一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用的製作方法

2023-07-31 22:18:51

專利名稱：一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用，特別涉及一種在固態發酵培養下真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
固態發酵是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態基質上的發酵方式，固態基質中氣、液、固三相併存，即多孔性的固態基質中含有水和水不溶性物質。與其他培養方式相t匕，固態發酵具有很多優點，因此，固態培養已經成為一種普適性的培養方法，在白酒、陳醋和產酶的生產工藝上應用較為成熟。真菌分泌的纖維素酶主要有外切葡聚糖苷酶，內切葡聚糖苷酶和β -葡萄糖苷酶，其中外切酶佔大多數。自然界中植物光合作用產物的絕大部分是作為植物細胞壁組分的木質纖維素類物質，大約佔生物質資源總量的80%以上，此外，每年農林廢棄物和工業纖維性廢渣也有上億噸，而木質纖維素中纖維素主要以結晶狀態存在，外切葡聚糖酶是唯一對結晶纖維素起作用的纖維素酶，在木質纖維素降解成還原糖的過程中，外切葡聚糖酶起著非常關鍵的作用。因此要更加充分利用自然界中廣泛存在的纖維素資源，外切葡聚糖酶是不可缺少的。葡萄糖苷酶在其它方面也有重要作用，比如芳香植物中有許多以糖苷鍵合態形式存在的風味前體物質，通過β_葡萄糖苷酶的水解可以釋放出其中潛在的芳香成分，從而可以增加植物芳香物，這對於天然香精香料工業有著重要意義(陳軍傑(2005)。β_葡萄糖苷酶的液態發酵生產及其應用。江南大學)。在纖維素降解上，真菌分泌的纖維素酶液中β_葡萄糖苷酶酶活較低，通常導致纖維二糖的積累，致使其反饋抑制纖維二糖水解酶和內切酶的酶活，因此，若酶液中β -葡萄糖苷酶酶活提高，會降解纖維二糖解除這種抑制作用，從而促進纖維素的降解。(張裕卿，梁江華，李濱縣(2007)，β_葡萄糖苷酶促進纖維素降解的應用，天津大學學報第40卷第3期317-320)。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，在固態條件下提供一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用。本發明技術方案如下:一種核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的真菌纖維素酶酶活調控基因在製備高活性真菌纖維素酶系中的應用。上述應用，將裡氏木黴中的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的基因片段敲除後，插入尿苷篩選標記，然後經固態發酵後，製得高活性真菌纖維素酶系。上述應用，具體步驟如下:將核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示基因片段轉化入裡氏木黴(Trichodermareesei)中，轉化的同時敲除了裡氏木黴中核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的基因片段，製得轉基因裡 氏木黴，然後在固體培養基中，28 32°C培養4 6天，用pH4.8、濃度為0.05mol/L檸檬酸緩衝液浸泡菌體2 3h，經離心分離，取上清，製得高活性真菌纖維素酶系。根據本發明優選的，所述固體培養基組分如下，每十五克組分如下:麩皮2g，(NH4) SO40.5g, KH2PO4L 5g, MgSO40.06g, CaCl20.06g，微晶纖維素 2g，餘量水。根據本發明優選的，所述裡氏木黴(Trichodermareesei)為裡氏木黴(Trichodermareesei) QM9414 Δ Ku70菌株，菌種保藏編號:26921,購自美國菌種保藏中心(ATCC)。根據本發明優選的，所述的離心，條件為12000rpm離心lOmin。有益效果本發明所述的真菌纖維素酶酶活調控基因可用於調控真菌中纖維素酶酶系，通過敲除盒取代該真菌纖維素酶酶活調控基因後，相比原初發菌株，在固態條件下培養，外切葡聚糖甘酶酶活和β -葡聚糖甘酶比酶活分別提高2.5倍和3倍，相較現有採用復配提高酶活的方法，更加方便，從而可以滿足各行業對不同纖維素酶酶活的需求。



圖1是實施例1製得的敲除盒的電泳圖。其中:1、實施例1中裡氏木黴(Trichodermareesei)QM9414 Λ Ku70當中構建的敲除盒，2、2kb Plus II Marker ；圖2是實施例3得到的轉化子驗證示意圖。圖3是實施例3得到的轉化子PCR驗證圖。其中:M:2kb Plus Marker, 1:利用 yzF和 yzR驗證出發株 QM9414 Λ Ku70, 2:利用yzF和yzR驗證轉化子,3:利用mapkl和yzin R驗證出發株QM9414 Δ Ku70,4:利用mapkl和yzin R驗證轉化子；圖4是實施例3得到的轉化子Southern blotting驗證圖。其中:M:2kb Plus Marker, 1:轉化子條帶，2:出發株 QM9414 Δ Ku70 ；圖5是實施例4轉化子與出發株固態發酵胞外酶液中β-葡萄糖苷酶比活力圖。其中:T.reesei Λ tmk3表示轉化株β _葡萄糖苷酶比活力，Τ.reesei表示出發株β-葡萄糖苷酶比活力；圖6是實施例4轉化子與出發株固態發酵胞外酶液中外切酶比活力圖。其中:T.reesei Λ tmk3表示轉化株外切酶比活力圖,Τ.reesei表示出發株外切酶比活力具體實施例方式下面結合說明書附圖及實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於此。培養基麩皮培養基組分如下，均為重量百分比:10wt%麩皮浸出液，2wt%瓊脂，餘量水。基本培養基組分如下，每升組分如下:
葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g，胰蛋白腖 IOg, ρΗ5.5。下層培養基組分如下，每升組分如下:葡糖糖20g, KH2PO415g, Sorbitol 182.1g,瓊脂糖 IOg, I μ g/ml 的抗硫胺素，1.5%瓊脂糖。上層培養基組分如下，每升組分如下:葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g,胰蛋白腖 IOg, Sorbitoll82.lg,I μ g/ml的抗硫胺素，1.5%瓊脂糖。選擇培養基組分如下，每升組分如下:葡萄糖20g, (NH4) S045g, KH2P0415g, MgSO40.6g, CaCl20.6g, FeSO4.7H200.005g,MnSO4.H2O0.0016g, ZnSO4.7H200.0014g, CoCl20.002g，胰蛋白腖 IOg, 1.5% 瓊脂糖。所述固體培養基組分如下，每十五克組分如下:麩皮2g，(NH4) SO40.5g，KH2PO4L 5g，MgSO40.06g，CaCl20.06g，微晶纖維素 2g，餘量水。生理鹽水組分如下，均為重 量百分比:0.9wt%NaCl,0.5wt%吐溫80。抽提緩衝液組分如下，組分如下:200mMTris-HCl, 250mmol/L NaCl, 25mmol/LEDTA, 2%十二烷基硫酸鈉，pH8.5。菌株裡氏木黴(Trichodermareesei) QM9414 Λ Ku70 菌株,菌種保藏編號:26921,購自美國菌種保藏中心(ATCC)。實施例1真菌纖維素酶酶活調控基因敲除盒的獲得:(I)將裡氏木黴(Trichodermareesei) QM9414 Δ Ku70菌株在麩皮培養基上培養三天，然後用生理鹽水將孢子洗脫下來，按照IXlO8比例接入基本培養基中，200rpm，30°C生長兩天，4000rpm離心，收集菌體，收集於1.5ml離心管中；(2)向離心管中加入500 μ I抽提緩衝液和0.1g石英砂，漩渦劇烈振蕩lmin，使菌體分散於抽提緩衝液中，65°C，放置20min ;加入500 μ I苯酚/氯仿(體積比1:1)，漩渦劇烈振蕩30s, 12000rpm室溫離心IOmin,收集上清；將上清液轉至另一無菌的1.5ml離心管中，加入0.1倍體積的3M NaAc溶液(ρΗ4.8)和0.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，_20°C放置15min ; 12000rpm，4°C，lOmin，棄上清，加濃度為0.1 μ g/ μ I RNAase的ddH20200 μ 1，37°C，靜置Ih ;加入200 μ I苯酚/氯仿(體積比1:1)抽提一次，12000rpm, IOmin ;上清轉移至另一 1.5ml離心管中，加0.1倍體積3MNaAc (ρΗ4.8)和 0.6 倍體積異丙醇，_20°C放置 20min, 12000rpm, 4°C, lOmin,收集沉澱；力口700μ 170%乙醇(V/V)，洗滌一次(12000rpm，2min);待乙醇揮發完全，用50 μ I ddH20溶解裡氏木黴基因組DNA，製得裡氏木黴基因組DNA ；(3)以裡氏木黴基因組DNA為模板，利用引物:上遊引物mapk1:GGCCGAGCTCAGACATAGGAGG 和下遊引物mapk2:GATTGTACCCCAGCTGCGGGAGACGGGAAGTGAGGGG,
進行PCR 擴增，PCR 條件為-MV 5min ；94°C 30S,60°C 30s, 72°C 1.5min，30 個循環；72°C，10min，4°C保存，製得片段I。(4)以裡氏木黴基因組DNA為模板，利用引物:上遊引物mapk3:CGCAGCTGGGGTACAATC,和下遊引物mapk4:CGTCTCCCTCATTACCCTC,進行PCR 擴增，PCR 條件為:94°C 5min ；94°C 30S，65°C 30s, 72°C 2min，30 個循環；72°C，lOmin，4°C保存，製得片段2。(5)以裡氏木黴基因組DNA為模板，利用引物:上遊引物mapk5:GAGGGTAGTAATGAGGGAGACGGCCGTCGATTCTCCCTGGTC,和下遊引物mapk6:GGGGTTGTGGCTCTGGAGAG,PCR 擴增，PCR 條件為:94°C 5min ；94°C 30s，59°C 30s, 72 °C 1.5min，30 個循環；72°C，10min，4°C保存，製得片段3。(6)將上述PCR擴增的三個片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，其中片段1、片段3大約在1400bp，片段2大約在2000bp。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收三個片段；將片段1、片段2、片段3按照1:3:1的摩爾比例混合，製得混合液。採用的PCR 條件為-MV 5min ；94°C 30s, 58°C 10min，72°C 3min，12 個循環；72°C,10min，4°C 保存。

(7)取出I μ I混合液，稀釋10倍做為模板，利用引物:上遊引物mapk7: CCCTGTTCTCTGCCCGCTATCG,和下遊引物mapk8:CGTGTTCGTGCTGCCGTACG,PCR 擴增條件:94 °C 5min ；94 °C 30smin,58 °C 45s, 72 °C 5min,30 個循環；72°C，lOmin，製得敲除盒，序列如SEQ ID N0.3所示，命名為MAPK，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，約4600bp,如圖1所示。實施例2轉化裡氏木黴QM9414 Δ Ku70菌株(I)將裡氏木黴QM9414 Δ Ku70菌株在麩皮培養基上培養三天，利用生理鹽水，洗脫下孢子，在麩皮麩皮培養基上蓋一玻璃紙，並在其上面加入100 μ I孢子懸液，塗布均勻，30°C培養約15h，製得帶有萌發孢子的玻璃紙。(2)加0.1g裂解酶(購自sigma公司，商品名稱sigma#L_1412)到20ml溶液I(1.2M山梨醇，0.1M KH2PO4)中，輕輕搖均；吸取2 3ml酶液到無菌培養皿中，加一層帶有萌發孢子的玻璃紙，再加2 3ml酶液，依次疊放10層。放置培養皿於30°C培養箱中。酶解90min後，用鑷子(無菌)挑取玻璃紙，用移液槍吸取溶液衝掉玻璃紙上殘留的菌絲體，用玻璃棉漏鬥過濾原生質體懸液到置於冰上的50ml離心管中,然後用數毫升溶液I衝洗玻璃棉，然後2000rpm，4°C離心lOmin，去除上清液並用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/L CaCl2,10mmol/L TrisHCl)重懸原生質體,2000rpm, 4°C離心IOmin,去除上清液,用0.5 1.0ml溶液2 (4°C)重懸原生質體，放置原生質體在冰上，製得原生質體懸液。(3)將轉化體系(200 μ I原生質體懸液，10 μ I敲除盒，50 μ I聚乙二醇)在冰上放置20min，後加2ml PEG(室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，加入4ml溶液2，混勻；吸取
0.2 Iml到4ml預保溫的上層培養基中，輕輕混勻，倒在鋪有下層培養基的平板上，凝固後，置於30°C培養，待長出轉化子，挑取轉化子，在篩選培養基上培養3 4d後，用接種針挑取轉化子到選擇培養基，培養生孢，製得孢子。(4)將孢子轉入基本培養基中，提取染色體進行驗證。實施例3轉化株的驗證( I)設計引物驗證轉化株利用引物:上遊引物mapkl:GGCCGAGCTCAGACATAGGAGG,和下遊引物yzinR:TCATCGACTGGGCGCACATTG,進行PCR擴增(分別以QM9414 Δ Ku70和轉化子基因組為模板)，PCR條件為:940C 5min ；94°C 30S,59°C 45s, 72°C 2.5min，30 個循環；72°C，lOmin，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳，結果發現轉化子有一條2400bp的條帶，而QM9414 Δ Ku70未有此條帶，如圖2所示。利用引物:上遊引物yz F:TATCGCCCCATCACAACCCC，和下遊引物yz R: CCGAAGCTACAGAGGAGCTG,進行PCR擴增(分別以QM9414 Δ Ku70和轉化子基因組為模板)，採用PCR條件為-MV 5min ；94°C 30s, 60°C 45s, 72°C 2.5min,30cycle ;72°C，lOmin，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳，結果發現轉化子有一條2500bp的條帶，而QM9414 Δ Ku70擴增出一條3500bp的條帶，如圖2所示。(2) southern 驗證轉化子1、以提取的裡氏木黴QM9414基因組DNA為模版，利用引物上遊引物SB F: CAGCCCAGCACCAAAAGG，和下遊引物SB R:AGTCCCTGCTCGCCTCTT,採用PCR 條件為-MV 5min ；94°C 30S，59°C 30s, 72°C 0.5min，30 個循環；72°C,10min，4°C 保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結果，結果發現有一條500bp條帶，製得探針模板；2、取16μ I的探針模板(IOng 3ug),沸水浴中煮沸IOmin,迅速插入冰中，製得變性模板；將DIG-High Prime (購自Roche公司)充分混勻，取4μ I加入上述變性模板中，混勻後離心，370C，孵育20h，65°C水浴lOmin，終止反應。用HindIII內切酶(購自Fermentas公司)酶切基因組DNA，酶切反應體系為:60μ 110X酶切緩衝液，3U內切酶/μ g DNA，30 μ g基因組DNA，無菌ddH20補足至600 μ I ；37°C酶切過夜，65°C加熱，IOmin終止酶切反應。(3)將酶切後的基因組DNA用氯仿/異戊醇(混合比例1:1)抽提一次，無水乙醇_20°C沉澱過夜，70%乙醇洗滌2次，三蒸水重溶，體積控制在20 μ I左右；0.8wt%瓊脂糖凝膠電泳分離，緩衝液為I X TBE，電泳電壓40v，按照需要待指示劑溴酚藍遷移至合適位置時停止電泳；然後將凝膠經變性液(0.5M NaoH, 1.5MNacl)處理20min,重複一次，再用去離子水漂洗兩次，將凝膠浸泡於中和液(0.5MTris-HCl (pH7.5)，3M NaCl)中和20min，並重複一次。將DNA從膠中轉移到尼龍膜上，轉移時間14小時，然後用2*SSC漂洗膜，121烘乾半小時。(4)將烘乾後的尼龍膜放入雜交杯中，加入雜交液3mL到雜交杯中，68°C預雜交2h。預雜交結束後，棄預雜交液，加入含探針雜交液。雜交溫度45度，雜交過夜。50mL洗滌液I (5ml20XSSC，44.5mL水，0.5mll0%十二烷基硫酸鈉。)洗膜5minX 2次，然後用50mL洗滌液 II (1.25ml20XSSC，47.25ml 水 +0.5mllO%SDS。)洗膜於雜交爐中，68°C 洗 15minX2次，然後加入馬來酸緩衝液10ml，室溫洗滌5分鐘。加入20ml的I X封堵液(18ml馬來酸緩衝液，2mllOX封堵緩衝液)，室溫放置30min。加入稀釋10000倍的抗體20ml (1.6mllOX抗體溶液，14.4ml馬來酸緩衝液，1.6ul抗體)室溫放置30min。加入80ml洗液(80ml馬來酸緩衝液+240ul Tween20)室溫放置15min，重複一次。加入16ml檢測液室溫放置5min。加入IOml底物顯色液(IOml檢測液+200ul BCIP)，黑暗放置3小時。然後膜於無菌水中衝洗，晾乾後掃描，見圖4。實施例4轉化子及出發菌株在固態培養發酵液中，蛋白濃度，濾紙酶活，內切酶酶活，ATP,β -葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活測定:將實施例2製得的轉化子、出發菌株，在麩皮培養基上培養3天後，用生理鹽水洗脫下孢子，按照IX IO7的孢子量接入固態產酶培養基，在30°C下靜置培養，從第三天起測酶活。固態培養下酶液的獲取方法:將帶有菌體的固態培養基在20ml檸檬酸緩衝液(0.05mol/L, pH4.8)中室溫浸泡2h,然後經12000rpm離心IOmin,取上清液，即可。利用Lowery測定蛋白濃度，以pNPG和pNPC為底物測定β -葡萄糖苷酶酶活，夕卜切酶酶活。選用DNS法測定內切酶酶活，以whatman濾紙為底物測定濾紙酶活。將β-葡萄糖苷酶和外切酶換算成酶的比活力，結果見圖5，6。分析本發明將SEQ ID N0.3中核苷酸序列轉化入裡氏木黴中，取代了含有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的基因片段，經PCR和Southernb lotting驗證正確,利用固態發酵,敲除株相對出發株，β -葡萄糖苷酶比活力提高3倍，外切葡聚糖甘酶比活力提高2.5倍，內切葡聚糖甘酶酶活大約降低20%。
權利要求
1.一種核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的真菌纖維素酶酶活調控基因在製備高活性真菌纖維素酶系中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，將裡氏木黴中的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的基因片段敲除後，插入尿苷篩選標記，然後經固態發酵後，製得高活性真菌纖維素酶系O
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，具體步驟如下: 將核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示基因片段轉化入裡氏木黴中，轉化的同時敲除了裡氏木黴中核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的基因片段，製得轉基因裡氏木黴，然後在固體培養基中，28 32°C培養4 6天，用pH4.8、濃度為0.05mol/L檸檬酸緩衝液浸泡菌體2 3h，經離心分離，取上清，製得高活性真菌纖維素酶系。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述固體培養基組分如下，每十五克組分如下: 麩皮 2g，(NH4) SO40.5g，KH2PO4L 5g，MgSO40.06g，CaCl20.06g，微晶纖維素 2g，餘量水。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述裡氏木黴為裡氏木黴QM9414Δ Ku70菌株，囷種保減編號:26921,購自美國囷種保減中心。
6.如權利要求3所述的應用，其特徵在於,所述的離心,條件為12000rpm離心l0min。
全文摘要
本發明涉及一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調控基因的應用。將裡氏木黴中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段敲除後，插入尿苷篩選標記，然後經固態發酵後，製得高活性真菌纖維素酶系。本發明通過敲除盒取代該真菌纖維素酶酶活調控基因後，在固態發酵下，相比原初發菌株，外切葡聚糖甘酶比活力提高2.5倍，β-葡萄糖苷酶比活力提高3倍，調整了真菌胞外纖維素酶酶系，可以適用於不同領域的需求。
文檔編號C12N1/15GK103224921SQ20131014289
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月23日 優先權日2013年4月23日
發明者王明鈺, 趙秋爽, 方詡, 侯少麗 申請人:山東大學