用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物的製作方法
2023-07-10 04:37:21
專利名稱：用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物。具體地，本發明涉及一種用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮(oltipraz))和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)作為主要活性成分。
背景技術：
肝臟在生物異源物質的代謝和內源性物質的代謝起重要作用，它是協調酶反應和能量代謝的重要器官。在韓國地許多慢性疾病中，肝炎、肝硬化和肝癌是僅次於心血管疾病的最普遍和威脅生命最大的疾病。由於與發達國家相比韓國有相對更多的酗酒者，由狂歡酗酒導致的肝損傷的數量很多，所以在治療肝疾病方面受到許多關注。從病毒感染和酗酒導致的慢性肝損傷經常會引起肝硬化和肝癌。考慮到肝組織的生理特徵和重要意義，以及根據治療和預防肝疾病的重要性，急需開發出治療和預防肝損傷的藥物。
多種藥物包括多種合成化合物和植物製劑在體外和體內表現出肝保護功能。儘管已知水飛薊素或甜菜鹼由於細胞素抑制和穀胱甘肽水平增加的活性機理而具有肝保護作用，但因為其低的有效性很難預期治療效果。由於目前還沒有適當的治療藥物治療肝疾病，所述藥物還經常用於臨床治療。臨床用於治療肝纖維化的馬洛替酯及其衍生物能夠保護肝臟免受毒性化學物質的損傷，其可能的活性機理包括誘導II相結合酶和抑制細胞色素P450。但是這些化合物非選擇性地抑制幾種細胞色素P450，表現出有限的預防效果。
已知十字花科植物天然來源的含硫的二硫醇硫酮的幾種取代物具有肝保護作用。在它們當中，具有下式的吡噻硫酮用作治療血吸蟲病的臨床藥物。
吡噻硫酮能增加細胞中硫醇含量，誘導對維持穀胱甘肽(GSH)庫和親電分子組織解毒有作用的酶的表達。吡噻硫酮能增加下列酶的活性NAD(P)H醌還原酶，微粒體環氧化物水解酶，穀胱甘肽轉移酶(GST)和UDP-GT。尤其是，GST保護肝臟免受某些毒性物質如四氯化碳或對乙醯氨基酚的損害(Ansher SS，Dolan P，和Bueding E.，兩種二硫醇硫酮和丁基羥基茴香醚對四氯化碳或對乙醯氨基酚毒性的化學保護效果，1983肝臟病學(Hepatology)3，932-935)。
並且，吡噻硫酮能抑制苯並[a]芘、NDEA和尿嘧啶氮芥引起的化學致癌作用，以及黃麴黴素B1-誘導的肝腫瘤發生和azoxymethane-誘導的結腸腫瘤發生(Bolton MG，Munoz A，Jacobson LP，Groopman JD，Maxuitenko YY，Roebuck BD，和Kensler TW.吡噻硫酮保護對抗黃麴黴素-誘導的肝腫瘤發生的短暫幹涉，1993，癌症研究(Cancer Res.)53，3499-3504)。
已知的通過吡噻硫酮抑制癌發生的機理如下所述。第一，吡噻硫酮能增加組織中抗氧劑、還原的GSH的水平。第二，它通過抑制I相酶如細胞色素P450而抑制致癌物質的生物活化。第三，它通過誘導包括GST和UDP-GT的II相解毒酶而使致癌物質解毒。第四，吡噻硫酮能抑制體內I型人免疫缺陷病毒(HIV)的複製。第五，它能夠通過增加硫醇水平和促進DNA修復而除去反應性中間體。已報導吡噻硫酮能增加大多數組織的GSH水平，除去由於放射或異生物產生的游離基。還已知通過幫助維持細胞的自動調節，吡噻硫酮能用作對輻射的保護劑。
關於上述描述，更詳細的信息如下所列。癌症是不受控制的細胞生長和變異，推測是由於體細胞中的DNA損傷而引起(Cancer Biology，第三版，Raymond W.Ruddon，pp.61-95，497-507，Oxford Press)。化學藥物的抗癌作用主要是依賴於其抗突變發生效果或其抑制轉化成癌細胞或癌細胞增殖的活性。吡噻硫酮已被研究作為癌症化學防治藥物(Ansher等，1983；Bolton等，1993)。吡噻硫酮的癌症化學防治效果不僅與抑制細胞色素P4503A有關，而且與II相解毒酶的誘導有關。通過吡噻硫酮在細胞和動物中，能增加穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的表達(Clapper等，1994；Davidson等，1990)，其與抑制毒物誘導的組織損傷和致癌作用有關(Kensler等，1987；Maxuitenko等，1998)。吡噻硫酮保護肝臟免受輻射引起的組織損傷(Kim等，1997)，從現有技術已知GST誘導意味著細胞適應反應。吡噻硫酮還能保護肝臟對抗毒物(Ansher等，1983)。通過吡噻硫酮對黃麴黴素B1-誘導的腫瘤發生的抑制是通過幹預細胞色素P450 3A催化的致癌物的代謝活化介導。按照最近的臨床實驗，吡噻硫酮能有效降低肝癌高風險的人的血漿黃麴黴素B1水平。通過施用吡噻硫酮也能減少動物中黃麴黴素B1-誘導的致癌作用。
已有報導吡噻硫酮能抑制肝炎B病毒(HBV)在2.2.15細胞中的複製，其中該細胞被含HBV DNA的質粒感染。因此，吡噻硫酮能抑制肝炎B病毒基因的轉錄，提高p53蛋白表達(Chi等，1998)，以及抑制人免疫缺陷病毒(HIV)的複製(Prochaska等，1995)。
在中國已進行了關於吡噻硫酮對肝癌發生的化學防治的臨床實驗。結果表明吡噻硫酮對肝癌發生有弱的保護作用。還表明吡噻硫酮至少能適度地保護肝對抗毒物誘導的肝中毒。此外，在鼠和犬中進行的毒性研究也證明了吡噻硫酮的安全性(Fund.Appl.Toxicol.1997 Jan；35(1)9-21)。
DDB(二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯)，一種來源於Shizandrae的成分，在包括韓國的東亞地區作為臨床治療肝炎的藥物。DDB保護肝組織免受四氯化碳-、半乳糖胺-、硫代乙醯胺-或氫化潑尼松-誘導的損傷，並增加抗體產生量。已知對肝炎患者的的臨床實驗有效後，DDB已廣泛應用到臨床中。本發明人報導了DDB的藥理效果與NF-κB活化和TNF-α生產的已知有關。另外，發現DDB不影響藥物代謝酶的表達。由於已知NF-κB作為介導炎性反應的轉錄因子，NF-κB的抑制劑能夠抑制全身性炎症反應。
肝纖維化為前病理(prepathological)狀態，其中在諸如肝炎的慢性肝疾病中的損傷的肝組織不能修復成正常組織，但是作為體內適應性反應的一部分其能轉化成纖維組織如膠原蛋白。儘管肝纖維化是對組織損傷的反應的體內修復過程的結果，但是損傷的肝組織被纖維組織代替，其不再具有正常的功能(例如體內代謝或生成膽汁)。由於連續和重複的肝纖維發生會導致肝硬化，最終導致死亡，因此開發治療肝纖維化的新藥非常重要。但是，由於還不清楚肝纖維發生的明確機理，因此還未開發出適合的治療性藥物。
最近的研究顯示轉化生長因子-β(TGF-β)，一種從肝中肝巨噬細胞(Kupffer)和Ito細胞分泌的細胞因子，是肝纖維化的重要介質。此外，報導通過使用TGF-β抗體、反義RNA和修飾TGF-β受體而阻斷TGF-β活性能明顯降低肝纖維化。但是，所述研究的效果僅在於實驗水平得以驗證。還沒有報導對肝纖維化和肝硬化臨床可行的藥物。發明目的
本發明的目的在於提供一種藥物組合物，其對肝纖維化和肝硬化具有最好的治療效果，並且其也可以用作預防藥物。
本發明的另一個目的在於提供一種藥物組合物在製備用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物中的用途。
本發明的另一個目的在於提供治療或預防肝纖維化和肝硬化的方法，其包括對哺乳動物給藥一種藥物組合物。發明概述
本發明提供了一種用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮)和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)作為主要成分。所述組合物的吡噻硫酮與DDB的比例優選為25∶0-25，更優選為5∶0.1-5，最優選為5∶1。按照本發明的吡噻硫酮/DDB製劑對治療和預防肝纖維化和肝硬化表現出人意外地好的效果，並且是對人體具有低毒性的安全藥物。
圖1a為顯示當對大鼠給藥DMN時，吡噻硫酮對肝組織中的TGF-β1mRNA表達的抑制效果的照片。
圖2a為正常動物的肝組織的照片(H & E染色)。
圖2b為正常動物的肝組織照片(H & E染色)。
圖3a為給藥DMN組的肝組織照片(H & E染色)。
圖3b為給藥DMN組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖4a為聯合給藥(co-administer)DMN和吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖4b為聯合給藥DMN和吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖5a為聯合給藥DMN和吡噻硫酮(15mg/kg)/DDB(15mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖5b為聯合給藥DMN和吡噻硫酮(15mg/kg)/DDB(15mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。
圖6a為聯合給藥DMN和吡噻硫酮(5mg/kg)/DDB(25mg/kg)組的肝組織照片(H & E染色)。
圖6b為聯合給藥DMN和吡噻硫酮(5mg/kg)/DDB(25mg/kg)組的肝組織照片(Masson′s trichrome染色)。發明詳述
本發明人首先發現吡噻硫酮對治療和預防肝纖維化和肝硬化有意想不到地另人驚異的效果。並且，他們發現當與DDB組合時，能明顯增加吡噻硫酮的治療和預防效果。
當多種因素對肝造成嚴重損傷時，會出現纖維化，肝硬化的初級階段。肝硬化與癌形成有部分關係，並且會明顯增加其受害者患肝癌的風險。但是，肝硬化的病理學機理與肝癌有明顯的區別。也就是說，當肝組織有慢性和嚴重的損傷時，出現肝纖維化。肝損傷的病因包括病毒、寄生蟲、酗酒、化學物質和藥物。通過肝組織中諸如肝巨噬細胞、星形細胞等非實質細胞活化引起的細胞外基質(例如I、III和IV型膠原蛋白)的過度生產會出現肝纖維化。更具體地，從星形細胞活化並隨後轉化成肌成纖維細胞出現纖維化。然後，活化的星形細胞產生過量的細胞基質。並且，肝纖維化和肝硬化在病理現象上明顯不同於病毒性肝炎和肝癌。因此，它們各自的治療和預防也是不同的。但是，目前對於肝硬化，還沒有臨床上適用的藥物。
本發明是基於發現了已知有效預防肝癌的吡噻硫酮也能有效抑制肝纖維化和肝硬化，而肝纖維化和肝硬化具有完全不同於肝癌的病理機理。並且，本發明的特徵在於吡噻硫酮與DDB合用的用途，其中以前已知DDB僅有效治療肝炎，該用途在治療和預防肝纖維化和肝硬化中提供了超出預期的效果。這些事實在下述的實驗中得到證實。
吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB減少了纖維化得分和Knodell得分，二甲基亞硝胺(DMN)加速纖維化的指標。這與示範性的組織的顯微鏡檢查相一致。此外，基於給藥，吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB明顯抑制肝中毒指標如ALT，AST，膽紅素，和γ-谷胺醯轉肽酶(γ-GT)。這表明吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB通過延遲其各自的過程能改善纖維化。該吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB纖維化抑制機理涉及TGF-β表達的抑制。按照定量RT-PCR結果，吡噻硫酮或吡噻硫酮/DDB能完全抑制通過二甲基亞硝胺加速的TGF-βmRNA表達。這可以用作吡噻硫酮作為能夠抑制肝纖維化和肝硬化發生和發展的藥物的證據。吡噻硫酮誘導肝解毒酶GST和mEH，增加GSH，並表現出自由基結合活性；相反，DDB不誘導解毒酶。綜上所述，認為吡噻硫酮和DDB具有互補的藥理效果。更具體地，通過DDB在人肝微粒體中的CYP3A代謝活性的抑制被認為是隨後抑制吡噻硫酮的代謝，甚至低劑量的吡噻硫酮也可以提供強的肝保護作用，並能延長藥物的有效時間。
在本發明中，對已給藥DMN的大鼠中觀察了不同比例的吡噻硫酮/DDB組合對肝纖維化的治療效果。吡噻硫酮DDB進行測試的重量比為25∶5，15∶15和5∶25(mg/kg)。在結果中，當給藥DMN(給藥3周後進行1周觀察)時，與對照組相比，ALT，AST，膽紅素，和γ-谷胺醯轉肽酶(γ-GT)，纖維化得分和Knodell得分均明顯提高。相反，當給藥吡噻硫酮/DDB時，這些值都降低。吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)表現出最高的肝纖維化抑制效果。這證明了吡噻硫酮和DDB在抑制肝損傷和纖維化的協同效果，教導了它們之間的最佳比例為5∶1。並且，吡噻硫酮/DDB組合給藥比單獨給藥吡噻硫酮(50mg/kg)能降低更多的血液生化指標，即肝纖維化和Knodell得分。因此，認為吡噻硫酮與DDB組合應用可以減少副作用如胃腸道疾病、手足感覺異常等，這些副作用可以由於高吡噻硫酮劑量產生。DDB抑制通過DMN誘導的炎性反應，而吡噻硫酮能防止TGF-β表達，增加抗氧化劑酶的表達，並誘導增加GSH。通過該機理，吡噻硫酮/DDB能使治療和預防肝纖維化的效果最大化。因此，吡噻硫酮/DDB利用其對肝保護的互補效果。並且，由於吡噻硫酮/DDB表現出幾乎沒有副作用，其可以臨床應用。
優選本發明的藥物組合物通過組合獨立製劑的藥物應用，或通過製成含有藥物混合物的組合製劑應用。當本發明的藥物組合物實際應用時，配製成適合於口服給藥的單位劑量形式，按照合適的藥物領域的常規方法給藥。為此，口服劑型包括硬或軟膠囊、片劑、粉末等。除了吡噻硫酮/DDB作為藥理活性成分外，該口服劑型可以含有一種或多種藥理非活性的常規載體介質。例如該口服劑型可以含有添加劑澱粉、乳糖、羧甲基纖維素、高嶺土等賦型劑；水、明膠、醇、葡萄糖、阿拉伯膠、黃蓍膠等粘合劑；澱粉、糊精、海藻酸鈉等崩解劑；滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、液體石蠟等潤滑劑。可以進一步加入溶解的助劑。
本發明的每日劑量根據多種因素，如患者的肝損傷程度、肝炎的發病時間、年齡、健康程度、併發症等。但是對於正常的成年人，一天給藥吡噻硫酮/DDB組合物一次或兩次，每日總劑量為5-200mg，更優選25-50mg。但是如果患者患有嚴重的肝損傷或當肝癌切除後用作抗復發藥時，本發明可以偏離上述藥物組合物的範圍，使用更大的劑量。更優選地，每日口服給藥兩次含有25mg吡噻硫酮和5mg DDB的一個或兩個單位劑量。
本發明藥物組合物最好將DDB補充到吡噻硫酮中，其中吡噻硫酮具有顯著的纖維化抑制和肝保護性質，而DDB具有卓越的炎性反應抑制效果。上述提供了對肝纖維化和肝硬化的抑制，具有低的毒性，並且幾乎沒有副作用。因此，本發明可以安全地長期用於治療和預防肝纖維化和肝硬化。
下面通過本發明的具體實施例更詳細地解釋本發明。但是本發明不限於這些具體實施例。測試實施例測試實施例1吡噻硫酮抗-纖維化效果(1)
大鼠在4周內連續給藥二甲基亞硝胺(DMN)，使血漿中丙氨酸轉氨酶和天門冬氨酸轉氨酶增加到4倍。用50mg/kg吡噻硫酮預處理後，血漿中ALT和AST活化的增加被抑制50％(表1)。
血漿中γ-穀氨醯轉肽酶(γ-GT)活性和膽紅素含量用作肝功能的指標。吡噻硫酮抑制DMN給藥大鼠的γ-GT活化增加的70％-80％。另一方面，當給藥DMN時，與對照組相比膽紅素含量增加到8倍。當50mg/kg吡噻硫酮和DMN同時給藥時，膽紅素的增加被抑制65％。表1ALT、AST、γ-GT和膽紅素值
每個值都由平均值±標準偏差表示。使用的動物數為8-16。通過多次分析的Newman-Keuls檢驗顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號含義為*＝與對照相比p＜0.05，#＝與DMN處理組相比p＜0.05。測試實施例2吡噻硫酮抗-纖維化效果(2)
在動物測試模型中觀察吡噻硫酮對DMN誘導的肝纖維化的組織病理學影響。給藥DMN4周、每周3次後的大鼠可觀察到明顯的纖維化。當同時給藥吡噻硫酮(口服給藥5-50mg/kg劑量，每周3次後，超過4周)和DMN，與單獨給藥DMN相比肝組織的纖維化減少。通過使用肝組織病理學指示劑即Van Gieson染色和Masson′s trichrome染色，在病理學上測定肝組織的壞死和纖維化(表2)。
50mg/kg吡噻硫酮劑量能有效改善DMN誘導的纖維化(表2)。通過評價纖維化和Knodell得分(其指示了肝損傷和纖維化的程度)，確定了纖維化的程度。與只給藥DMN組相比，DMN+吡噻硫酮組表現出低的纖維化和Knodell得分，表現出肝損傷和纖維化的治療補救。表2吡噻硫酮對肝組織纖維化的抑制效果
每個值都由平均值±標準偏差表示。使用的動物數為8-16。通過多次分析的Newman-Keuls測試顯示每組間的顯著性差異。*p＜0.05，**p＜0.01。纖維化程度0＝正常，1＝存在微弱的纖維化組織，2＝存在中等的纖維化組織，3＝存在明顯的纖維化組織，4＝存在嚴重的纖維化。從門靜脈周的橋連(periportal bridging)(最大＝10)、小葉內細胞損傷(最大＝4)、肝門炎症(最大＝4)、和纖維化(最大＝4)的值的總和為Knodell得分。測試實施例3吡噻硫酮在抗-纖維化中的藥理學機理
TGF-β1是在組織損傷後纖維化中表達升高的主要細胞因子。在只給藥DMN和同時給藥DMN和吡噻硫酮中，根據RT-PCR分析方法觀察了動物TGF-β1mRNA的表達。在動物給藥DMN4周，不可逆的過度纖維發生妨礙了TGF-β1mRNA表達的觀察。在只給藥DMN的動物中觀察到TGF-β1mRNA的表達。給藥DMN後18小時，給藥吡噻硫酮。然後在24小時後觀察TGF-β1mRNA表達。在DMN給藥的大鼠中，肝組織中TGF-β1mRNA顯著增加。通過給藥100mg/kg吡噻硫酮可以完全抑制DMN誘導的TGF-β1mRNA的表達。在只給藥DMN或同時給藥DMN和吡噻硫酮後，GAPDH mRNA的表達沒有變化。因此，表明吡噻硫酮通過減少TGF-β1表達的藥理學機理抑制肝纖維化(圖1)。測試實施例4吡噻硫酮對抑制TGF-β生產的評價
為了觀察吡噻硫酮是否能直接抑制TGF-β的生產(其在巨噬細胞過度表達)和評價相關的分子藥理學機理，應用RAW264.7巨噬細胞進行測試。當吡噻硫酮直接加入到RAW264.7巨噬細胞時(其已增加TGF-β的表達)，發現吡噻硫酮能以劑量依賴的方式抑制TGF-β表達。這些結果表明吡噻硫酮可以通過抑制TGF-β生產而用作肝的肝巨噬細胞中的抗-纖維化藥物。並且，通過EGTA或染料木黃酮(其為酪氨酸激酶的抑制劑)可以抑制TGF-β表達的增加。該結果表明通過吡噻硫酮對TGF-β生產的抑制可能是細胞內鈣調節和蛋白激酶活性改變的結果(表3)。表3通過吡噻硫酮對TGF-β在巨噬細胞中表達的抑制測試實施例5DDB抗炎機理(抑制NF-κB活化)
已知NF-κB活化與炎性反應有關。為了比較給藥DDB與未給藥DDB時的肝組織中的NF-κB活性的差異，進行了下列測試。使用體重大約150g的SD雄性大鼠。每組使用7隻大鼠。對於對照組(給藥載體)和測試組(給藥20-100mg/kg/天的DDB)，通過應用電泳活動移動檢測(ElectrophoresisMobility Shift Assay(EMSA))測定按照內毒素(脂多糖，LPS)處理的NF-κB活性。
LPS處理(1μg/kg)導致NF-κB核轉錄p50和p65複合物水平的增加。但是LPS處理前2小時的DDB處理(20-100mg/kg)阻滯了NF-κB複合物易位進入核子及其活性。這些結果表明DDB能夠抑制在大鼠肝臟中LPS誘導的NF-κB活化。
用1μg/kg of LPS刺激Raw264.7細胞會引起30分鐘至1小時後的NF-κB的DNA結合活性增加。在濃度為0.1、0.3和1mM的DDB能夠以濃度依賴的方式抑制NF-κB活性。這些結果與用DDB處理的大鼠肝中得到的結果相一致。表4DDB對NF-κB活化的影響
I-κBα降解的抑制
通過I-κBα亞基的磷酸化和蛋白酶降解進行NF-κB到核的易位。進行該測試是為了確定DDB對NF-κB活化的效果是否與I-κBα降解的抑制有關。大鼠用LPS(1μg/kg)處理30分鐘後I-κBα蛋白水平下降。相反，在LPS處理前2小時用DDB處理，能減少由LPS造成的I-κBα蛋白下降。而且與RAW264.7細胞，DDB在0.3-1mM的濃度下以濃度依賴的方式抑制蛋白降解。這些結果表明DDB抑制I-κBα降解並由此抑制NF-κB活化(表5)。表5DDB對I-κBα降解的影響測試實施例6DDB抗炎機理(TNF-α生產和mRNA表達的抑制)
TNF-α是對LPS反應的主要介質，其涉及炎性過程。通過ELISA確定當通過DDB抑制NF-κB活性時，釋放到血中的TNF-α的量是否降低。單劑量的LPS處理(1μg/kg，i.v.)在給藥後2小時能使TNF-α的水平從35pg/ml升高至5160pg/ml。DDB在20、50或100mg/kg的劑量下處理能防止通過LPS造成的血漿TNF-α水平提高，得到的每毫升血漿值分別為1350、1230或690pg。對於RAW264.7細胞，DDB能降低由LPS造成的TNF-α生產。這些結果顯示DDB能抑制TNF-α在巨噬細胞和肝中的表達(表6)。表6DDB對在血漿中TNF-α生產的影響測試實施例7吡噻硫酮/DDB的組合的抗纖維化效果(1)
通過改變組合中的成分的比例，評價了吡噻硫酮/DDB的組合抗纖維化效果。為了評價按照組成比例的組合效果，部分改變了DMN的劑量安排。即，在測試實施例1和2中，DMN在四周內每周給藥3次，即以每次給藥10μl/kg的劑量總共給藥12次，而為了評價按照組成比例的組合效果，使用具有減少的肝損傷的動物模型，其中在測試例中DMN在三周內每周給藥3次，即以每次給藥10μl/kg的劑量總共給藥9次，在剩餘的一周不給藥。
給藥DMN三周後1周，動物的纖維化得分為2.9，Knodell得分為11.7。因此，當與動物給藥DMN四周的纖維化得分為3.7和Knodell得分為16.1相比，表明動物的肝纖維化降低。
給藥DMN三周、每周3次後1周，與對照組相比動物的血漿中ALT和AST活性增加至大約4倍。
在每次給藥DMN後1天在三周內(每周3次)以25∶5、15∶5和5∶25mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動物中，當與只給藥DMN的動物的結果相比，給藥吡噻硫酮和DDB的動物的血漿中ALT和AST活性明顯被抑制。對比組合中不同組成比例間的效果，發現以15∶15mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動物組雖然也表現出ALT和AST活性的明顯抑制，但抑制程度低於以25∶5mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動物組的結果(表7)。
血漿中的γ-GT活性和膽紅素含量被用作肝功能的代表指標。在以25∶5、15∶5和5∶25mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB三周的動物中，DMN-誘導的膽紅素含量增加在統計學上受到顯著的抑制。與ALT和AST的結果相類似，在給藥吡噻硫酮和DDB的動物組中，以25∶5mg/kg的劑量給藥吡噻硫酮和DDB的動物的膽紅素增加最大程度地受到抑制。
血中總蛋白含量和膽紅素水平為肝組織蛋白合成的指標。當發生肝硬化，血中總蛋白含量通常降低。給藥DMN三周後1周，處理組動物中的總蛋白含量明顯降低，但是以25∶5和15∶5mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動物組中的總蛋白含量恢復到正常對照組的水平。
這些結果表明在測試實施例中使用的吡噻硫酮和DDB組成比中，給藥25∶5mg/kg的吡噻硫酮和DDB的動物組顯示出對通過DMN誘導的肝纖維化最大的抑制效果。並且，還可以注意到給藥吡噻硫酮(25mg/kg)/DDB(5mg/kg)的動物組的效果等於或優於在測試實施例1中單獨給藥50mg/kg吡噻硫酮的動物組的效果。實際上，單獨給藥50mg/kg吡噻硫酮的動物組中對由DMN引起的ALT增加的抑制百分比為40％，給藥25∶5mg/kg吡噻硫酮和DDB的動物組的肝纖維化抑制百分比為43％。對於其它的指標，也能觀察到類似的結果。表7ALT、AST、膽紅素、白蛋白和總蛋白含量值
每個值都由平均值±標準偏差表示。使用的動物數為8-10。通過多次分析的Newman-Keuls檢驗顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號含義為*＝與對照相比p＜0.05，#＝與DMN處理組相比p＜0.05。測試實施例8吡噻硫酮/DDB的抗纖維化效果(2)
在動物模型中觀察到吡噻硫酮/DDB的多種組合對DMN誘導的肝纖維化的組織病理學效果。在正常大鼠中沒有觀察到肝纖維化(圖2a和2b)。給藥DMN三周、每周3次後1周的大鼠中觀察到肝組織的明顯肝纖維化(圖3a和3b)。當給藥DMN後1天以25∶5和15∶15mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB三周(每周3次)時，肝組織中的纖維化比只給藥DMN的結果明顯降低。尤其是，以25∶5mg/kg的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動物組(圖4a和4b)顯示出比以15∶15mg/kg(圖5a和5b)和5∶25mg/kg(圖6a和6b)的劑量比給藥吡噻硫酮和DDB的動物組更好的藥效，並能明顯地抑制肝纖維化的發展。
通過使用膠原蛋白累積的病理學指示劑即Masson′s trichrome染色，在病理學上測定肝組織的壞死和纖維化。通過評價纖維化值和Knodell得分(其指示了肝損傷和纖維化的程度)，確定了纖維化的程度。表8吡噻硫酮/DDB組合對肝組織纖維化的抑制效果
每個值都由平均值±標準偏差表示。使用的動物數為8-10。通過多次分析的Newman-Keuls測試顯示每組間的顯著性差異。表示顯著性的符號含義為**p＜0.01，與DMN處理組相比。纖維化分級為0＝正常，1＝存在微弱的纖維化組織，2＝存在中等的纖維化組織，3＝存在明顯的纖維化組織，4＝存在嚴重的纖維化。從門靜脈周的橋連(periportal bridging)(最大＝10)、小葉內細胞損傷(最大＝4)、肝門炎症(最大＝4)、和纖維化(最大＝4)的值的總和為Knodell得分。測試實施例9吡噻硫酮/DDB組合對TGF-β表達的影響
如上所述，TGF-β是引起肝纖維化的細胞因子，並且已知與肝纖維化的發展有關。表9顯示了通過RT-PCR方法的TGF-βmRNA的存在的變化。
與對照組相比，給藥DMN組顯示出TGF-β生產的明顯增加。在給藥不同組合比例的吡噻硫酮/DDB的動物中，關於TGF-β表達的定量RT-PCR結果顯示給藥30mg/kg吡噻硫酮和聯合給藥25∶5mg/kg吡噻硫酮和DDB能完全抑制TGF-β表達。但是，隨DDB對於吡噻硫酮的比例的增加，TGF-β表達的抑制逐漸下降。在只給藥DDB的動物組中，沒有抑制TGF-β的表達。因此，認為TGF-β表達的抑制是由於吡噻硫酮引起。在這方面，吡噻硫酮與DDB最佳的組合比例為5∶1(表9)。表9吡噻硫酮/DDB組合對TGF-β表達的相對抑制工作實施例工作實施例1吡噻硫酮25mgDDB 1mg乳糖50mg澱粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的片劑製備方法製備片劑。工作實施例2吡噻硫酮50mgDDB 1mg乳糖50mg澱粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的片劑製備方法製備片劑。工作實施例3吡噻硫酮5mgDDB 10mg乳糖50mg澱粉10mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的片劑製備方法製備片劑。工作實施例4吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg澱粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的膠囊製備方法通過填充到硬明膠膠囊中製備膠囊劑。工作實施例5吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg澱粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的膠囊製備方法通過填充到硬明膠膠囊中製備膠囊劑。工作實施例6吡噻硫酮1mgDDB 50mg乳糖30mg澱粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的膠囊製備方法通過填充到硬明膠膠囊中製備膠囊劑。工作實施例7吡噻硫酮5mgDDB 25mg乳糖30mg澱粉28mg滑石2mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，按照常規的膠囊製備方法通過填充到硬明膠膠囊中製備膠囊劑。工作實施例8吡噻硫酮250mgDDB 50mg異構化糖10g糖 30mgCMC鈉 100mg檸檬調味劑 適量加入純水至總體積100ml
按照常規的混懸劑製備方法，將上述成分製成混懸劑。將該混懸劑填充到100ml棕色瓶中，並進行滅菌。工作實施例9吡噻硫酮50mgDDB 250mg異構化糖20g糖 20g海藻酸鈉100mg橙味調味劑 適量加入純水至體積100ml
按照常規的混懸劑製備方法，將上述成分製成混懸劑。將該混懸劑填充到100ml棕色瓶中，並進行滅菌。工作實施例10吡噻硫酮25mgDDB 5mg乳糖30mg澱粉20mg硬脂酸鎂適量
將上述成分混合，填充到聚乙烯包封袋中，密封製備粉末劑。工作實施例111軟膠囊含有吡噻硫酮25mgDDB 5mg聚乙二醇400 400mg濃甘油 55mg純水335mg
將聚乙二醇與濃甘油混合，然後加入純水。將混合物維持在60℃，向該混合物中加入吡噻硫酮。將該混合物在1,500rpm下攪拌。混合物混合均勻後，在緩慢攪拌下將混合物冷卻至室溫。用真空泵除去氣泡，將內容物置於軟膠囊中。
軟膠囊的膜按照常規方法製備，應用公知的軟明膠增塑劑配方，該配方每膠囊中含有明膠132mg，濃甘油52mg，70％二山梨醇溶液6mg，以及適量的乙基香蘭素調味劑和棕櫚蠟作為包衣劑。工業實用性
按照本發明的吡噻硫酮/DDB製劑對治療和預防肝纖維化和肝硬化表現出出人意料地好的效果。因此，它可以臨床用於治療和預防肝纖維化和肝硬化。
權利要求
1.一種用於預防和治療肝纖維化和肝硬化的發展的藥物組合物，其含有5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二硫醇-3-硫酮(吡噻硫酮)和二甲基-4，4′-二甲氧基-5，6，5′，6′-二亞甲基二氧二苯基-2，2′-二羧酸酯(DDB)。
2.按照權利要求1藥物組合物，其中所述組合物配製成選自膠囊、片劑、軟膠囊、混懸劑、糖漿劑、注射劑和粉末劑的劑型。
3.按照權利要求1藥物組合物，其中所述組合物用於口服給藥。
4.按照權利要求1-3中任何一項的藥物組合物，其中所述組合物含有重量比50-1∶1-50的吡噻硫酮和DDB。
5.按照權利要求1-4中任何一項的藥物組合物在製備用於預防和治療肝纖維化和肝硬化的發展的藥物中的用途。
6.一種用於預防和治療肝纖維化和肝硬化的發展的方法，其包括對哺乳動物給藥按照權利要求1-4中任何一項的藥物組合物。
全文摘要
本發明提供了一種用於治療和預防肝纖維化和肝硬化的藥物組合物，其含有5－(2－吡嗪基)－4－甲基－1，2－二硫醇－3－硫酮(吡噻硫酮)和二甲基－4，4′－二甲氧基－5，6，5′，6′－二亞甲基二氧二苯基－2，2′－二羧酸酯(DDB)作為主要成分。在所述組合物中的吡噻硫酮與DDB的比例優選為25∶0－25，更優選為5∶0.1－5，特別優選為5∶1。按照本發明的吡噻硫酮/DDB製劑對治療和預防肝纖維化和肝硬化表現出意外好的效果，並且是對人體具有低毒性的安全藥物。
文檔編號A61K45/06GK1407891SQ0180596
公開日2003年4月2日 申請日期2001年3月2日 優先權日2000年3月2日
發明者金相建, 姜建旭 申請人:金相建