由甘油發酵合成1,3-二羥基丙酮的方法

2023-08-01 02:04:01 2

專利名稱：由甘油發酵合成1,3-二羥基丙酮的方法
技術領域：
本發明屬於生物有機合成技術領域，涉及1，3-二羥基丙酮的生物有機合成方法。
背景技術：
1，3_ 二羥基丙酮一種重要的化工、生化原料，醫藥、農藥合成中間體和多功能食品添加劑，用途十分廣泛。二羥基丙酮的合成方法主要有貴重金屬催化氧化法和微生物法。重金屬催化氧化甘油的合成法，由於無法克服催化選擇性差的致命缺點，致使甘油轉化率低於40 %，DHA的產率低於25 %。工業生產方法目前是利用微生物分批發酵。該法是在菌體生長到適當的時期，利用菌體產生的脫氫酶以甘油為底物進行脫氫反應，產生DHA。用於生產 DHA的微生物主要是醋酸桿菌屬(AcetcAacter)和葡萄糖桿菌屬(Gluconobacter)微生物， 尤其是弱氧化醋酸桿菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖桿菌(Gluoonobacter Oxydans)。菌種在復甦後先進行預培養，然後轉發酵罐擴大培養，待菌種達到一定濃度後， 接種到含有甘油的發酵培養基當中，經過60-80h的耗氧發酵後，再將發酵液一次放出，經分離純化得到DHA。每一個分批發酵過程都經歷接種、生長繁殖、菌體衰老進而結束髮酵，最終提取出產物。目前已有採用分流加甘油方法，在菌體生長到對數期時，並在產物DHA達到一定水平後，放出部分產物，並補加原料和培養基，這樣就可以減少達到生產水平的生物量的時間，提高底物甘油的利用率，節約成本。分批發酵的特點是微生物所處的環境是不斷變化的，發生雜菌汙染，能夠很容易終止操作。在發酵生產中，使用的菌種處於對數生長期，把它們接種到發酵罐新鮮培養基時，幾乎不出現調整期，這樣可在短時間內獲得大量生長旺盛的菌體，有利於縮短生產周期。但該法的主要問題是底物甘油和產物DHA在培養基中的濃度過高時產生了高滲透壓，使得發酵菌體裂解、失活，從而導致DHA的產率難以提高。本發明是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術， 將脫氫酶基因整合進大腸桿菌J M 109，構建甘油脫氫合成1，3_ 二羥基丙酮的工業工程菌，並採用超分子自組裝模板固定化，然後在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。合成工藝路線簡捷，既節能又環保，所獲得的產品質量高和成本低，總質量收率達到75%以上。

發明內容
本發明的目的在於提供一種合成由甘油發酵合成1，3_ 二羥基丙酮的方法，是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌J M 109，構建甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮的工業工程菌，並採用超分子自組裝模板固定化，然後在含有甘油的培養基中發酵合成1，3_ 二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。本發明通過下述方法實現的地衣芽孢桿菌分離培養基蒸餾水IOOOmL,甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，調pH7. 0，0. IMPa滅菌20min.冷卻至 45°C，加入尼爾紅(NileRed) 2mL/L(0. 30mg Nile Red溶於IOOmL 二甲基亞碸)，無菌條件下倒入培養皿，冷卻後備用。富營養培養基蒸餾水IOOOmL,酵母粉10g，瓊脂粉10g，甘油3g，(NH4) 2S045g,調 ρΗ7· 0,0. IMPa 滅菌 IOmin.產品發酵培養基磷酸鹽緩衝液的配製蒸餾水lOOOmL，NaH2PO4. 12H20 8. 95g，KH2PO4L 5g， ρΗ7· 00. IMPa 滅菌，15min 20min,備用。基因工稈菌富集培養基為LB培養基發酵培養基為添加15. 0%甘油的LB培養基，以鼓入空氣作為基因工程菌氧化劑；培養溫度為35°C。地衣芽孢桿菌B-05571發酵及DHA的提取甘油發酵前培養是在L-試管中，以無菌操作加入5ml富營養培養基，以無菌牙籤接入地衣芽孢桿菌B-05571的單菌落。35°C、120r/min培養15h。將前培養物0. 5ml接種至含有100ml富營養培養基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養Mh。4°C，6000*g 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，然後在4°C，6000 無菌離心12min，棄上清。將前培養物0. 5ml接種至含有100ml富營養培養基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振蕩培養Mh。4°C，6000 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，再次在4°C ,6000 無菌離心12min，棄上清。將超分子自組裝模版 3g加入其中，在20 25°C下進行固定化池。在分別將不含有富營養培養基的菌體無菌接入10瓶含有IOOrn發酵培養基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養72h。發酵產物的分離發酵收穫後，離心分離和回收催化酶，發酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機濃縮後，使用乙酸丁酯和石油醚(1 4體積)重結晶得到產品。
具體實施例方式下面結合具體的實施例，對本發明作進一步的闡述，但不限於這些具體的實施例， 而所有的實施例均按上述的操作步驟操作。實施例1地衣芽孢桿菌分離培養基蒸餾水lOOOmL，甘油5g，NaCl 5g，酵母粉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，調pH7. 0，0. IMPa滅菌20min.冷卻至 45°C，加入尼爾紅(Nile Red) 2mL/L(0. 30mg Nile Red溶於IOOmL 二甲基亞碸)，無菌條件下倒入培養皿，冷卻後備用。富營養培養基:蒸餾水lOOOmL，酵母粉10g，瓊脂粉10g，甘油3g，(NH4) 2S045g，調 ρΗ7· 0,0. IMPa 滅菌 lOmin.產品發酵培養基磷酸鹽緩衝液的配製蒸餾水lOOOmL，NaH2PO4. 12H20 8. 95g，KH2PO4L 5g， ρΗ7· 00. IMPa 滅菌，15min 20min,備用。基因工程菌富集培養基為LB培養基發酵培養基為添加15.0%甘油的LB培養基，以鼓入空氣作為基因工程菌氧化劑；培養溫度為35°C。地衣芽孢桿菌B-05571發酵及DHA的提取甘油發酵前培養是在L-試管中，以無菌操作加入5ml富營養培養基，以無菌牙籤接入地衣芽孢桿菌B-05571的單菌落。35°C、120r/min培養15h。將前培養物0. 5ml接種至含有IOOml富營養培養基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養Mh。4°C，6000*g 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，然後在4°C，6000 無菌離心12min，棄上清。將前培養物0. 5ml接種至含有IOOml富營養培養基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振蕩培養Mh。4°C，6000 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，再次在4°C ,6000 無菌離心12min，棄上清。將超分子自組裝模版 4g加入其中，在20 25°C下進行固定化4h。分別將不含有富營養培養基的菌體無菌接入 10瓶含有200m發酵培養基的500ml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養72h。發酵產物的分離發酵收穫後，離心分離和回收催化酶，發酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機濃縮後，使用乙酸丁酯和石油醚(1 4體積)重結晶得到1，3-二羥基丙酮23. Ig(熔點78. 9 80. 0°C，收率77. 0% )。實施例2各培養基的組成和培養條件同上。甘油發酵前培養是在L-試管中，以無菌操作加入5ml富營養培養基，以無菌牙籤接入地衣芽孢桿菌B-05571的單菌落。33°C、120r/min培養20h。將前培養物0. 5ml接種至含有IOOml富營養培養基的500ml三角瓶中，30°C、120r/min振蕩培養30h。4°C，6000*g 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，然後在4°C，6000 無菌離心12min，棄上清。將前培養物0. 5ml接種至含有IOOml富營養培養基的500ml三角瓶中，35°C、130r/min振蕩培養Mh。4°C，6000 無菌離心lOmin，棄上清，在離心管中以無菌磷酸鹽緩衝液振蕩混勻，再次在4°C ,6000 無菌離心12min，棄上清。將超分子自組裝模版 4g加入其中，在20 25°C下進行固定化池。分別將不含有富營養培養基的菌體無菌接入 5瓶含有300m發酵培養基的IOOOml三角瓶中，30°C、130r/min振蕩培養96h。發酵產物的分離發酵收穫後，離心分離和回收催化酶，發酵母液使用乙酸丁酯萃取，將萃取所得的有機濃縮後，使用乙酸丁酯和石油醚(1 4體積)重結晶得到1，3-二羥基丙酮 36. 33g(熔點 78. 7 80. 0°C，收率 80. 7% )0
權利要求
1.本發明涉及1，3-二羥基丙酮的合成，是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌 B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌JM109，構建甘油脫氫合成1，3- 二羥基丙酮的工業工程菌，並採用超分子自組裝模板固定化，然後在含有甘油的培養基中發酵合成1，3_ 二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。
2.按照權利要求1所述，其特徵在於甘油脫氫合成1，3_二羥基丙酮的工業工程菌的構建是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌JM109。
3.按照權利要求1所述，其特徵在於採用超分子自組裝模板對甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮的工業工程菌固定化，所採用的超分子自組裝模板要求平均孔徑為15 35納米，並在酸性水溶液中結構穩定。
4.按照權利要求1所述，其特徵在於將經固定化的甘油脫氫合成1，3_二羥基丙酮的工業工程菌，在含有甘油的培養基中發酵合成1，3_ 二羥基丙酮，發酵的工藝技術條件為溫度 300C、130r/min 振蕩培養 72h。
5.按照權利要求1所述，其特徵在於發酵液先經過濾分離催化酶重複使用，利用乙酸丁酯萃取濾後發酵液，再將萃取液濃縮後，利用乙酸丁酯與石油醚按體積比1 4的組合溶劑重結晶，獲得產品1，3-二羥基丙酮。
全文摘要
本發明涉及1，3-二羥基丙酮的合成，是將從酸性土壤分離和篩選的地衣芽孢桿菌B-05571，使用基因重組和DNA重排技術，將脫氫酶基因整合進大腸桿菌J M 109，構建甘油脫氫合成1，3-二羥基丙酮的工業工程菌，並採用超分子自組裝模板固定化，然後在含有甘油的培養基中發酵合成1，3-二羥基丙酮。通過過濾發酵液、有機溶劑萃取和組合溶劑重結晶等獲得產品1，3-二羥基丙酮。合成工藝路線簡捷，產品質量高和成本低，總質量收率達到75％以上。
文檔編號C12R1/19GK102250970SQ201110137610
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月26日 優先權日2011年5月26日
發明者傅堯, 封立剛, 張穎, 徐清, 曹文化, 李玉玲, 騰道路, 趙紅, 鄧晉, 郭慶祥 申請人:徐州恆源生物工程有限公司