GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法與應用的製作方法
2023-07-10 04:12:06 1
專利名稱：GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種GeXP(GenomeLab eXpress Profiling) 多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法與應用。
背景技術：
隨著轉基因作物品種日益增多和全球種植面積不斷擴大，轉基因食品已成為全球食品消費市場的重要組成部分。轉基因食品的安全性尤其是食用安全性，也日益引起人們的關切。隨著國際貿易和轉基因技術的發展，歐盟和美國、日本等國家先後出臺了相應的法律和管理方法，對轉基因食品實行強制標識或自願標識。我國於2001年5月23日頒布《農業轉基因生物安全管理條例》，2002年3月20日開始實行的《農業轉基因生物標識管理辦法》規定，國家對農業轉基因生物實行檢驗檢疫和標識制度。可以看到，對轉基因食品的檢測已經成為必然的世界趨勢。因此我們必須加強對轉基因食品檢測技術的深入研究。一些外源基因常作為轉基因作物的篩選檢測基因，如5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)，來源於桿菌草丁膦乙醯轉移酶基因(BAR)，草丁膦乙醯轉移酶基因(PAT)，玄參花葉病毒35S 啟動子(FMV35S)，花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35S)，胭脂鹼合成酶基因終止子(NOS)。目前，國內外對轉基因農作物檢測技術種類較多，大體分為兩種一是檢測是否含有外源的蛋白質，即外源基因的表達產物，主要採用ELISA法；二是檢測是否含有外源基因 (DNA)，主要有基因晶片法和PCR檢測法，其中PCR技術較為成熟，具有快速、簡便、靈敏等特點。目前，國內外許多科研單位及相關機構將單重PCR技術應用於轉基因作物檢測。單重 PCR技術的主要局限性在於通量不高，這是由於單基因PCR每次只能檢測一個基因或轉基因元件，如果要同時檢測轉基因植物中的外源基因、轉基因元件或鑑定外源基因、轉基因元件的種類等，需要做多個單PCR，而且需要知道待檢片段的序列信息，不僅操作繁瑣，費時且成本較高，而且在實際應用中轉基因元件種類多，序列不確定，難以逐一檢測和鑑定。多重 PCR在一定程度上解決了上述問題，可以一次檢測和鑑定多個外源基因或轉基因元件，提高了檢測效率。但多重PCR方法本身還存在一些普遍的問題，如特異性和靈敏度不高；由於在多重PCR反應體系中同時存在幾對引物，使得形成複雜引物二聚體的概率大大增加，反應動力性也極其複雜；擴增中某幾個特定片段優先擴增，其他片段不能擴增出；同時檢測的目的基因數量一般小於10個等(多在3-5個基因)，使得多重PCR還達不到高通量快速檢測和分析的目標。
發明內容
本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法。該方法能同時檢測轉植物中的多種轉基因成分。本發明的另一目的在於提供所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，包括以下步驟(1)設計外源基因和內源基因的引物，下述引物均為5』 -3』 ；外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPQ的上下遊引物分別為EPSPS-F :AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTTEPSPS-R :GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA ；外源基因花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35Q的上下遊引物分別為CaMV35s-F :AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCACaMV35s-R :GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA ；外源基因胭脂鹼合成酶基因終止子(NOS)的上下遊引物分別為NOS-F :AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCANOS-R :GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA ；外源基因草丁膦乙醯轉移酶基因(BAR)(來源於桿菌Bacillus amyloliquefaciens)的上下遊引物分別為Bar-F :AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACTBar-R :GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG ；外源基因草丁膦乙醯轉移酶基因(PAT)的上下遊引物分別為PAT-F :AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAGPAT-R :GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT ；外源基因玄參花葉病毒35S啟動子(FMV35S)的上下遊引物分別為FMV35S-F :AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTAFMV35S-R :GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT ；內源基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)的上下遊引物分別為PEP-F :AGGTGACACTATAGAATAGCTAGTGTAGACCAGTTCTTGPEP-R :GTACGACTCACTATAGGGACACTCTTGTCTCTTGTCCTC ；內源基因植物大豆凝集素基因(Lectin)的上下遊引物分別為Lectin-F :AGGTGACACTATAGAATAGCCCTCTACTCCACCCCCATCCLectin-R :GTACGACTCACTATAGGGAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG ；上遊通用引物為GF :AGGTGACACTATAGAATA ；其中該引物進行螢光標記；
下遊通用引物為GR :GTACGACTCACTATAGGGA ；其中該引物進行螢光標記；所述的螢光標記優選螢光素Cy5 ；(2)提取樣品的基因組；(3)進行多重PCR:以步驟⑵得到的基因組為模板，步驟(1)中所述外源基因和內源基因的引物可以自由組合，所述的上遊通用引物和下遊通用引物為必需引物，進行 PCR，得到PCR產物；(4)毛細管電泳檢測PCR產物；(5)對結果進行分析。步驟(3)中所述的PCR更優選為根據樣本的種屬不同，選擇引物①當樣本為大豆時，引物為EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s-F, CaMV35s-R, NOS-F, N0S-R、LeCtin-F和Lectin-R按等摩爾比混合得到的引物A，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D ；②當樣本為菜籽時，引物為Bar-F、Bar-R, PAT-F, PAT-R、FMV35S-F, FMV35S-R, N0S-F、N0S_R、PEP-F和PEP-R按等摩爾比混合得到的引物B，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D ；③當樣本為大豆和菜籽混合物時，引物為EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s-F, CaMV35s-R、Bar-F, Bar-R、PAT-F, PAT-R、FMV35S-F、FMV35S-R、NOS-F 和 NOS-R 按等摩爾比混合得到的引物C，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D ；所述PC R的反應體系優選為每25 μ 1 PCR反應體系含引物Α、引物B或引物C 1. 25pmol，引物 D 12. 5pmol，基因組 20 500ng ；所述PC R 的反應條件優選為 95°C IOmin ；95°C 30s, 58°C lmin, 72°C 30s, 35 循環； 72 °C IOmin ；步驟中所述毛細管電泳的操作步驟優選為使用樣品上樣溶液(SLS，Sample Loading Solution)和 DSS(DNA Size Standard)-400 按體積比 155 1 徹底混勻，然後在上樣板的每個孔中加入39 μ 1前述混合液，再取Ιμ 步驟C3)得到的PCR產物加入其中， 吹打3 4次，最後在每孔覆蓋一滴石蠟油；每孔加入分離緩衝液，進行毛細管電泳；所述分離緩衝液的加入量優選為250 μ 1 ；步驟中所述毛細管電泳的條件為毛細管溫度50°C ；變性90°C，120sec；注入樣品2.OKv, 30sec ；分離6.0Kv，35min ；步驟(5)中所述的結果分析為根據橫坐標size bp數值大小判斷基因，其中 Lectin 155bp、NOS 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp、Bar 321bp、PAT 161bp、FMV35S 247bp、PEP 285bp。所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法應用於植物中轉基因成分的檢測，特別是應用於大豆和菜籽中轉基因成分的檢測。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果(1)本發明通過採用通用引物引發靶基因擴增，能有效解決多重PCR過程中的擴增偏愛性，然後再採用毛細管電泳及螢光標記擴增產物以提高檢測靈敏度和解析度；根據擴增產物片段長度判斷結果，有助於提高檢測特異性。(2)本發明為轉基因植物的檢測提供了較為可靠和簡便的檢測方法，所建立的體系可重複性高，經多次試驗穩定性好。其檢測結果與其他檢測技術相比，具有更大的可靠性和適應性，簡化了檢測步驟，提高了檢測效率，從而為轉基因植物的檢測提供更有為效的檢測手段。
圖1是利用本發明所述方法檢測轉基因大豆得到的結果圖。圖2是利用本發明所述方法檢測轉基因菜籽得到的結果圖。圖3是利用本發明所述方法檢測轉基因大豆和轉基因菜籽混合物所得的六個外源基因的結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1(1)抽提樣本的基因組DNA取轉基因大豆(RRS品系國家標準樣品XLSY-ZJY-007，北京興林盛業科技發展中心)經粉碎後，按照Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification Kit的說明書提取基因組DNA，測定其^Onm和^Onm的紫外吸光值，計算所提取DNA的濃度和純度。依據所測濃度將DNA溶液稀釋到IOOng/ μ 1並置於_20°C備用。(2)檢測基因組DNA的完整性通過擴增大豆的內源參照基因植物大豆凝集素基因(Lectin)進行PCR反應，PCR 的反應體系為25 μ 1，其中含=Ex Taql2. 5μ 1,內源參照基因上、下遊引物(即Lectin-F和 Lectin-R)各(1 μ mol/L) 2. 5 μ 1，DNA模板1 μ 1，滅菌雙蒸水補足至25 μ 1。PCR的反應條件為:95°C, IOmin ； (95°C 30s ；58°C Imin ；72°C 30s) X35 循環；72°C IOmin0PCR結果證實所提取的基因組DNA可作為GeXP多重PCR技術的模板。(3) GeXP 多重 PCR 技術將如下引物(均為5』 -3』 )按等摩爾數混合，得到引物A 外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPQ的上下遊引物分別為EPSPS-F :AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTTEPSPS-R :GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA ；外源基因花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35Q的上下遊引物分別為CaMV35s-F AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCACaMV35s-R :GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA ；外源基因胭脂鹼合成酶基因終止子(NOS)的上下遊引物分別為NOS-F :AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCANOS-R :GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA ；內源基因植物大豆凝集素基因(Lectin)的上下遊引物分別為Lectin-F :AGGTGACACTATAGAATAGCCCTCTACTCCACCCCCATCCLectin-R :GTACGACTCACTATAGGGAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG ；將如下引物按等摩爾數混合，得到引物D 上遊通用弓丨物序列GF:Cy5-AGGTGACACTATAGAATA下遊通用引物序列GR:Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA。取200 μ L PCR 管，力口入 Ex Taq(Takara) 12. 5 μ 1，上、引物 A (1 μ mol/L) 1. 25 μ 1， 弓丨物D (10 μ mol/L) 1. 25 μ 1，DNA模板1 μ 1，滅菌雙蒸水補足至25 μ 1。將PCR反應管放入 PCR 儀中，擴增條件為 950C IOmin ；95°C 30s, 58°C lmin，72°C 30s，35 循環；72°C, IOmin0取反應液1 μ 1進行毛細管電泳毛細管電泳的體系為40 μ 1
SLS (Sample Loading Solution)和 DSS (DNA Size Mandard)-400 按體積比 155 1徹底混勻，得到混合液H;在上樣板的每個孔中均分裝39 μ 1混合液H，取Ιμ 步驟C3)得到的PCR產物加入其中，吹打3 4次，最後在每孔覆蓋一滴石蠟油；每孔加入分離緩衝液，進行毛細管電泳。SLS，DSS-400和分離緩衝液均購自美國貝克曼庫爾特有限公
司ο毛細管電泳的條件為毛細管溫度50°C ；變性90°C，120sec；注入樣品:2.0Kv,30sec ；分離6.0Kv，35min ；該步所用儀器為貝克曼 Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。結果如圖1所示，可見有4個峰。根據橫坐標size bp數值大小判斷基因，其中 Lectin 155bp、NOS 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp0 從左到右分別為 Lectin、NOS, CaMV 35S、EPSPS基因。可見本發明所提供的方法能準確地從大豆中檢測出轉基因成分。實施例2(1)抽提樣本的基因組DNA取轉基因油菜籽(RT73系國家標準樣品XLSY-ZJY-005，北京興林盛業科技發展中心)經粉碎後，按照 Promega 公司的 Wizard Genomic DNA Purification Kit 提取 DNA，測定其260nm和280nm的紫外吸光值，計算所提取DNA的濃度和純度。依據所測濃度將DNA 溶液稀釋到lOOng/μ 1並置於_20°C備用。(2)檢測基因組DNA的完整性製備的轉基因菜籽通過擴增菜籽的內源參照基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因 (PEP)，證實可作為PCR擴增模板。PCR的反應體系和反應條件同實施例1步驟(2)，區別僅在於將引物改為PEP-F和PEP-R。C3) GeXP 多重 PCR 技術將如下引物按等摩爾數混合，得到引物B 外源基因胭脂鹼合成酶基因終止子(NOS)的上下遊引物分別為NOS-F :AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCANOS-R :GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA ；外源基因桿菌草丁膦乙醯轉移酶基因(BAR)的上下遊引物分別為Bar-F :AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACTBar-R :GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG ；外源基因草丁膦乙醯轉移酶基因(PAT)的上下遊引物分別為PAT-F :AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAGPAT-RGTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT ；外源基因玄參花葉病毒35S啟動子(FMV35S)的上下遊引物分別為FMV35S-F :AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTAFMV35S-R :GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT ；內源基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)的上下遊引物分別為
PEP-F iAGGTGACACTATAGAATAGCTAGTGTAGACCAGTTCTTGPEP-R :GTACGACTCACTATAGGGACACTCTTGTCTCTTGTCCTC ；將如下引物按等摩爾數混合，得到引物D :上遊通用引物序列GF:Cy5-AGGTGACACTATAGAATA下遊通用引物序列GR:Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA ；取200 μ L PCR 管，力口入 Ex Taq (Takara) 12. 5 μ 1，上、引物 B (1 μ mol/L) 1. 25 μ 1， 弓丨物D (10 μ mol/L) 1. 25 μ 1，DNA模板1 μ 1，滅菌雙蒸水補足至25 μ 1。將PCR反應管放入 PCR 儀中，擴增條件為 950C IOmin ；95°C 30s, 58°C lmin，72°C 30s，35 循環；72°C, IOmin0取反應液1 μ 1進行毛細管電泳毛細管電泳的體系為40μ 1 SLS (Sample Loading Solution)和 DSS (DNA Size Mandard)-400 按體積比 155 1比例徹底混勻後在上樣板的每個孔中均分裝39 μ 1的該混合液，取1 μ 1步驟(3) 得到的PCR產物加入其中，吹打3 4次，最後在每孔覆蓋一滴石蠟油；每孔加入分離緩衝液，進行毛細管電泳。毛細管電泳的條件為毛細管溫度50°C變性90°C，120sec注入樣品2.0Kv，30sec分離6. 0Kv，35min該步所用儀器為貝克曼 Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。結果如圖2所示，可清晰觀察到5個峰，根據橫坐標size bp數值大小判斷基因， 其中:N0S 202bp、Bar 321bp、PAT 161bp、FMV35S 247bp、PEP 285bp。從左到右分別為 PAT、 N0S、FMV35S、PEP和Bar基因。可見本發明所提供的方法能準確地從菜籽中檢測出轉基因成分。實施例3(1)抽提樣本的基因組DNA取轉基因大豆和轉基因油菜籽經粉碎後，按照!Iomega公司的WizardGenomic DNAPurification Kit提取DNA，測定其^Onm和^Onm的紫外吸光值，計算所提取DNA的濃度和純度。依據所測濃度將DNA溶液稀釋到lOOng/μ 1並置於_20°C備用。(2)檢測基因組DNA的完整性以轉基因大豆和轉基因菜籽的核酸混合液作為模板，同時用大豆和菜籽的兩個內源參照基因(植物大豆凝集素基因Lectin和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEP)進行PCR 擴增，證實混合液可作為PCR擴增模板。PCR的反應體系和反應條件同實施例1步驟(2)， 區別僅在於引物為 Lectin-F、Lectin-R、PEP-F 和 PEP-R。C3) GeXP 多重 PCR 技術將如下引物按等摩爾數混合，得到引物C 外源基因花椰菜花葉病毒35S啟動子(CaMV35Q的上下遊引物分別為CaMV35s-F AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCACaMV35s-R :GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA ；
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外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPQ的上下遊引物分別為EPSPS-F :AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTTEPSPS-R :GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA ；外源基因胭脂鹼合成酶基因終止子(NOS)的上下遊引物分別為NOS-F :AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCANOS-R :GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA ；外源基因桿菌草丁膦乙醯轉移酶基因(BAR)的上下遊引物分別為Bar-F :AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACTBar-R :GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG ；外源基因草丁膦乙醯轉移酶基因(PAT)的上下遊引物分別為PAT-F :AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAGPAT-R :GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT ；外源基因玄參花葉病毒35S啟動子(FMV35S)的上下遊引物分別為FMV35S-F :AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTAFMV35S-R :GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT ；將如下引物按等摩爾數混合，得到引物D :上遊通用引物序列Cy5-AGGTGACACTATAGAATA下遊通用引物序列Cy5-GTACGACTCACTATAGGGA；取200 μ L PCR 管，力口入 Ex Taq(Takara) 12. 5 μ 1，上、引物 C(1 μ mol/L) 1. 25 μ 1， 弓丨物D (10 μ mol/L) 1. 25 μ 1，DNA模板1 μ 1，滅菌雙蒸水補足至25 μ 1。將PCR反應管放入 PCR 儀中，擴增條件為 950C IOmin ；95°C 30s, 58°C lmin，72°C 30s，35 循環；72°C, IOmin0取反應液1 μ 1進行毛細管電泳毛細管電泳的體系為40μ 1 SLS和DSS-400按體積比155 1比例徹底混勻後在上樣板的每個孔中均分裝 39μ1的該混合液，取Ιμ 步驟(3)得到的PCR產物加入其中，吹打3 4次，最後在每孔覆蓋一滴石蠟油；每孔加入分離緩衝液，進行毛細管電泳；毛細管電泳的條件為毛細管溫度50°C;變性90°C，120sec；注入樣品2.0Kv,30sec ；分離6.0Kv，35min ；該步所用儀器為貝克曼 Genomelab Gexp-Genetic Analysis System。結果如圖3所示，可清晰觀察到6個峰，根據橫坐標size bp數值大小判斷基因， 其中N0S 202bp、CaMV35s 232bp、EPSPS 353bp、Bar 32Ibp、PAT 161bp、FMV35S 247bp。從左到右分別為PAT、N0S、CaMV35S、FMV35S、Bar和EPSPS基因。可見本發明所提供的方法能準確地從大豆和菜籽混合物中檢測出轉基因成分。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)設計外源基因和內源基因的引物，下述引物均為5』-3』 ； 外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因的上下遊引物分別為 EPSPS-F :AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTT EPSPS-R :GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA ；外源基因花椰菜花葉病毒35S啟動子的上下遊引物分別為 CaMV35s-F AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCA CaMV35s-R :GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA ； 外源基因胭脂鹼合成酶基因終止子的上下遊引物分別為 NOS-F :AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA NOS-R :GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA ； 外源基因桿菌草丁膦乙醯轉移酶基因的上下遊引物分別為 Bar-F :AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACT Bar-R :GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG ； 外源基因草丁膦乙醯轉移酶基因的上下遊引物分別為 PAT-F :AGGTGACACTATAGAATACGGAGAGGAGACCAGTTGAG PAT-R :GTACGACTCACTATAGGGATGGGTGTTTGTGGCTCTGT ； 外源基因玄參花葉病毒35S啟動子的上下遊引物分別為 FMV35S-F :AGGTGACACTATAGAATAAAGACATCCACCGAAGACTTA FMV35S-R :GTACGACTCACTATAGGGAAGGACAGCTCTTTTCCACGTT ； 內源基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上下遊引物分別為 PEP-F :AGGTGACACTATAGAATAGCTAGTGTAGACCAGTTCTTG PEP-R :GTACGACTCACTATAGGGACACTCTTGTCTCTTGTCCTC ； 內源基因植物大豆凝集素基因的上下遊引物分別為 Lectin-F :AGGTGACACTATAGAATAGCCCTCTACTCCACCCCCATCC Lectin-R :GTACGACTCACTATAGGGAGCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG ； 上遊通用引物為AGGTGACACTATAGAATA ；其中該引物進行螢光標記； 下遊通用引物為GTACGACTCACTATAGGGA ；其中該引物進行螢光標記；(2)提取樣品的基因組；(3)進行多重PCR:以步驟⑵得到的基因組為模板，步驟(1)中所述外源基因和內源基因的引物可以自由組合，所述的上遊通用引物和下遊通用引物為必需引物，進行PCR，得到PCR產物；(4)毛細管電泳檢測PCR產物；(5)對結果進行分析。
2.根據權利要求1所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於步驟(3)中所述的PCR為根據樣本的種屬不同，選擇引物①當樣本為大豆時，引物為 EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s_F、CaMV35s_R、NOS-F, NOS-R、 Lectin-F和Lectin-R按等摩爾比混合得到的引物A，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D ；②當樣本為菜籽時，引物為Bar-F、Bar-R, PAT-F, PAT-R、FMV35S-F, FMV35S-R, NOS-F, N0S-R、PEP-F和PEP-R按等摩爾比混合得到的引物B，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D ；③當樣本為大豆和菜籽混合物時，引物為EPSPS-F、EPSPS-R、CaMV35s_F、CaMV35s_R、 Bar-F、Bar_R、PAT-F, PAT-R、FMV35S-F、FMV35S-R、NOS-F 和 NOS-R 按等摩爾比混合得到的引物C，以及上遊通用引物和下遊通用引物按等摩爾比混合得到的引物D。
3.根據權利要求2所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於所述PC R的反應體系為每25 μ 1 PCR反應體系含引物Α、引物B或引物C 1. 25pmol, 引物D 12. 5pmol，基因組20 500ng。
4.根據權利要求2所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於所述 PC R 的反應條件為 95 °C IOmin ；95 °C 30s, 58 °C lmin,72°C 30s, 35 循環； 72°C IOmin。
5.根據權利要求1所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於所述的螢光標記為使用螢光素Cy5進行標記。
6.根據權利要求1所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於步驟中所述毛細管電泳的操作步驟為使用樣品上樣溶液和DSS-400按體積比 155 1徹底混勻，然後在上樣板的每個孔中加入39μ1前述混合液，再取Ιμ 步驟(3)得到的PCR產物加入其中，吹打，最後在每孔覆蓋石蠟油；每孔加入分離緩衝液，進行毛細管電泳。
7.根據權利要求6所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於所述分離緩衝液的加入量為250 μ 1。
8.根據權利要求1所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法，其特徵在於步驟中所述毛細管電泳的條件為毛細管溫度50°C ；變性:90°C,120sec ；注入樣品2. 0Kv，30sec ；分離6. OKv，;35min。
9.權利要求1 8任一項所述GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法的應用，其特徵在於所述方法用於植物中轉基因成分的檢測。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述的植物為大豆和/或菜籽。
全文摘要
本發明公開了一種GeXP多重PCR技術檢測植物中轉基因成分的方法與應用。本發明通過設計常用的外源基因的引物，包括5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因，草丁膦乙醯轉移酶基因，草丁膦乙醯轉移酶基因，玄參花葉病毒35S啟動子，花椰菜花葉病毒35S啟動子，胭脂鹼合成酶基因終止子，進行PCR和毛細管電泳，根據毛細管電泳的結果進行分析；其中PCR為通過採用通用引物引發靶基因擴增。這種PCR能有效解決多重PCR過程中的擴增偏愛性，提高檢測靈敏度；毛細管電泳能提高解析度；根據擴增產物片段長度判斷結果，有助於提高檢測特異性。本發明為轉基因植物的檢測提供了較為可靠和簡便的檢測方法，所建立的體系可重複性高，經多次試驗穩定性好。
文檔編號C12Q1/68GK102154454SQ20101061556
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者吳希陽, 楊夢婕, 蘆春斌, 馬學軍 申請人:暨南大學