黃腐酚在防治急性肺損傷與急性呼吸窘迫症候群中的用途的製作方法

2023-07-10 11:12:43

本發明公開了黃腐酚在防治急性肺損傷與急性呼吸窘迫症候群中的用途，屬於醫藥領域。

背景技術：

黃腐酚（Xanthohumol）是一種從工業釀造啤酒的重要原料之一的啤酒花中提取出的天然的異戊烯黃酮類化合物，具有抗癌、抗病毒、預防及治療糖尿病、動脈粥樣硬化的作用。但目前尚未見黃腐酚用於治療急性肺損傷的報導。

急性肺損傷（ALI）及其嚴重形式急性呼吸窘迫症候群（ARDS）是指由創傷、輸血及感染等多種因素所導致的，以肺間質中大量炎症因子的釋放、炎症細胞的聚集及肺水腫為病理生理特徵的急性進行性呼吸功能不全或者呼吸衰竭症狀，是重症監護中的主要死亡原因。急性肺損傷的發病機制錯綜複雜，主要涉及炎症反應、氧化應激及炎症小體等多種通路，而且各個通路之間是相互聯繫、相互影響形成複雜的細胞網絡及信號通路網絡。正是由於其發病機制的複雜性，儘管多個大型臨床試驗已經用於探測多種治療策略（包括使用糖皮質激素、酮康唑、吸入NO或補充的表面活性劑的潛能等，迄今為止仍然沒有一個可行、有效的治療方法降低其死亡率。與現代醫學常規治療手段相比，中草藥治療優勢在於可通過多途徑、多環節調節機體的免疫反應，從而影響疾病發生的各個因素及全身作用機制。為了尋求更好的治療方法，已經有很多學者從傳統中藥的多靶點作用的角度出發，研究中藥單體對內毒素引起的急性肺損傷的保護作用及機制，雖然取得了一定的進展，但仍處於起步階段，具有巨大的發展前景。本發明首次發現黃腐酚通過激活AMPK/AKT/Nrf2信號通路發揮抗氧化、抗炎及抗炎症小體作用，可用於治療急性肺損傷。

技術實現要素：

本發明公開了黃腐酚在防治急性肺損傷與急性呼吸窘迫症候群中的用途。

本發明公開了黃腐酚在製備預防和治療急性肺損傷藥物中的用途。

本發明公開了黃腐酚製備治療急性呼吸窘迫症候群藥物中的用途。

本發明公開了以黃腐酚為活性成分製備治療急性肺損傷或急性呼吸窘迫症候群的藥物可以是藥物學上的任何藥物製劑。

本發明所述的黃腐酚的分子式為：C21H22O5；分子量354.4

本發明所述的黃腐酚能夠對內毒素急性肺損傷小鼠具有較好的治療作用；

本發明所述的黃腐酚能激活AMPK/AKT/Nrf2信號通路；

本發明所述的黃腐酚能夠增強Nrf2調控的抗氧化酶和代謝解毒酶的表達；

本發明所述的黃腐酚能夠抑制氧化應激、炎症和炎症小體等相關蛋白的表達；

本發明所述的黃腐酚對急性肺損傷小鼠的治療作用是依賴於AMPK/AKT/Nrf2信號軸的激活作用；

本發明同時提供了黃腐酚在製備治療急性肺損傷藥物中的應用；

本發明技術方案優選黃腐酚在製備治療急性肺損傷藥物中的應用；

本發明以黃腐酚為活性成分製備治療急性肺損傷或急性呼吸窘迫症候群的藥物可以是藥物學上的任何藥物製劑；可將黃腐酚和藥學上可接受的輔料製備成各種劑型。

本發明優選將黃腐酚製備成注射劑、膠囊、片劑、粉針劑等劑型。

本發明的積極效果在於：提供了黃腐酚新的醫用用途，可用於防治急性肺損傷與急性呼吸窘迫症候群。使用黃腐酚治療急性肺損傷或急性呼吸窘迫症候群，具有毒副作用小，臨床症狀明顯，治癒率高。

附圖說明

圖1為本發明黃腐酚對急性肺損傷小鼠肺組織病理學改變的保護作用；

圖2為本發明黃腐酚對急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中（A）中性粒細胞及(B)炎性細胞因子的抑制作用；

圖3 為本發明黃腐酚對急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中ROS產物的抑制作用；

圖4為本發明黃腐酚體外對LPS誘導的炎症相關蛋白表達的抑制作用；

圖5 為本發明黃腐酚體外對LPS誘導的(A-C)炎症因子和(D)ROS的抑制作用；

圖6 為本發明黃腐酚體外對抗氧化應激信號通路及抗氧化酶的激活作用；

圖7為本發明黃腐酚對LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中Txinp激活和Trx-1消耗， NLRP3炎性小體和的NF-κB炎性信號通路的調節作用；

圖8為本發明黃腐酚對急性肺損傷小鼠肺組織中Nrf2、AMPK和GSK3β的蛋白表達的激活作用；

圖9為本發明黃腐酚對野生型及Nrf2 -/-急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中(A-C)炎症因子和(D)ROS的抑制作用；

圖10為本發明黃腐酚對野生型及Nrf2 -/-急性肺損傷小鼠肺組織中Txinp、NLRP3炎性小體和NF-κB信號通路的抑制作用；

圖11為本發明黃腐酚在體外對AMPK、GSK3β以及Nrf2信號通路的激活作用；

圖12為本發明黃腐酚加入AMPK及Nrf2抑制劑後，對Nrf2激活作用。

具體實施方式

通過黃腐酚體內對小鼠急性肺損傷的治療作用試驗，體外抗炎、抗氧化活性和對信號通路調節作用試驗以及體內外抗炎和抗氧化的作用機制試驗證實了黃腐酚可通過激活AMPK/AKT/Nrf2信號軸，發揮治療急性肺損傷的作用。

實驗例1

黃腐酚體內對急性肺損傷小鼠的治療作用

小鼠急性肺損傷模型建立：60隻雄性C57/B小鼠（6～8 周齡，18-20g），隨機分6組，每組10隻：空白組、LPS（0.5 mg/kg）組、黃腐酚給藥組（50 mg/kg），黃腐酚（10、50 mg/kg）+ LPS組、地塞米松（5 mg/kg）+ LPS 組作為陽性對照組。操作方法：首先，生理鹽水稀釋黃腐酚和地塞米松腹腔注射小鼠，空白組和LPS組腹腔注射等體積的生理鹽水。給藥1 h後， LPS鼻腔滴注造模，空白組和黃腐酚給藥組小鼠鼻腔滴注等體積的生理鹽水。在LPS滴注12 h後，處死小鼠，並收集小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織，進行相應的指標檢測。

實驗結果：

黃腐酚對LPS誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用參見圖1-3，黃腐酚能夠顯著抑制LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織病理學改變；抑制體內炎症細胞侵潤和炎性細胞因子增多；抑制LPS誘導產生的過多的ROS，對小鼠急性肺損傷發揮保護作用。

實驗例2

黃腐酚體外抗炎、抗氧化活性及對信號通路調節作用試驗

細胞模型建立：將對數生長期的RAW 264.7細胞鋪於96孔培養板中，培養24小時後，加入不同濃度的黃腐酚作用1小時，後給予LPS（1 μg/ml）作用24小時，MTT檢測細胞毒性；細胞鋪於24孔培養板中， 處理方法同上，（a）收集上清ELISA檢測細胞因子，收集細胞Western Bloting檢測iNOS、COX-2和HMGB1表達水平；(b)將已配好的DCFH-DA（終濃度：10 μM）加入到每個孔中，置於37 °C溫箱中反應30 min後檢測ROS產物。

將細胞鋪於6孔培養板中，培養24 h後，加入不同濃度黃腐酚處理18 h或黃腐酚（5 μM）處理細胞不同時間，收集細胞檢測GCLC、GCLM、HO-1、NQO1和Trx-1的蛋白表達。

實驗結果：

如圖4-6，黃腐酚體外具有顯著的抗炎抗氧化活性：黃腐酚能顯著抑制LPS誘導炎症相關蛋白表達；顯著抑制炎症介質和ROS產物；顯著激活抗氧化信號通路及多種抗氧化酶的表達。

實驗例3

體內外抗炎和抗氧化作用機制的研究

體內小鼠急性肺損傷模型建立：為了進一步探究黃腐酚對LPS誘導的急性肺損傷保護作用機制，野生型（WT）和Nrf2敲除（Nrf2-/-）小鼠，構建LPS誘導小鼠急性肺損傷模型（建模方法同上），取小鼠的肺組織和肺泡灌洗液（BALF），進行以下相關實驗。

實驗結果：黃腐酚對急性肺損傷小鼠保護作用機制如圖7-10，黃腐酚顯著抑制氧化應激誘導的Txinp激活和Trx-1消耗，抑制NLRP3炎性小體和的NF-κB炎性信號通路；顯著激活Nrf2、AMPK和GSK3β；顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和ROS的產生，但在Nrf2 -/-小鼠中抑制作用減弱；Nrf2 -/-小鼠肺組織中，黃腐酚對LPS激活的Txinp、NLRP3炎性小體和NF-κB信號通路的抑制作用，明顯減弱。

體外細胞模型建立：相關蛋白檢測方法同上。此外，細胞鋪於96孔培養板中，培養24 h後，待細胞密度長到70%左右，加入黃腐酚（5 μM）處理細胞（1、3或6小時）後，使用雙螢光素酶試劑盒檢測ARE活性。細胞鋪於6孔培養板中，培養24 h後，加入CC（3 μM，AMPK的抑制劑）處理細胞18小時或加入BT（100 nM，Nrf2的抑制劑）處理細胞1小時後，然後加入黃腐酚（5 μM）處理細胞3小時，收集細胞檢測相關蛋白表達情況。

實驗結果：

黃腐酚體外抗氧化作用機制如圖11-12，黃腐酚體外抗氧化依賴於AMPK/GSK3β/Nrf2信號通路軸。黃腐酚在體外能顯著激活AMPK、GSK3β以及Nrf2信號通路；加入AMPK及Nrf2抑制劑後，黃腐酚對Nrf2激活作用消失。