一種定量高通量測序文庫的製備方法及其配套試劑盒與流程
2023-08-01 08:29:31 2
本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種精確定量製備高通量測序文庫的方法及其配套試劑盒。
背景技術：
隨著高通量測序技術的普及，針對各種不同來源樣品的高通量測序文庫製備方法及商業試劑盒也得到大量應用。市場上主流的高通量文庫製備試劑盒諸如illumina公司的truseq系列dna/rna文庫製備試劑盒，kapa公司的hyper系列建庫試劑盒，neb公司用於二代測序的nebnextdna/rna文庫製備試劑等，這些種類繁多、功能各異的試劑盒能應對不同測序平臺、不同樣本來源等各種需求，最大程度地滿足科研和臨床等實際應用。不過，目前還沒有一種完全定量化的文庫製備方法，無法滿足精準醫學和定量生物學的實際需要。
因此，本領域尚缺乏一種專門針對精確定量需求的高通量測序文庫製備方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種精確定量化的針對dna樣品的高通量測序文庫製備方法。
本發明的第一方面提供了一種銜接子，所述銜接子具有式i或ii所示的結構：
5'-s1─s2─s3─s4─s5─s6-3'(i)
5'-ps1─s2─s3─s4─s5─s6-3'(ii)
各式中，
s1為任選地引導部(n)m，n為a、t、g、c中任一鹼基，m為1-150的正整數；
ps1為磷酸化的s1；
s2為莖部1，具有seqidno.:1所示的核苷酸序列；
s3為環部，其中含有至少一個鹼基u；
s4為莖部2，具有seqidno.:2所示的核苷酸序列；
s2與s4完全互補或部分互補；
s5為無或與引導部s1互補的延伸部；
s6為無或含有至少一個鹼基t的結合部；
若s5為無，則s6為無；
「─」為化學鍵。
在另一優選例中，所述的銜接子為線性結構、或莖環結構。
在另一優選例中，所述的銜接子具有式iii或iv所示結構：
在另一優選例中，m為1-100，更佳地1-50，最佳地5-20的任一正整數。
在另一優選例中，m為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
在另一優選例中，所述環部s3具有seqidno.:3所示的核苷酸序列。
在另一優選例中，所述s6含有1個鹼基t。
在另一優選例中，所述銜接子的s2具有seqidno.:1所示的核苷酸序列；s3具有seqidno.:3所示的核苷酸序列；s4具有seqidno.:2所示的核苷酸序列。
在另一優選例中，s2與s4是完全互補的，或除了未互補的1或2個鹼基之外均為是互補的。
本發明的第二方面提供了一種基於核酸樣品構建測序文庫的方法，包括步驟：
(a)提供一用於構建測序文庫的核酸樣品；
(b)對所述的核酸樣品進行末端修復反應，獲得末端經修復的核酸樣品；
(c)對所述的末端經修復的核酸樣品進行3'末端加da尾反應，獲得經加尾的核酸樣品；
(d)將所述經加尾的核酸樣品與權利要求1-5中任一所述的銜接子混合，並進行連接反應，從而形成含「銜接子-核酸-銜接子」複合物的第一混合物；
(e)將步驟(d)中獲得的「銜接子-核酸-銜接子」複合物與user酶混合，使得銜接子中的u被降解，形成含末端分叉不互補的「銜接子-核酸-銜接子」複合物的第二混合物；
(f)將步驟(e)中獲得的含所述複合物的第二混合物與片段分選磁珠混合，使得所述片段分選磁珠吸附多餘的銜接子，並將所述被吸附的銜接子去除，獲得第三混合物；
(g)以步驟(f)獲得的所述複合物為模板，用特異性結合於銜接子的第一引物和特異性結合於銜接子的第二引物進行pcr反應，獲得擴增產物；
(h)以將步驟(g)中獲得的擴增產物為原料，製得測序文庫。
在另一優選例中，在步驟(h)中，還包括對所述擴增產物進行純化的步驟。
在另一優選例中，所述的純化包括用片段分選磁珠去除多餘的引物。
在另一優選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：
(i)對式i所示的銜接子進行5'末端磷酸化反應，使其形成式ii所示結構；
或對式iii所示的銜接子進行5'末端磷酸化反應，使其形成式iv所示結構。
在另一優選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：
(j)對式i或所示的銜接子進行退火，使其形成式iii所示結構；
或對式ii或所示的銜接子進行退火，使其形成式iv所示結構。
在另一優選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：
(k)當s5為無時，對式i-iv任一所示的銜接子進行鏈延伸反應，補齊簡併鹼基部分形成互補雙鏈。
在另一優選例中，所述步驟(c)和(d)之間還包括步驟：
(l)當s5不為無時，對i-iv任一所示的銜接子進行3'末端加dt尾反應；或
當s5為無時，對步驟(k)中獲得的銜接子進行3'末端加dt尾反應。
在另一優選例中，所述片段分選磁珠選自下組：ampurexp磁珠、hieffngsdna分選磁珠、imag片段分選磁珠。
在另一優選例中，所述測序文庫可用於illunima高通量測序平臺直接測序。
在另一優選例中，所述測序文庫可用於精確定量。
在另一優選例中，所述步驟(a)中核酸樣品總量為500pg～1μg。
本發明的第三方面提供了一種基於核酸樣品構建測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括：
一末端修復/加da尾複合酶及其緩衝液；
一t4dna連接酶；
一銜接子，所述的銜接子如本發明的第一方面中任一所述；
和說明書，所述的說明書記載了使用方法。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括：特異性結合於銜接子的第一引物和第二引物。
在另一優選例中，所述第二引物帶有測序標記(barcode)。
在另一優選例中，所述第一引物為通用引物p5，其序列如seqidno.:5所示。
在另一優選例中，所述第二引物為特異引物p7。
在另一優選例中，所述第二引物為特異引物p7，其序列如seqidno.:6所示。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括酶緩衝液。
在另一優選例中，所述試劑盒還包括pcr反應預混液。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
附圖說明
圖1是銜接子製備過程的示意圖。
具體實施方式
本發明人經過長期而深入的研究，意外開發出了一種具有式i-iv中任一所示的結構的銜接子，其能夠用於製備dna高通量測序文庫；以及使用該銜接子的構建dna高通量測序文庫的方法和相應試劑盒，使用所述方法，能夠製備精確定量的高通量測序文庫。基於上述發現，完成了本發明。
針對dna樣品製備精確定量的高通量測序文庫方法
本發明提供了一種基於核酸樣品製備定量化高通量測序文庫的方法，所述的方法包括步驟：
(a)提供一用於製備測序文庫的核酸樣品，總量為500pg～1μg(或1-200ng，或0.5-10ng)；
(b)對所述的核酸樣品進行末端修復反應；
(c)對所述的核酸樣品進行3'末端加da尾反應；
(d)提供一用於製備銜接子(adaptor)的單鏈核酸樣品，序列為附件所示，其5'末端包含有5～20個簡併鹼基，3'末端倒數第34個鹼基為u；
(e)對上述單鏈核酸樣品進行5'末端磷酸化反應；
(f)對上一步獲得的核酸樣品進行退火，使其形成莖環結構；
(g)對上一步獲得的核酸樣品進行鏈延伸反應，補齊簡併鹼基部分形成互補雙鏈；
(h)對上一步獲得的核酸樣品進行3'末端加dt尾反應，至此莖環結構銜接子(adaptor)製備完成，結構如式iv所示，其中s6為鹼基t；
(i)將末端修復後加da尾的核酸樣品與銜接子混合進行連接反應，從而形成「銜接子-核酸-銜接子」的複合物；
(j)將上一步獲得的「銜接子-核酸-銜接子」複合物與user酶混合，使得銜接子中的u被降解，形成末端分叉不互補的「銜接子-核酸-銜接子」複合物；
(k)將上一步獲得的複合物與適量片段分選磁珠混合，吸附去除多餘的銜接子；
(l)將上一步獲得的複合物與特異性結合於銜接子的通用引物(p5)和特異性結合於銜接子的特異引物(p7)混合，進行pcr反應，獲得擴增產物；
(m)將上一步獲得的擴增產物與適量片段分選磁珠混合，以去除多餘的引物，此即製備完成的測序文庫，經長度範圍檢測和濃度定量之後即可用於illunima高通量測序平臺直接測序。
(n)測序後得到的每一個讀長(reads)兩端都個帶有一個5～20個簡併鹼基的標籤，此標籤的複雜度取決於簡併鹼基的數量，理論上足夠覆蓋所有的核酸樣品，並且在擴增放大過程中被忠實保留，因此可以用於精確定量。
基於微量核酸樣品構建測序文庫的試劑盒
本發明還提供了一種基於核酸樣品製備高通量測序文庫的試劑盒，所述試劑盒包括：
一末端修復/加a尾複合酶及其緩衝液；
一t4dna連接酶；
一銜接子，所述的銜接子為莖環結構，單鏈環狀部分帶有一個鹼基u，互補雙鏈末端帶有5～20個簡併鹼基，
和說明書，所述的說明書記載了使用方法。
典型地，本發明試劑盒還包括：一通用引物和/或一特異引物。
典型地，本發明試劑盒中，所述特異引物帶有測序標記(barcode)，所述測序標記選自表1中所列出的序列。
典型地，本發明試劑盒還包括：一pcr反應預混液。
本發明的主要優點包括：
(1)本發明通過特殊設計的銜接子(adaptor)，引入一段長度為5～20個簡併鹼基，作為每一條核酸片段的獨有標籤，且不會在放大、測序以及後期信息學分析過程中混淆，能夠追溯原始樣品中每一條核酸片段的數量和種類，可以實現完全精確定量。
(2)與現有技術相比，本發明利用簡單易行的操作實現高通量測序文庫的製備。對低至500pg的核酸樣品也能順利建庫，通過常規片段分選磁珠的純化，文庫質量高，雜質少，可以直接上機測序。
(3)本發明適合於各種dna和rna樣品製備高通量測序文庫，且所需都是常規實驗技術以及容易購買到的試劑和藥品，條件易得，且操作簡便，一般實驗技術人員皆可獨立操作完成。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
實施例1dna高通量測序文庫的構建
採用式i所示銜接子(其中s5為無，s6為無)為例(參見圖1)，構建dna高通量測序文庫，銜接子預處理流程如下：
1、銜接子磷酸化
將商業合成的單鏈dna樣品溶於純水得到濃度為100μm的溶液，取5μl溶液到一隻200μlpcr薄壁管，加入1μl10×t4連接酶緩衝液(終濃度為50mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmatp，10mmdtt)，1μlt4多聚核苷酸激酶(pnk)(10u/μl)，補水至總體積為10μl。
37℃反應60分鐘，然後70℃反應25min使酶失活。
2、退火
上述反應中加入1μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，補水至總體積為20μl。
95℃加熱10分鐘，然後以0.1℃/秒的降溫速度緩慢降溫至4℃，冰上保存。
3、補平
上述體系中加入2μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，2μl濃度為10mm的dntp，3μl濃度為5u/μl的klenow酶，補水至總體積為40μl。
25℃反應30分鐘，然後用qiagen公司的qiaquicknucleotideremovalkit回收反應產物，總體積為60μl。
4、加dt尾
上述溶液中加入10μl10×nebuffer2(終濃度為50mmnacl，10mmtris-hcl，10mmmgcl2，1mmdtt)，3μl濃度為10mm的dttp，5μl濃度為5u/μl的klenow(exo-)酶，補水至總體積為100μl。
37℃反應30分鐘，然後用qiagen公司的qiaquicknucleotideremovalkit回收反應產物，總體積為30μl。至此銜接子預處理完成，可分裝後-20℃保存。
建庫方法流程如下，起始樣品dna範圍是500pg～1μg：
1、末端修復/加a尾
取200μlpcr管，加入起始樣品dna，末端修復/加da尾複合酶3μl，10×末端修復緩衝液6.5μl，補水至65μl。
20℃反應30分鐘，然後65℃反應30分鐘，4℃保存。
2、連接
上述反應中加入t4dna連接酶5μl，加入製備好的銜接子1μl(如果起始樣品dna總量<100ng，銜接子須以水稀釋10倍後使用)，補水至總體積為80μl。
25℃反應2小時。
3、上述體系中加入3μluser酶，然後37℃反應15分鐘。
上述體系中加入80μlampurexp磁珠，混勻後室溫下孵育5分鐘，然後置磁架上靜置5分鐘，待溶液變澄清透明後吸棄上清。將磁珠以新配的80％乙醇溶液洗三遍，吸棄上清，置磁架上靜置乾燥10分鐘。然後加入28μl10mmtris-hcl，ph8.0，混勻後置磁架上靜置5分鐘，然後吸取23μl上清到另一200μlpcr管中，繼續加入下面的溶液：
2×pcr預混液25μl，帶有測序標記(barcode)的濃度為25μm的特異引物1μl，濃度為25μm的通用引物1μl，總體積為50μl。
在pcr儀上執行下述反應程序：
98℃初始變性30秒，然後98℃變性10秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，此程序執行5～16個循環，最後72℃延伸5分鐘，4℃保存。
如果起始dna樣品接近1μg，那麼pcr循環數可控制在5～7；如果起始樣品為50ng，pcr循環數是10左右；如果起始樣品數是500pg，那麼pcr循環需要13～16。
用ampurexp磁珠清出產物
上述體系中加入45μlampurexp磁珠，混勻後室溫下孵育5分鐘，然後置磁架上靜置5分鐘，待溶液變澄清透明後吸棄上清。將磁珠以新配的80％乙醇溶液洗三遍，吸棄上清，置磁架上靜置乾燥10分鐘。然後加入33μl10mmtris-hcl，ph8.0，混勻後置磁架上靜置5分鐘，然後吸取28μl上清到另一新管中，此即製備好的可用於上機測序的文庫。
本發明中，銜接子中各組成部分s1-s6的序列如下：
s1為n5-20(簡併鹼基(n)長度為5～20)；
s2的序列：5'-agatcggaagagc-3'(seqidno.:1)；
s4的序列：5'-gctcttccgatct-3'(seqidno.:2)；
s3的序列：5'-acacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgac-3'(seqidno.:3)。
本發明的一個具體實施方式中，銜接子序列結構為z1-z2，
其中，z1為n5-20；
z2為5'-agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'(seqidno.:4)。
本發明的一個具體實施方式中，引物序列如下：
通用引物p5為seqidno.:5：
5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'；
特異引物p7為
p1－b－p2
式中，
p1為caagcagaagacggcatacgagattg(seqidno.:6中第1－26位)；
b為測序標記(barcode)序列，例如ttgact；
p2為gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct(seqidno.:6中第33-66位)。
在另一具體實施方式中，所述b的長度為6個nt。
在另一具體實施方式中，所述b選自下表1：
表1illumina高通量測序標記barcode編號及對應序列
在另一具體實施方式中，特異引物p7的序列為seqidno.:6：
5'-caagcagaagacggcatacgagattgttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct-3'。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表
上海交通大學
一種定量高通量測序文庫的製備方法及其配套試劑盒
p2017-0449
6
patentinversion3.5
1
13
dna
人工序列
1
agatcggaagagc13
2
13
dna
人工序列
2
gctcttccgatct13
3
40
dna
人工序列
3
acacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgac40
4
66
dna
人工序列
4
agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttc60
cgatct66
5
58
dna
人工序列
5
aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58
6
66
dna
人工序列
6
caagcagaagacggcatacgagattgttgactgtgactggagttcagacgtgtgctcttc60
cgatct66