)分析判斷Ct值小於等於35的為陽性；Ct值大於37的為陰性；Ct值在35-37之間的為灰區，需要進行重複試驗，如果Ct值仍然在35-37之間則判斷為陽性，否則為陰性。全文摘要本發明公開了一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒含有PCR反應酶，其中包括熱啟動Taq酶、MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑；PCR反應液，其中包括DEPC處理水、dNTPs、10×PCRBuffer、腸道病毒71型正向引物、腸道病毒71型反向引物、腸道病毒71型探針；腸道病毒71型正向引物序列為5′-TAGCTTTGATGCAGAGTTGC-3′，腸道病毒71型反向引物序列為5′-GAGCAATTGTGGGACRAYTTC-3′，腸道病毒71型探針序列為5′-TTTGTTGCGTGCACACCCATTC-3′；陰性質控品，為DEPC處理水；陽性質控品，為製備的體外轉錄RNA。本發明採用實時螢光定量PCR技術檢測腸道病毒71型核酸序列的方法，具有特異、靈敏、快速、操作簡便的優點。文檔編號G01N21/64GK101724716SQ201010105088公開日2010年6月9日申請日期2010年2月2日優先權日2010年2月2日發明者劉自誠,周騁,姚志建,王維,逄鍵濤申請人:北京愛普益生物科技有限公司