一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡及其製備方法
2023-07-10 12:49:56 2
專利名稱：一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫學中的腫瘤治療學，涉及腫瘤超聲治療領域中的一種新型治療型超聲微泡，特別涉及其組成成分和製備方法。
背景技術：
隨著對微泡超聲造影劑的深入研究，其潛在的非創傷性治療作用引人注目，主要表現在以下兩方面。首先，各種微泡(尤其是脂膜微泡，其結構類似脂質體)是一種良好的藥物載體，容易與基因、蛋白類或者脂溶性藥物結合，如Unger等用脂質微泡包裹攜帶抗腫瘤藥物紫杉醇(Unger EC，et al.InvestRadiol，1998，33886-892)、Porter等用白蛋白微泡PESDA攜帶反義寡核酐酸等(Tsutsui JM，Cardiovascular Ultrasound 2004，223)。用於治療的超聲微泡有多種類型，根據治療的目的不同所攜帶的藥物不同。其次，微泡作為一種十分有效的空化核，容易誘導超聲空化發生，空化發生在生物體內可以產生「聲孔效應」，引起鄰近細胞被「超聲打孔」，導致細胞膜通透性增高，利於藥物釋放。當組織血管被高濃度微泡灌注時，空化核密度大量增加，空化閾值降低，低能量超聲作用也可能引起強烈的空化效應，導致微小血管機械性破裂出血以及血栓形成。
利用超聲能量非創傷性治療腫瘤一直是業界追求的目標。用物理方法阻斷腫瘤微循環的研究工作前景誘人，它主要利用超聲波與微泡相互作用所產生的空化效應機械性損傷血管內皮細胞，使基底膜暴露，從而啟動內源性凝血系統，導致腫瘤微循環栓塞，阻斷腫瘤血供。與正常微血管不同，腫瘤微血管生長迅速導致結構紊亂，表現為管壁缺乏肌層，壁薄而脆、通透性高，所以更容易受到空化損傷。毫無疑問，在超聲聯合微泡損傷腫瘤血管內皮細胞的基礎上，引入凝血因子，可以進一步加快內源性凝血，促進腫瘤微循環栓塞。美國Hwang等認為超聲結合微泡導致內皮細胞損傷是凝血連鎖反應中的一個重要步驟。他們用兔的耳緣血管模型證實，在脈衝式聚焦超聲照射下，微泡空化能損傷靜脈內皮細胞，促進血小板黏附而加速凝血反應，當同時輸入小劑量的凝血酶，很快導致血管內血栓形成；而對照組無微泡，僅為超聲照射加相同劑量凝血酶，則未形成血栓(Hwang，et al.Ultrasound Med.Biol.2005，31553-564)。國內東南大學吳魏等用20KHz的低頻超聲聯合5ml利聲顯微泡造影劑(Levovist)輻照正常家兔肝臟，可致照射野大約90％的微血管栓塞，原因可能是空化效應引起血管內皮損傷，促發內外源性凝血，而且微血管內血流速緩慢，容易形成血栓。Skyba等觀察了超聲波破壞鼠斜方肌微血管內微泡的生物效應，在輸入微泡前，超聲照射並不引起微血管的破壞；同樣，輸入微泡不使用超聲照射也不引起微血管破壞。而在輸入Optison、DMP-115、Imagent、SonoVue等任意一種造影劑經超聲照射後，直徑≤7μm的微血管發生了損傷，紅細胞外滲於組織間隙，同時鄰近組織內還發現了死亡細胞。這種效應與使用的機械指數呈線性相關。Miller等體內實驗研究表明，微泡造影劑在超聲作用下所產生的「聲孔效應」可使毛細血管破壞，引起出血，形成瘀點。這種效應在微泡注射完成後持續發生作用時間達數小時，且與微泡量呈正相關。
但是，他們的基礎研究均基於普通微泡超聲造影劑，在微泡空化時並不能立刻釋放凝血因子，而是依靠循環中的凝血因子在局部被激活後發揮凝血作用。這樣，對腫瘤微循環的栓塞阻斷可能不充分。
基於以上實驗，我們設計將一定量的凝血酶原複合物或者纖維蛋白原等凝血因子與診斷型超聲造影劑微泡相結合，製備出結合凝血因子的治療型微泡，不但能增強超聲空化效應對微血管內皮的「打孔」損傷，而且在損傷腫瘤微血管內皮同時釋放凝血因子，極大加速凝血過程，促進腫瘤微血管血栓形成，從而達到非創傷性治療腫瘤的目的。理論上，結合凝血因子的超聲微泡具有更強的促凝血效應，會導致內皮損傷後血栓迅速形成，優於微泡和凝血因子各自單獨使用。
目前，國內外尚無將凝血因子與超聲微泡相結合，製備成治療型微泡的相關文獻報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，由超聲造影劑微泡攜帶凝血因子，構成結合凝血因子的治療型超聲微泡。本發明還涉及製備所述治療型超聲微泡的方法。
本發明採用的技術方案是將凝血因子與各種超聲微泡結合。所述結合包括凝血因子吸附於微泡表面，或吸附微泡表面和包裹於微泡內。
所述凝血因子為凝血酶原複合物或/和纖維蛋白原。其用量原則上可參照臨床允許的劑量。比如每毫升超聲造影劑微泡混懸液加入5-50mg凝血酶原複合物；或每毫升微泡混懸液加10-80mg纖維蛋白原。所述微泡混懸液即為微泡乳化液，其濃度即為產品已配製好的濃度。
所述超聲造影劑微泡包括脂質超聲造影劑微泡、人血白蛋白超聲造影劑微泡、高分子材料超聲造影劑微泡。所有的微泡為已知的或有文獻報導的。
其中(1)脂質超聲造影劑微泡包括各種用磷脂或磷脂類衍生物作為成膜材料的脂質微泡，例如聲諾維(SonoVue)、Definity、Imagent等。上面所述的磷脂或磷脂類衍生物，例如1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPG)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂酸-鈉鹽(DPPA)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DPPC)等。
(2)人血白蛋白超聲造影劑微泡包括各種用人血白蛋白作為成膜材料的超聲微泡，如Optison等。
(3)高分子材料超聲造影劑微泡包括微泡殼成分中含有各種高分子作為成膜材料的超聲微泡，如POINT Biomedical公司的PBl27、Acusphere公司的AI-700等。上面所述的高分子材料具體包括分子量在3000至10000的聚乙二醇、乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)、氰基丙烯酸酯等。
所述的超聲造影劑微泡的氣體內核成分包括常溫下呈氣態的全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫。
超聲造影劑微泡通過以下具體方法與凝血因子結合(1)超聲造影劑微泡形成前加入將凝血因子與脂質超聲造影劑微泡的成膜材料的脂質混懸液未振蕩成微泡前加入，然後通過機械振蕩法振蕩後即形成含有大量微氣泡的混懸液，其中振蕩頻率為4000～5500次/分，幅度為10～30毫米，時間為30～90秒；振蕩後凝血因子通過靜電直接結合到微泡殼內表面或外表面。
或(2)超聲造影劑微泡形成後加入將製作完成的超聲造影劑微泡混懸液直接與含有凝血因子的溶液混合，再使用旋渦振蕩器或手搖方式使凝血因子充分與微泡混合併結合於微泡外表面。
上述方法(1)主要針對脂質超聲造影劑微泡。在超聲造影劑微泡形成前，將凝血因子溶液(凝血酶原複合物或纖維蛋白原溶液)與脂質混懸液(微泡製備液)混合，盛有以上混合液的西林瓶氣體頭部充滿全氟丙烷或者全氟丁烷氣體，再通過高速機械振蕩，在微泡形成的同時將凝血因子整合在微泡膜上或包裹在微泡殼內。機械振蕩時，將盛有造影劑的西林振蕩瓶置於機械振蕩裝置的夾頭上，按設置好的工作參數進行機械振蕩(水平往復式振蕩，工作頻率≥4500次/分鐘，振動幅度15±1mm，時間45s)，振蕩後即形成整合有凝血因子的脂質氟碳微氣泡的混懸液。
上述方法(2)也可以稱為直接連接法又稱為被動吸附或靜電吸附法，是文獻中採用較多的超聲造影劑微泡與配體的連接方法。以脂質超聲造影劑微泡為例，大分子脂質是一種卵磷脂的衍生物，具有化學雙極性以及疏水端和親水端，在不添加任何外在化學成分的情況下可通過自身離子鍵、物理吸附(範德華力)等方式將配體直接連接到微泡上(圖1)。人血白蛋白微泡和高分子材料微泡表面也存在同樣的情況，採用直接連接法也可以成功結合凝血因子。
在上述方法(1)中，與現有技術相比，區別在於在微泡的製作中加入了凝血因子，而在方法(2)中，直接將已有的微泡產品與凝血因子混合。
本發明治療型超聲微泡在適當的治療超聲作用下，可以促進局部組織微循環血栓形成，可用於腫瘤等疾病治療。該治療型超聲微泡在多種形式的超聲能量(高強度聚焦超聲、脈衝式聚焦超聲或平面超聲)作用下，以增強超聲空化消融腫瘤、超聲熱消融腫瘤或者促進局部微循環血栓形成等方式治療腫瘤。
附圖1為結合了凝血因子的治療型超聲微泡模式圖；附圖2為結合了凝血酶原複合物螢光微泡(x200)鏡下圖；附圖3為流式細胞儀檢測洗滌前(左圖)與洗滌後(右圖)，微泡與FITC-PCC的結合率(橫坐標為波長、縱坐標為計數)；附圖4為纖維蛋白原微泡治療超聲組治療後，照射區腸繫膜微血管栓塞，伊文思藍染色仍呈紅色(黑箭頭)，未照射區血管呈藍色。
具體實施例本發明的技術方案及其效果可以通過實施例進一步說明實施例1本發明治療型微泡的性質評價首先製備脂質混懸液；再將綠色螢光標記的凝血酶原複合物(FITC-PCC)配成10mg/ml的溶解液；然後分三組製備第一組，完成脂超聲造影劑膜微泡的製備(水平往復式機械振蕩，工作頻率≥4500次/分鐘，振動幅度15±1mm，時間45s)；第二組，在脂質混懸液中加入0.5ml FITC-PCC後，用氟碳氣體置換空氣，按相同的工作參數進行機械振蕩45s；第三組，在完成微泡製備後，揭開瓶塞加入0.5ml FITC-PCC，漩渦混合振蕩儀振蕩或手搖1min。上述製備完成後室溫孵育30min，取出一半靜置，另一半採用浮選法洗滌即將造影劑置於離心管中，加入等量的0.9％Nacl，400rpm離心1min(至微泡聚集在液相的頂部)，棄去下清液，重複洗滌兩次。在微泡製備完成後檢測微泡理化性質光學顯微鏡觀察洗滌前後不同組別微泡的形態、大小、分布及穩定性；血球分析儀測定微泡濃度；螢光倒置顯微鏡觀察微泡的形態、大小、分布；流式細胞儀計數50000個微泡，檢測不同組別、洗滌前後FITC-PCC與微泡的結合率。在已知FITC-PCC與微泡可直接連接後，將上述製備步驟中FITC-PCC更換成PCC，完成製備。最後採用等比稀釋法分別製備濃度為40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml的PCC溶液各1ml；然後用全自動凝血儀分別檢測上述不同濃度凝血酶原複合物溶解液中IX因子活性；最後檢測不同組別洗滌前後結合凝血酶原複合物微泡IX因子活性，並與相同濃度凝血酶原複合物溶解液比較。結果①與第一組(空白組)比較，第二組(機械振蕩前加入FITC-PCC)、第三組(機械振蕩後加入FITC-PCC)製備的微泡濃度、粒徑及粒徑分布無明顯變化，但易靜置分層。②螢光顯微鏡觀察洗滌前結合FITC-PCC的各組微泡均能激發出明亮的綠色螢光(圖2)；洗滌後微泡濃度由1010左右降到107左右，微泡螢光亮度由「3級」變為「2級」。③微泡與凝血酶原複合物的結合率洗滌前或洗滌後各組間比較均無明顯差異(P＞0.05)，但洗滌後結合率均值由洗滌前的平均99.4％左右降為88.7％左右(P＜0.05，圖3)。④IX因子凝血活性檢測洗滌前結合凝血酶原複合物的各組微泡均能保持較高活性，與相同濃度的凝血酶原複合物溶液比較無明顯差異(P＞0.05)，各組間亦無明顯差異(P＞0.05)；洗滌後活性均值組間仍無明顯差異(P＞0.05)，但活性明顯下降，由洗滌前的90％左右降為19％左右(P＜0.01)。實際操作中，微泡洗滌過程沒有必要。
上述實驗表明結合到微泡膜上的凝血因子仍然能夠保持較高的活性。
實施例2本發明微泡的治療型栓塞實驗
1.實驗方法用2％戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射，麻醉後將兔仰臥位固定於實驗臺上，建立耳緣靜脈通路，腹部備皮，於中腹部沿腹正中線作8cm切口，開腹沿盲腸游離端所指方向輕輕將一段迴腸及腸繫膜拉出腹外，置於體視顯微鏡下，將顯微鏡調至適宜倍數(×90)，使其清晰顯示腸繫膜微血管內血液流動情況選擇有細小血管走行、脂肪少的腸繫膜區域作為照射區。
2.實驗分組①纖維蛋白原微泡治療超聲組按照0.5ml/kg微泡和0.034g/kg纖維蛋白原的比例將兩者混合，採用本實驗室已成熟運用的直接連接法製備攜帶纖維蛋白原的微泡混懸液，照射前3min配好，經耳緣靜脈團注，共10ml；超聲治療頭用塑料薄膜包裹，與腸繫膜之間有厚約1.5cm的耦合劑層，垂直照射選定區域，照射20s、間隔5s，共10min。照射過程中，避免對腸繫膜產生壓力，並不斷向照射區域加生理鹽水保持耦合。實驗過程對外露腸管及繫膜保溫、保溼。
②單純治療超聲組用10ml生理鹽水代替纖維蛋白原微泡混懸液，餘同①。
③單純纖維蛋白原微泡組超聲治療頭不發射能量，假照10min，餘同①。
④纖維蛋白原治療超聲組靜脈注射僅用纖維蛋白原配成的10ml溶液，餘同①。
3.觀察方法照射後鏡下觀察微血管內血液流動情況，與照射前對比。靜脈推注劑量為50mg/kg濃度為2％過濾滅菌的伊文思藍溶液，3min後肉眼觀察照射區域微血管伊文思藍灌注後染色情況。
4.實驗結果超聲治療儀聲學檢測結果輸出聲功率1.02W，聲強0.3W/cm2。
體視顯微鏡觀察單純治療超聲組、單純纖維蛋白原微泡組和纖維蛋白原治療超聲組照射前腸繫膜微血管內血液流動通暢、迅速，照射後血液流動亦通暢、迅速，未見明顯變化；纖維蛋白原微泡治療超聲組照射前腸繫膜微血管內血液流動通暢、迅速，照射後照射區域血液流動消失，血栓形成，未照射區域血液流動通暢、迅速(表1)。
伊文思藍染色單純治療超聲組、單純纖維蛋白原微泡組和纖維蛋白原治療超聲組靜注伊文思藍後照射區域微血管呈藍色；纖維蛋白原微泡治療超聲組靜注伊文思藍後照射區域微血管伊文思藍染色未見充填，仍呈紅色，未照射區血管呈藍色(圖4)。
表-1不同處理組對腸繫膜微血管的改變
綜上所述，連接了纖維蛋白原的脂質微泡通過超聲空化釋放，有效栓塞了腸繫膜微血管，阻斷了局部微循環。
權利要求
1.一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是包括含氣體內核的超聲造影劑微泡和凝血因子，由凝血因子吸附於超聲造影劑微泡表面，或由凝血因子吸附於微泡表面和包裹在其內構成結合凝血因子的超聲微泡。
2.根據權利要求1所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是超聲造影劑微泡為(1)脂質超聲造影劑微泡；或(2)人血白蛋白超聲造影劑微泡；或(3)高分子材料超聲造影劑微泡。
3.根據權利要求1所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是所述凝血因子為凝血酶原複合物或/和纖維蛋白原。
4.根據權利要求2所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是所述脂質超聲造影劑微泡為各種用磷脂或磷脂類衍生物作為成膜材料的脂質微泡，所述的磷脂或磷脂類衍生物，包括1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-鈉鹽(DPPG)、1，2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DSPC)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂酸-鈉鹽(DPPA)、1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯膽鹼(DPPC)。
5.根據權利要求2所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是所述人血白蛋白超聲造影劑微泡為各種用人血白蛋白作為成膜材料的超聲微泡，包括Optison。
6.根據權利要求2所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是所述高分子材料超聲造影劑微泡為微泡殼成分中含有各種高分子作為成膜材料的超聲微泡，所述的高分子材料具體包括分子量在3000至10000的聚乙二醇、乳酸/羥基乙酸共聚物(PLGA)、氰基丙烯酸酯。
7.根據權利要求1～6所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是所述的超聲微泡的氣體內核成分包括常溫下呈氣態的全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫。
8.根據權利要求1～6所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，其特徵是超聲微泡殼外表面或內表面通過靜電吸附、分子共價或者範德華力方式連接活性凝血因子；其中凝血酶原複合物加入的比例是每毫升微泡混懸液加入5-50mg凝血酶原複合物；或每毫升微泡混懸液加10-80mg纖維蛋白原。
9.一種製備如權利要求1所述的一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡的方法，包括含氣體內核的超聲造影劑；其特徵是含氣體內核的超聲造影劑微泡通過以下具體方法與凝血因子結合(1)微泡形成前加入將凝血因子與脂質微泡的成膜材料的脂質混懸液未振蕩成微泡前加入，然後通過機械振蕩法振蕩後即形成含有大量微氣泡的混懸液，其中振蕩頻率為4000～5500次/分，幅度為10～30毫米，時間為30～90秒；振蕩後凝血因子通過靜電直接結合到含氣體內核的超聲造影劑微泡殼內表面和外表面；或(2)微泡形成後加入將製作完成的微泡混懸液直接與含有凝血因子的溶液混合，再使用旋渦振蕩器或手搖方式使凝血因子充分與微泡混合併結合於含氣體內核的超聲造影劑微泡外表面。
全文摘要
本發明涉及一種用於腫瘤超聲治療的治療型超聲微泡，它包括含氣體內核的超聲造影劑微泡和凝血因子，由凝血因子吸附於超聲造影劑微泡表面，或由凝血因子吸附於微泡表面和包裹在其內構成結合凝血因子的超聲微泡。該治療型超聲微泡在適當的治療超聲作用下，可以促進局部組織微循環血栓形成，可用於腫瘤等疾病治療。該治療型超聲微泡在多種形式的超聲能量(高強度聚焦超聲、脈衝式聚焦超聲或平面超聲)作用下，以增強超聲空化消融腫瘤、超聲熱消融腫瘤或者促進局部微循環血栓形成等方式治療腫瘤。
文檔編號A61K38/16GK1935257SQ20061009507
公開日2007年3月28日 申請日期2006年8月30日 優先權日2006年8月30日
發明者劉政, 譚開彬, 楊莉, 高雲華, 劉平, 李秋穎 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院