阻遏蛋白glxR在穀氨酸棒狀桿菌賴氨酸合成中的用途的製作方法

2023-07-10 04:50:26 1

專利名稱：阻遏蛋白glxR在穀氨酸棒狀桿菌賴氨酸合成中的用途的製作方法
背景技術：
穀氨酸棒狀桿菌為革蘭氏陽性菌，是熟知用作工業生產胺基酸，例如穀氨酸和賴氨酸的宿主生物體(Kinoshita，1995)。由於該生物在胺基酸生產中的作用，在過去的數十年中，對於產生工業上重要的胺基酸的分解代謝和合成代謝途徑，人們進行了深入研究(綜述見Sahm等，1995；Malumbres and Martin，1996)。對該生物中基因表達的調節機制，人們所掌握的知識非常有限，雖然這些知識對於深入了解代謝途徑還是非常必要的。
穀氨酸棒狀桿菌中的乙醛酸支路對於研究基因表達的調節機制是一個很好的選擇，因為催化這一支路的異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合酶(圖1)的表達受到可用碳源的嚴格調節(Wendisch等，1997)。aceA基因所編碼的異檸檬酸裂合酶催化三羧酸循環(TCA)的中間產物異檸檬酸向乙醛酸和琥珀酸的轉化(Reinscheid et al，1994a)。aceB基因所編碼的蘋果酸合酶催化隨後乙醛酸和乙醯輔酶A縮合生成蘋果酸的步驟，而蘋果酸又進入三羧酸循環(Lee and Sinskey，1994；Reinscheid et al，1994b)。當以二碳化合物例如乙酸鹽作為唯一碳源時，aceA和aceB基因去阻遏，通過繞過三羧酸循環中的CO2生成步驟，保留乙酸鹽的碳用於細胞材料的生物合成。葡萄糖作碳源時阻遏aceA和aceB基因。乙醛酸支路酶的表達在轉錄水平受可用碳源的調節(Wendisch et al，1997)，但人們對轉錄調節的機制大部分毫無所知，雖然Wendisch等曾暗示乙醯輔酶A作為信號分子參與其中(Wendisch et al，1997)。在大腸桿菌中，已知IclR阻遏蛋白負責aceBAK操縱子的調節(Chung et al，1988；Sunnarborg et al，1990)。IclR的表達受FadR的調節，後者已知可調節參與脂肪酸代謝的基因的表達。雖然aceA和aceB基因的結構組織在穀氨酸棒狀桿菌中與在大腸桿菌中不同，但在可用碳源對基因表達的調節這一點上似乎具有共同特點。
發明概要本發明提供新的多肽分子，這些多肽分子具有阻遏至少穀氨酸棒狀桿菌aceB基因的表達的能力。這些分子稱為glxR分子(乙醛酸支路調節劑)。本發明的另一方面涉及編碼上述glxR分子的多核苷酸序列。本發明的另一方面涉及glxR分子在影響諸如棒狀桿菌等宿主的胺基酸合成中的用途。
發明詳述本發明提供新的多肽分子，這些多肽分子具有阻遏至少穀氨酸棒狀桿菌aceB基因的表達的能力。在實驗部分中描述了具有SEQ ID NO1所示多肽序列的glxR分子的分離。
實驗部分中描述了glxR突變蛋白的製備，該突變蛋白具有與cAMP結合、阻遏編碼穀氨酸棒狀桿菌蘋果酸合酶的aceB基因轉錄的能力。
編碼glxR分子和glxR突變蛋白的多核苷酸序列可以用根據遺傳密碼對相應的多肽序列進行反翻譯和對所說的多核苷酸序列進行化學合成的方法來進行製備。在實驗部分中描述了編碼根據SEQ ID NO1的glxR分子的多核苷酸序列的分離。
本發明的另一方面在於glxR分子和相應的多核苷酸序列的用途，用於調節至少穀氨酸棒狀桿菌aceB基因的表達。在一個實施方案中，編碼glxR分子的多核苷酸序列經重組的方法被引入到具有功能性aceB基因的棒狀桿菌屬宿主生物體內。至少這一aceB基因的表達與天然存在的棒狀桿菌基因組組織相比在轉錄水平上得到調控。通過使glxR分子的表達量顯著高於天然發生量，可以達到更有效的aceB基因阻遏。
在本發明的另一實施方案中，將編碼glxR分子的多核苷酸序列的反義分子引入到宿主生物中。這一反義分子降低glxR基因的表達，使得宿主中glxR分子的量低於天然發生量。這導致aceB基因較高的轉錄速率。
在本發明的另一實施方案中，宿主生物中編碼glxR分子的多核苷酸序列部分或完全缺失。這導致aceB基因較高的轉錄速率。
通過對aceB基因表達進行調控，乙醛酸支路直接受到影響。調控可以是雙向的，即可以上調和下調。通過影響乙醛酸支路，可以有效地影響棒狀桿菌中胺基酸及其中間產物的代謝流動。
當棒狀桿菌被用作生產胺基酸——優選賴氨酸、穀氨酸和甲硫氨酸——的生物體時，可以將glxR分子對乙醛酸支路產生的影響加以利用，用來改變棒狀桿菌中胺基酸的生產。有些情況下有利的是將所需胺基酸的生產向高產量方向改變，而在另一些情況下則希望向相反方向改變，例如，為了阻斷不需要的中間產物的合成。
通過glxR分子對乙醛酸支路產生影響，這是對棒狀桿菌代謝能力進行設計的有效方式。
實驗部分glxR的分離為了分離其蛋白產物對穀氨酸棒狀桿菌aceB基因的表達產生調節作用的基因，我們使用了pSL145(Kim et al，2001)作為報告質粒，該質粒中的腸乳糖(lac)操縱子融合於棒狀桿菌aceB基因的下遊。利用這個質粒，在啟動子區域對aceB表達的調控表現為β-半乳糖苷酶活性的變化。攜帶pSL 145的大腸桿菌DH5αF′細胞(大腸桿菌DH5αF′-145)在含有X-gal的LB平板上形成藍色菌落，被用作篩選棒狀桿菌文庫的宿主。如果宿主細胞所攜帶的克隆，其蛋白產物對aceB的啟動子區域具有調節作用並因而影響lacZ的表達，則這些細胞預期將在平板上形成白色菌落。在所篩選的總共20,000個菌落中，鑑定到四個白色菌落。克隆出的DNA被證實包含重疊的插入序列。在這些克隆中，帶有一個7.8kb插入序列的質粒pSL 329(圖2)被選中進行進一步分析。將攜帶亞克隆的細胞點至含X-gal的LB培養基上，從而確定出負責β-半乳糖苷酶活性調控的DNA區域(圖2)。根據顏色試驗的數據，攜帶質粒pSL 329的大腸桿菌DH5αF′-145細胞表現出2.5mU的β-半乳糖苷酶活性，與β-半乳糖苷酶活性為27mU的親本株相比降低了90％(表3)。這一數據提示，克隆的DNA中所攜帶的基因(glxR，見下面)表達一種蛋白，這一蛋白可能與aceB基因的啟動子區域結合，從而幹擾lacZ的表達。
glxR基因的序列分析用pSL 329-5作測序模板測定克隆的完整核苷酸序列。在克隆的中央區域發現由684bp組成的ORF。基於與其他蛋白質的相似性(見下)，GTG被選作起始密碼子(圖3)。可能的核糖體結合位點AGGA位於GTG上遊9bp處(圖3)。ORF的GC含量為59％，這是典型的穀氨酸棒狀桿菌基因的GC含量。密碼子偏好性也與從前報導過的棒狀桿菌基因非常類似。而且，令人感興趣的是，這還表明，ORF可能編碼一種在低水平表達的蛋白(Malumbres et al，1993)。
推測的基因產物由228個胺基酸組成(SEQ ID NO1)，編碼24,957Da的蛋白，預計等電點為7.0。將ORF經翻譯後的胺基酸序列與蛋白資料庫中的序列進行比較。在已知蛋白中，結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)推測的轉錄調節蛋白(E70790)和天藍色鏈黴菌(streptomycescoelicolor)推測的轉錄調節蛋白(T36556)在胺基酸同一性上得分最高，分別為78％和53％。在作用已知的蛋白當中，霍亂弧菌(vibrio cholerae)的cAMP(環AMP)受體蛋白(CRP)(NP232242)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)的cAMP受體蛋白(A26049)、和大腸桿菌的cAMP受體蛋白(J01598)得分最高，同一性約為27％。對胺基酸序列進行仔細分析，發現有兩個保守基序，其可能參與酶的催化活性(圖3)。13-102位胺基酸表現出預期cAMP結合結構域所具有的保守殘基模式，與cNMP結合結構域的共有序列有31％的同一性(圖4)。此外，在所編碼蛋白質的羧基端(胺基酸170-218位)識別出CRP/FNR家族的螺旋-轉角-螺旋DNA結合基序。它與CRP的螺旋-轉角-螺旋基序具有41％的同一性(圖4)。基於所克隆的基因的特性(見下)，我們將此棒狀桿菌基因命名為glxR(乙醛酸旁路調節劑)。
編碼蛋白的分析通過對glxR編碼區域(包括核糖體結合位點)進行克隆引入pKK223-3載體和將所得到的載體引入大腸桿菌，得到蛋白表達；該蛋白在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上Mr為25,000(圖5A)。所觀察到的分子量與預計的蛋白分子量相符。使用MBP融合技術對GlxR蛋白進行純化。如我們所預期，純化的蛋白在SDS-PAGE上顯示Mr 25,000(圖5B)。用凝膠過濾柱層析測得純化蛋白的天然分子量(Mw)為44,000Da(數據未顯示)。這提示，該蛋白很可能像大多數其他DNA結合蛋白一樣形成二聚體。
cAMP的參與作為研究glxR作用的第一步，將glxR的一個克隆，即質粒pSL329-5引入穀氨酸棒狀桿菌AS019E12，對效果進行監測。如圖6AB所示，多拷貝glxR克隆的存在顯著影響在葡萄糖或乙酸鹽碳源上生長的宿主細胞的生長。如表2所示，乙酸鹽基本培養基上所觀察到的生長削減很顯然是由於乙醛酸旁路酶，例如蘋果酸合酶和異檸檬酸裂合酶的減少造成的。異檸檬酸脫氫酶(一種三羧酸循環酶)的酶活性不受影響。通過用SDS-PAGE判斷，活性的降低是表達的酶的量減少所造成的(數據未顯示)。然而，在cAMP存在時進行生長實驗，卻觀察到一個有趣的結果。與在葡萄糖基本培養基上的生長(圖6A)不同，攜帶glxR克隆的細胞在乙酸鹽基本培養基上的生長受到cAMP的嚴重影響(圖6B)。無論在用葡萄糖還是用乙酸鹽作碳源的生長條件下，用蛋白質印跡進行檢測，發現所表達的GlxR的量都不受影響(結果未顯示)。與數據相一致，如表3所示，在大腸桿菌cya突變株中沒有觀察到glxR克隆在棒狀桿菌aceB啟動子部位的調控活性。此外，純化的GlxR蛋白在有cAMP存在時對抗胰蛋白酶消化的能力增強(數據未顯示)。這些數據提示cAMP參與GlxR活性的調控。同時還提示，在對參與各種碳源的利用的基因表達進行控制的過程中，cAMP可能是一種信號分子。
GlxR的DNA結合活性由於已知GlxR參與aceB表達的控制，我們測試了純化GlxR對aceB基因啟動子區域的結合。為了這一目的，我們使用了攜帶aceB基因啟動子區域的DNA片段(圖7A)。在有cAMP存在時，向此探針中加入純化的GlxR蛋白，加入量逐漸增加，導致兩條差異遷移的條帶(圖7C)。上面的條帶出現比下面的條帶晚，提示上麵條帶產生的原因可能是GlxR蛋白的寡聚化。將cAMP用乙醯輔酶A代替，後者曾被提示作為乙醛酸支路酶的調控劑(Wendisch et al，1997)，但用乙醯輔酶A代替cAMP並未導致任何與探針的DNA遷移(數據未顯示)。已知根據凝膠遷移率變動分析GlxR蛋白可以形成寡聚體，我們利用交聯劑EDAC測試了純化GlxR的寡聚化。無論cAMP存在與否，都見到交聯的二聚體和四聚體結構。
glxR蛋白的突變蛋白從原始glxR多肽序列(SEQ ID NO.1)開始，可以通過對SEQ ID NO.1中一個或幾個胺基酸進行替代、插入或缺失製備許多功能等價的glxR突變蛋白。功能等價的突變蛋白的意思是這些突變蛋白仍然具有與cAMP結合、阻遏表達、尤其是穀氨酸棒狀桿菌的aceB基因的轉錄的能力，而這種能力與具有SEQ ID NO.1的glxR是在一個數量級水平上的。製備glxR突變體優選通過已知的基因工程技術進行，例如通過對相應的多核苷酸編碼序列進行定點誘變。
glxR突變蛋白與SEQ ID NO.1的差異不超過胺基酸序列的20％，優選不超過15％，最優選不超過10％，極為最優選不超過5％。
重要的是，glxR突變蛋白具有例如圖4所示的完整的cAMP結合結構域和完整的螺旋-轉角-螺旋DNA結合基序。
材料和方法細菌株、質粒和生長條件本研究中所使用的所有菌株和質粒均列於表1。大腸桿菌DH5αF′被用於質粒的構建和擴增。大腸桿菌JM105被用於從pKK-glxR表達GlxR。使用如Simons等[Simons et al，1987]所述的λ噬菌體λRS415將構建在質粒pRS415上的PaceB-lacZ操縱子融合基因轉移至大腸桿菌株的染色體。除非另有說明，大腸桿菌和穀氨酸棒狀桿菌細胞分別在37℃、LB培養基(Sambrook et al，1989)和30℃、MB培養基(Follettie et al，1993)中培養。大腸桿菌和穀氨酸棒狀桿菌的基本培養基分別是M9(Sambrook et al，1989)和MCGC(Von de Osten，1989)。以如下量將碳源加入基本培養基葡萄糖，1％；乙酸鹽，2％。以如下量加入抗生素氨苄青黴素，50μg/ml；四環素，20μg/ml；卡那黴素，20μg/ml。X-gal和cAMP分別以40μg/ml和8mM的濃度加入培養基。為了表達蛋白質，將IPTG加至終濃度1mM或0.3mM。
DNA技術使用標準分子克隆、轉化和電穿孔工藝(Sambrook et al，1989)。用電穿孔將質粒引入穀氨酸棒狀桿菌細胞(Follettie et al，1993)。用以前描述過的方法(Yoshihama et al，1985)進行穀氨酸棒狀桿菌細胞的小量質粒製備。用以前描述過的方法(Tomioka et al，1981)製備穀氨酸棒狀桿菌AS019的染色體DNA。限制酶和DNA修飾酶購自Takara Shuzo公司(Shiga，日本)和New England Biolabs(Beverly，美國)，按照生產商推薦的方法進行使用。
克隆和測序穀氨酸棒狀桿菌AS019的基因組文庫按以前所描述的進行構建(Lee and Sinskey，1994)。基因組文庫的構成將4-13kb的MboI片段克隆入大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭載體pMT1。大腸桿菌DH5αF′細胞用pSL145(Kim et al，2001)進行轉化，得到的大腸桿菌DH5αF′-145株被用作篩選文庫的載體。質粒pSL145攜帶融合於aceB啟動子區域下遊的lacZYA。
用質粒pSL329-5作模板進行glxR的核苷酸序列分析。用通用和合成的寡核苷酸引物在韓國基礎科學研究中心(Taejon，韓國)付費對GlxR的完整核苷酸序列進行測定。使用BLAST(Altschul et al，1990；Altschul etal，1997)在國家生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行核苷酸和胺基酸序列的序列相似性檢索。使用ClustalW比對方法(Thompson et al，1994)在ExPASy Proteomics Tools的網站上(http//www.expasy.ch/tools/)進行配對序列比對。
質粒構建將pMT1載體分別用SmaI-XbaI、XhoI、KpnI消化，分別與pSL329的5.1kb EcoRI-XbaI片段、5.2kb XhoI片段、2.7kb SmaI-EcoRI片段和1.8kb KpnI片段進行連接，得到質粒pSL329-1、pSL329-2、pSL329-3、pSL329-5。將pSL329-3的0.2kb SalI片段刪除，得到質粒pSL329-4。將pSL08用XbaI消化、用Klenow酶平末端化，再插入pSL329-5的1.8kb KpnI-BamHI，得到質粒pSL08-glxR。所克隆的glxR基因的轉錄方向與aceB基因相反。用C1和C2引物對pSL329-5的828bp片段進行擴增，將所得到的片段插入pKK223-3的EcoRI位點，構建成質粒pKK-glxR。828bp片段攜帶glxR基因和其核糖體結合位點。依下法構建質粒pMAL-glxR用質粒pSL329-5作模板、用引物D1、D2擴增glxR編碼區域。0.89kb的PCR產物用EcoRI和SalI處理，與用EcoRI-SalI消化並去磷酸化的pMAL-c2連接。
GlxR的純化用質粒pMAL-glxR表達GlxR。載體攜帶融合至malE的glxR，表達MBP-GlxR融合蛋白。融合蛋白用因子Xa切割，釋放出N端附有一串胺基酸(Ile-Ser-Val-Phe)的游離GlxR蛋白。融合蛋白依載體pMAL-c2的製造商(New England Biolabs，Beverly，美國)建議的方法進行表達和純化。用Q-瓊脂糖快流柱層析(Amersham Pharmacia Biotech，2.8cm×11cm)及線性NaCl梯度25-500mM將GlxR與MBP分離。合併含GlxR的級分，用PEG 8,000透析濃縮此蛋白質。
凝膠遷移率變動分析如下法製備探針DNA。用引物E1和E2擴增包含aceB基因上遊區域的200bp DNA片段(起始密碼子ATG上遊120-320bp)，進而以T4多核苷酸激酶、用[γ-32P]dATP進行標記。10μl結合反應混合物包含標記的DNA片段、不同量的純化GlxR、10mM磷酸緩衝液、137mM NaCl、2.7mM KCl、3μg牛血清白蛋白、1μg聚[dI-dC]·聚[dI-dC]。GlxR與探針DNA的結合在室溫下進行15分鐘，混合物按已描述的方法(Sambrook et al，1989)用6％非變性聚丙烯醯胺凝膠進行分析。必要時在結合緩衝液、凝膠和電泳緩衝液中加入0.2mM cAMP。
抗體的生化分析和製備用已描述的方法(Follettie et al，1993)製備棒狀桿菌細胞提取物。用已描述的方法測定β-半乳糖苷酶、蘋果酸合酶、異檸檬酸裂合酶、異檸檬酸脫氫酶和乙酸激酶的酶活性(Miller，1972；Gubler et al，1993；Dixon and Kornberg，1959；Garnak and Reeves，1979；van Dyk and LaRossa，1987)。蛋白質用Bradford的方法進行測定，用牛血清白蛋白作標準(Bradford，1976)。用以前描述過的方法進行SDS-PAGE和蛋白質印跡(Laemmli，1970)。抗-GlxR抗血清在Koma Biotech(漢城，韓國)付費製備，其中用小鼠作宿主。
GenBank入藏號glxR的核苷酸序列收入GenBank，入藏號為AF293334。
討論在本研究中，我們證實GlxR參與對aceB基因的調節，後者參與乙酸鹽作為碳源的利用。證據是1)在攜帶報告基因的大腸桿菌中β-半乳糖苷酶活性受到調控，2)所編碼的蛋白序列中存在一個推測的DNA結合結構域，3)在引入的glxR克隆存在時乙醛酸支路酶的表達降低，4)純化的GlxR在aceB啟動子區域上發生DNA結合。此外，與其它DNA結合蛋白一樣，該蛋白被發現以二聚體形式存在並具有相對偏鹼性的等電點，這也支持了該蛋白的調節功能。雖然我們的數據提示glxR基因可能主要參與乙醛酸支路基因，例如aceA和aceB的調節，我們也不能排除該基因也可以參與其它基因表達的可能性。glxR在葡萄糖基本培養基上造成的生長阻滯可能提示GlxR蛋白與其它啟動子之間的相互作用，雖然這可能與使用CRP所觀察到的一樣是由於對DNA的序列非依賴性親和性引起。雖然我們進行了各種努力，仍然無法用克隆的DNA構建glxR突變株，這可能提示這一基因是必需的(數據未顯示)，提示glxR基因參與其它基因的表達。從這點來說，與大腸桿菌的CRP一樣，GlxR蛋白可能作為其它基因的激活劑起作用，從而使得glxR是必需的。
有趣的是，glxR基因所編碼的蛋白序列已知與腸細菌的CRP具有同源性。CRP在碳分解代謝物阻遏中起作用，後者在腸細菌、例如大腸桿菌中由cAMP控制。GlxR與CRP的主要相似點包括1)胺基酸序列相似性，2)cAMP結合基序的存在，3)cAMP參與DNA結合活性的調控，和4)在cAMP存在時蛋白質表現出對蛋白酶不同的敏感性。然而，儘管有這些相似點，GlxR的作用似乎與CRP不同。例如，glxR基因無法與大腸桿菌crp突變株發生互補(數據未顯示)。
環AMP是一種重要的信號分子，控制許多基因的表達。在許多細菌中報導了cAMP的參與，例如腸細菌、芽孢桿菌種、鏈黴菌種(Botsford andHarman，1992)。在大腸桿菌中，cAMP對碳分解代謝物基因(例如乳糖和阿拉伯糖操縱子)發揮重要作用(Epstein et al，1975)。碳飢餓條件下，細胞內cAMP濃度上升。雖然這是一個普遍現象，但也有例外。例如，短桿菌種在葡萄糖基本培養基上生長時似乎就保持低cAMP濃度(Peter et al，1991)。這與我們在穀氨酸棒狀桿菌中的發現相似。如生長實驗中所證實的(圖6)，在乙酸鹽上生長時細胞內cAMP可以保持低濃度。有cAMP存在時攜帶glxR克隆的細胞生長減緩，由此可以支持這一假說。在葡萄糖基本培養基上有cAMP並沒有顯示明顯影響，這一數據進一步支持了這個假說。雖然這與在大腸桿菌、鏈黴菌中所建立起來的規則相反，但已有人提出cAMP在快速生長期而不是在葡萄糖受限條件下以最高的水平存在，從而傳遞可獲得碳源而不是碳源缺乏的信號(Dobrova et al，1984)。雖然對於低GC含量的革蘭氏陽性菌(例如芽孢桿菌種)中非cAMP依賴性分解代謝物阻遏機制已進行了詳細研究，但對於高GC含量的革蘭氏陽性菌中有關信息的了解完全缺乏(綜述見Botsford and Harman，1992；Saier Jr.，1996)。從這點上來說，本研究第一次證實了cAMP涉足參與碳利用的基因的表達。總之，我們使用攜帶棒狀桿菌aceB啟動子和腸lac操縱子的報導質粒，從穀氨酸棒狀桿菌中成功地分離了一個調節基因。雖然glxR基因似乎編碼針對aceA和aceB基因的阻遏物樣蛋白，這一基因也有可能參與其它基因的表達。
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圖1穀氨酸棒狀桿菌的乙醛酸支路和相關路徑。乙醛酸支路由異檸檬酸裂合酶和蘋果酸合酶完成。縮寫ACK，乙酸激酶；ICDH，異檸檬酸脫氫酶；ICL，異檸檬酸裂合酶；MS，蘋果酸合酶；OAA，草醯乙酸；PTA，磷酸轉乙醯酶。帶虛線的箭頭表示多個步驟。
圖2克隆和亞克隆的示意圖。質粒pSL329分離自棒狀桿菌基因組文庫。克隆載體pMT1未顯示。攜帶每一克隆的大腸桿菌DH5αF』-145細胞的菌落顏色(蘭或白)在含X-gal、四環素和氨苄青黴素的LB平板上進行測試。縮寫B，BamHI；E，EcoRI；K，KpnI；Sa，SalI；Sc，ScaI；Sp，SphI；X，XhoI；Xb，XbaI。
圖3GlxR蛋白的示意圖(圖A)圖4穀氨酸棒狀桿菌GlxR蛋白與其它同源序列的多重序列比對。保守的和功能類似的胺基酸分別用黑框和虛框標註。環核苷酸單磷酸結合基序和螺旋-轉角-螺旋DNA結合基序用實線標註。縮寫CG，穀氨酸棒狀桿菌(AF220150)的GlxR；MT，結核分枝桿菌H37RV(E70790)推測的轉錄調節劑Rv3676；SC，天藍色鏈黴菌(T36556)推測的轉錄調節劑；VC，霍亂弧菌(NP232242)的CRP；EC，大腸桿菌(J01598)的CRP。
圖5GlxR在大腸桿菌中的表達。(A)如「材料和方法」中所述從pKK-glxR載體表達GlxR蛋白。泳道1，大腸桿菌JM105/pKK223-3；2，大腸桿菌JM105/pKK-glxR(非誘導的)；3，大腸桿菌JM105/pKK-glxR(誘導的)。(B)GlxR的純化。從pMAL-glxR表達蛋白質。泳道4，總蛋白；5，可溶級分；6，純化的MBP-GlxR融合蛋白；7，因子X處理後；8，純化的GlxR蛋白。M顯示分子量標準。
圖6在穀氨酸棒狀桿菌中表達glxR和cAMP對生長的影響。葡萄糖(圖A)或乙酸鹽(圖B)被用作唯一碳源。需要時，加入cAMP至終濃度8mM。符號●，pMT1(空質粒)；○，pMT1和cAMP；■，pSL329-5(glxR)；□，pSL329-5(glxR)和cAMP。
圖7用純化的GlxR進行凝膠移位分析。純化的GlxR蛋白與探針一起孵育，混合物用6％PAGE進行分析。圖A，aceB啟動子區域的示意圖；B，無cAMP存在時的凝膠移位；C，有cAMP存在時的凝膠移位。環AMP加入分析混合物、凝膠和PAGE緩衝液(至0.2mM)。泳道1，無蛋白質；2，0.03μg；3，0.06μg；4，0.13μg；5，0.25μg；6，0.5μg；7，1.0μg；8，2.0μg的純化GlxR蛋白。箭頭指示移位的條帶。
表1本研究中使用的細菌株和質粒

a，國家遺傳學學院，日本b，有下劃線的序列指示ECORI或SalI位點。
r，上標表示抗藥性。Ap，氨苄青黴素；Km，卡那黴素；Tc，四環素。
表2 glxR克隆對異檸檬酸裂合酶(ICL)、蘋果酸合酶(MS)、乙酸激酶(ACK)和異檸檬酸脫氫酶(ICDH)活性的影響

a在含2％乙酸鈉的MB培養基(Follettie et al，1993)上生長穀氨酸棒狀桿菌AS019E12細胞至穩定期，以誘導酶。
b蘋果酸合酶、異檸檬酸裂合酶和異檸檬酸脫氫酶的活性用已經描述過的方法測定(Gubler et al，1993；Dixon and Kornberg，1959；Garnakand Reeves，1979)。細胞提取物按已描述過的方法製備(Follettie et a1，1993)。
c用電穿孔方法將質粒引入棒狀桿菌(Follettie et al，1993)。
表3在大腸桿菌cya突變株中表達GlxR

序列表110巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)120阻遏蛋白glxR在穀氨酸棒狀桿菌賴氨酸合成中的用途130OZ 0050/53548140
141
1601170PatentIn Ver.2.02101211228212PRT213穀氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)4001Val Glu Gly Val Gln Glu Ile Leu Ser Arg Ala Gly Ile Phe Gln Gly1 5 10 15Val Asp Pro Thr Ala Val Asn Asn Leu Ile Gln Asp Met Glu Thr Val20 25 30Arg Phe Pro Arg Gly Ala Thr Ile Phe Asp Glu Gly Glu Pro Gly Asp35 40 45Arg Leu Tyr Ile Ile Thr Ser Gly Lys Val Lys Leu Ala Arg His Ala50 55 60Pro Asp Gly Arg Glu Asn Leu Leu Thr Ile Met Gly Pro Ser Asp Met65 70 75 80Phe Gly Glu Leu Ser Ile Phe Asp Pro Gly Pro Arg Thr Ser Ser Ala85 90 95Val Cys Val Thr Glu Val His Ala Ala Thr Met Asn Ser Asp Met Leu100105 110Arg Asn Trp Val Ala Asp His Pro Ala Ile Ala Glu Gln Leu Leu Arg115 120 125Val Leu Ala Arg Arg Leu Arg Arg Thr Asn Ala Ser Leu Ala Asp Leu
130 135 140Ile Phe Thr Asp Val Pro Gly Arg Val Ala Lys Thr Leu Leu Gln Leu145 150 155 160Ala Asn Arg Phe Gly Thr Gln Glu Ala Gly Ala Leu Arg Val Asn His165 170 175Asp Leu Thr Gln Glu Glu Ile Ala Gln Leu Val Gly Ala Ser Arg Glu180 185 190Thr Val Asn Lys Ala Leu Ala Thr Phe Ala His Arg Gly Trp Ile Arg195 200 205Leu Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Val Asp Thr Glu His Leu Ala Arg210 215 220Arg Ala Arg Val22權利要求
1.具有SEQ ID NO1所示序列的分離的多肽序列或其突變蛋白，其中該突變蛋白具有結合cAMP和阻遏穀氨酸棒狀桿菌aceB基因表達的能力，並可通過對SEQ ID NO1進行最多20％的胺基酸插入、缺失或替代而得到。
2.根據權利要求1所述的分離的多肽序列，其具有cAMP結合結構域和螺旋-轉角-螺旋DNA結合基序。
3.編碼根據權利要求1或2的多肽序列的分離的多核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的多核苷酸序列用於調控至少棒狀桿菌aceB的表達的用途。
5.根據權利要求4所述的用途，用於影響胺基酸的生物合成。
6.根據權利要求5所述的用途，用於增加胺基酸的生物合成。
7.根據權利要求6所述的用途，其中胺基酸是賴氨酸。
8.通過影響至少aceB基因的表達而在棒狀桿菌屬宿主中生產賴氨酸的方法，其中影響至少aceB基因的表達是通過在該宿主中以不同於棒狀桿菌天然存在的基因組組織的方式表達根據權利要求3的多核苷酸序列而實現的。
全文摘要
具有SEQ ID NO1所示序列的分離的多肽序列或其突變蛋白，該突變蛋白具有結合cAMP和阻遏穀氨酸棒狀桿菌aceB基因表達的能力，並通過對SEQ ID NO1進行最多20％的胺基酸插入、缺失或替代而得到。
文檔編號C12N15/09GK1656117SQ03811195
公開日2005年8月17日 申請日期2003年5月13日 優先權日2002年5月16日
發明者C·克洛普羅格, O·策爾德爾, B·克勒格爾, H·施洛德, S·黑夫納, H-S·李 申請人:巴斯福股份公司