研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法與流程

2023-08-01 01:01:12

本發明屬於醫藥生物
技術領域：
，具體涉及一種研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法。
背景技術：
：本發明屬於醫藥生物
技術領域：
，具體涉及一種研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法。技術實現要素：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，而提供一種研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，該研究方法為三葉青提取物新的醫藥用途提供了參考，可為腫瘤免疫治療藥物研發提供實驗參考。本發明採用如下技術方案：研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，步驟如下：步驟一，三葉青提取物體外誘導培養人共刺激T細胞；步驟二，檢測不同三葉青提取物對人共刺激T細胞生長的影響，記錄結果，採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。更進一步地，所述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟一中所述三葉青提取物體外誘導培養人共刺激T細胞具體為：取適量健康獻血者外周抗凝血，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含有不同細胞生長因子和刺激分子的共刺激T細胞培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種於細胞培養板中，培養箱培養，定期換液，並調整細胞密度為5×105/mL，收集培養7天的共刺激T細胞，加入單抗進行細胞表面標誌檢測。更進一步地，所述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟一中所述細胞生長因子和刺激因子為CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15、IL-18或IL-21。更進一步地，所述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟一中接種於6孔細胞培養板中，毎孔5mL，所述培養箱為37°C、5%CO2培養箱，所述定期換液為每2天半量定期換液1次，所述加入的單抗為PerCP-Py5.5標記的CD3和FITC標記的CD56。更進一步地，所述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟二中所述檢測不同三葉青提取物對人共刺激T細胞生長的影響，具體為：取培養7天的共刺激T細胞，配成細胞懸液，加入細胞培養板，設11個濃度組，分別加入共刺激T細胞，然後加入不同濃度的三葉青提取物，每組設5個復孔，同時設末加藥物空白對照組，於培養箱中培養24h、48h、72h；培養結束前每孔加入CCK820μl，繼續培養，後檢測各孔吸光值，並記錄結果。更進一步地，所述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟二中所述檢測不同三葉青提取物對人共刺激T細胞生長的影響，具體為：取培養7天的共刺激T細胞，配成5×104/mL的細胞懸液，加入96孔細胞培養板，200μl/孔，設11個濃度組，分別加入5×104/mL的共刺激T細胞，180μl/孔，然後加入不同濃度的三葉青提取物，終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6μg/mL，每組設5個復孔，同時設末加藥物空白對照組，於培養箱中培養24h、48h、72h；培養結束前4個小時每孔加入CCK820μl，繼續培養4h後於酶標儀450nm處檢測各孔吸光值，並記錄結果。更進一步地，上述的研究三葉青提取物提高人共刺激T細胞增殖的方法，其中步驟二中所述三葉青提取物為水煮脫糖部位Th-w3，即經有機溶劑提取後的三葉青藥材用水煮後，減壓蒸餾後所得的脫水物。綜上，本發明的主要研究方法為：由健康人外周血中分離單個核細胞，用含CD3mAb、CD28mAb和細胞因子：IFN-γ、IL-2、IL-1α、IL-15、IL-18和IL-21等誘導培養共刺激T細胞。收集培養第7天的共刺激T細胞，使用不同濃度的三葉青提取物作用共刺激T細胞24h、48h和72h後，CCK-8法檢測人共刺激T細胞增殖率；MTT法檢測三葉青提取對胰腺癌SW-1990生長的影響；流式細胞術（FCM）檢測三葉青提取物作用前後共刺激T細胞細胞穿孔素（PFP）、顆粒酶B(GrB)、CD107a的表達；乳酸脫氫酶（LDH）釋放法測定三葉青提取物對共刺激T細胞殺傷胰腺癌SW-1990活性；Westernblot檢測藥物誘導前後共刺激T細胞胞外信號調節激酶（ERK1/2）蛋白表達。用transwellchambers小室進行藥物誘導前後胰腺癌SW-1990遷移率檢測。劃痕癒合實驗觀察三葉青提取物誘導後胰腺癌SW-1990生長融合情況。與現有技術相比，本發明的有益效果：研究表明，三葉青提取物能明顯促進共刺激T細胞增殖，濃度為0.2mg/L時，細胞增殖率比對照組（三葉青提取物濃度：0mg/L）高46%，兩者比較有統計學差異（P＜0.05）。在三葉青提取物為0.2mg/L時誘導共刺激T細胞對靶細胞SW-1990殺傷活性最高（69.8%），與對照組（52.1%）比較差異有統計學意義（P＜0.05）。經含三葉青提取物誘導後的共刺激T細胞PFP、GrB、CD107a表達顯著高於對照組（P<0.05）。三葉青作用48h後的共刺激T細胞其ERK1/2蛋白表達較對照組均有所上調，濃度在1.6-0.02mg/L時，ERK1/2蛋白表達高於對照組（P<0.05）。經濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2mg/L三葉青誘導48h後，胰腺癌SW-1990通過transwell小孔細胞數以三葉青濃度為12.5mg/L時最低、胰腺癌SW-1990的融合率以3.2mg/L時最低，與對照組比較有統計學意義（P<0.05）。高濃度三葉青提取物能抑制腫瘤細胞生長。因此本申請可為三葉青提取物在製備人共刺激T細胞增殖劑中的新的醫藥用途提供參考，可為腫瘤免疫治療藥物研發提供實驗參考。附圖說明圖1：共刺激T細胞培養前倒置顯微鏡下細胞生長狀況（×400倍）；圖2：共刺激T細胞培養後倒置顯微鏡下細胞生長狀況（×400倍）；圖3：培養前PBMC流式結果；圖4：培養後共刺激T細胞的流式結果；圖5：三葉青提取物（Th-w3）誘導後的共刺激T細胞增殖率；圖6：三葉青提取物（TH-W3）對胰腺癌SW-1990細胞株的抑制作用；圖7：0.16μg/ml三葉青提取物（TH-W3）誘導後的共刺激T細胞顆粒酶、穿孔素和CD107a的表達；圖8：三葉青提取物Th-w3誘導的共刺激T細胞對SW-1990的殺傷活性；圖9：三葉青提取物Th-w3誘導48h後共刺激T細胞ERK1/2的表達；圖10：三葉青提取物Th-w3誘導48h後共刺激T細胞ERK1/2灰度掃描；圖11：0.16μg/ml三葉青提取物TH-W3誘導後SW-1990細胞融合結果；圖12：0.16μg/ml三葉青提取物TH-W3誘導後胰腺癌SW-1990細胞穿過率。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例1：三葉青藥材提取分離實驗情況材料三葉青乾燥塊根購於寧波市鄞州醫藥藥材公司；80%大孔吸附樹脂樹色譜儀；Yanaco顯微熔點測定儀（溫度計未校正）；VarianMAT-212型質譜儀；Bruker-speckospinAC-600P型核磁共振儀。薄層色譜矽膠板與柱色譜矽膠（100~200目、200~300目）均為山東煙臺江友矽膠開發公司生產；SephadexLH-20（20~80µm）為Pharmacia公司生產；ODSC18反相矽膠為Merck公司生產；提取用乙醇；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇為藥用級，水為蒸餾水，其餘試劑均為分析純。提取液分組：根據提取時所選用的製劑將提取液分為9組，分別命名為：TH-t、TH-p、TH-a、TH-b、TH-w、TH-w1、TH-w2、TH-w3和TH-w4各組三葉青提取物的提取方法：三葉青提取物提取參照文獻［楊陽．甘西鼠尾草及頭花蓼化學成分研究．第二軍醫大學碩士學位論文．上海：第二軍醫大學，2009］分離純化得到，經高效液相色譜（HPLC）檢查。TH-t部分：取三葉青乾燥藥材200g，加5倍體積80%乙醇水溶液浸泡24h後，加熱回流提取，共3次，每次40min，合併提取液，過濾，減壓回收蒸乾，得總提取物TH-t21.6g，得率10.8%。TH-p部分：取此總提取，加水混懸，分別採用10倍體積的石油醚（水飽和）進行分步萃取。分別得到石油醚部位TH-p0.15g，得率0.075%。TH-a部分：乙酸乙酯部位TH-a0.58g，得率0.29%。TH-b部分：正丁醇部位TH-b2g，得率1%。TH-w部分：以及水部位TH-w18.9g，得率9.45%。TH-w1部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，10%乙醇水洗脫溶液減壓回收蒸乾後得到水部位脫糖流分TH-w10.14g,得率0.07%。TH-w2部分：取水部位進行大孔吸附樹脂色譜，先使用純水進行洗脫，除去糖分，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分別依次洗脫。其中，30%乙醇水洗脫溶液蒸乾後得到水部位脫糖流分TH-w10.3g,得率0.15%。TH-w3部分：將上述經有機溶劑提取後的三葉青藥材用水煮後減壓回收蒸乾，獲得脫水物2.1克。TH-w4部分：將上述經有機溶劑提取後的三葉青藥材用減壓回收蒸乾脫水，再使用10%、30%、60%、95%乙醇水溶液分別依次脫糖，其中，獲得了10%乙醇水部位脫糖流分。表1為三葉青各成份提取方法和獲得量編號部位分組質量實際重量得率180%乙醇總提物（乙醇DMS0）TH-t21.5g0.55g10.8%2石油醚部位(DMS0)TH-p0.15g0.05g0.075%3乙酸乙酯部位(DMS0)TH-a0.58g0.58g0.29%4正丁醇部位(H2O醇)TH-b2g1.4g1%5水部位（H2O）TH-w18.9g0.04g9.45%6水部位脫糖流分（H2O）TH-w10.15g0.15g0.07%7水部位脫糖後流分（H2O）TH-w22.060.3g8水煮物（去糖）TH-w30.6g9水煮物（含糖）TH-w42.1g實施例2：三葉青提取物對共刺激T細胞增殖的影響實驗實驗材料：無血清培養基、共刺激T細胞培養基（浙江博納生物科技有限公司產品）；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞碸(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（廈門特寶生物公司）；INF-γ購於Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均購自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；入PerCP-Py5.5標記的CD3、FITC標記的CD56單抗、PE標記的穿孔素（pore-formingprotein,PFP)、顆粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC標記的CD107a（聯科生物有限公司）；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷製品株式會社)；Encore自動生化分析儀（北京希亞克技術有限公司；螢光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟體CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。共刺激T細胞培養及鑑定：取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含有不同細胞生長因子和刺激分子的共刺激T細胞培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種於6孔細胞培養板中，毎孔5ml，於37°C、5%CO2培養箱培養，每2天半量換液1次，並調整細胞密度為5×105/mL，收集培養7天的共刺激T細胞，加入PerCP-Py5.5標記的CD3、FITC標記的CD56單抗進行細胞表面標誌檢測。CCK8法檢測不同三葉青提取物對人共刺激T細胞生長的影響：取培養7天的共刺激T細胞配成5×104/mL的細胞懸液，加入96孔細胞培養板，200μl/孔。實驗組：共設11個濃度組，分別加入5×104/mL的共刺激T細胞，180μl/孔。然後加入不同濃度的三葉青提取物（終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6μg/ml），每組設5個復孔，同時設末加藥物空白對照組：於培養箱中培養24h、48h、72h。培養結束前4個小時每孔加入CCK820μl，繼續培養4h後於酶標儀450nm處檢測各孔吸光值（OD）記錄結果。增殖率（%）=（實驗OD值）—（對照OD值）/（對照OD值）×100%。統計方法：採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。結果如下：共刺激T細胞鑑定：共刺激T細胞培養前後倒置顯微鏡下細胞生長狀況見圖1和圖2。培養前外周血PBMC中CD3-CD56+為4.73%，培養10d時的共刺激T細胞CD3-CD56+比率高達38.85%，見圖3和圖4。各階段三葉青提取物對共刺激T細胞生長影響如下：在預實驗中發現，各提取階段三葉青提取物對共刺激T細胞生長影響有較大差異，在藥物濃度相同條件下，以水煮脫糖部位（Th-w3）時促共刺激T細胞生長活性最強；總提取物（Th-t）、石油醚部位（Th-p）和水部位脫糖流分次之。從圖5中可見，三葉青提取物（Th-w3）對共刺激T細胞生長均有時間依賴性，藥物誘導時間越長，促進細胞增殖越明顯，藥物濃度在0.025-0.02μg/ml時促進細胞增殖最明顯，濃度高於0.8μg/ml後可抑制細胞增殖。不同藥量組和不同時間組與組之間比較均有統計學差異（p＜0.05）。實施例3：三葉青提取物對胰腺癌細胞SW-1990抑制試驗實驗材料：無血清培養基（浙江博納生物科技有限公司產品）；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞碸(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷製品株式會社)；Encore自動生化分析儀（北京希亞克技術有限公司；螢光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟體CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。三葉青提取物對胰腺癌細胞SW-1990株生長的影響：取對數生長期對胰腺癌細胞SW-1990細胞配成3×107/L的細胞懸液加入96孔板，每孔180μl，每組設5個復孔，同時設陰性對照組；將培養板放入37℃、50mL/LCO2培養箱培養24h後，實驗組分別加入不同種類和濃度的三葉青提取物（濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50、100μg/ml），同時設不加藥的對照組。於37℃、50mL/LCO2培養箱中培養72h；在培養結束前4小時加入MTT20μl/孔，繼續培養4h後棄去上清，加入DMSO150μl，使甲贊完全溶解，於酶標儀495nm處檢測各孔吸光值（OD）記錄結果。細胞抑制率IR（%）=（對照OD值）—（實驗OD值）/（對照OD）×100%。相同實驗重複3次，取平均值。統計方法：採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。結果如下：將胰腺癌細胞SW-1990用三葉青提取物進行誘導試驗，經誘導72小時後，高濃度的三葉青提取物對三種腫瘤細胞均有抑制作用，隨著藥物濃度的增加抑制越明顯。但是，各濃度組對腫瘤細胞抑制濃度均在6.25μg/ml以上，低於1.6μg/ml時各組均無抑制現象。三葉青提取物對SW-1990細胞的抑制率見圖6。實施例4：三葉青提取物對共刺激T細胞上穿孔素、CD107a和顆粒酶B的表達和殺傷活性影響實驗實驗材料：無血清培養基、共刺激細胞T培養基（浙江博納生物科技有限公司產品）；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞碸(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（廈門特寶生物公司）；INF-γ購於Abender公司；胰蛋白酶、RPMl1640、小牛血清(均購自GIBCO公司)；人AB血清(徐州市血站)；入PerCP-Py5.5標記的CD3、FITC標記的CD56單抗、PE標記的穿孔素（pore-formingprotein,PFP)、顆粒酶B(GranzymeB，GrB)、APC標記的CD107a（聯科生物有限公司）；乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷製品株式會社)；Encore自動生化分析儀（北京希亞克技術有限公司；螢光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；流式細胞儀分析軟體CellQuest，每個標本分析細胞數≥l×104。共刺激T細胞培養及鑑定：取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含有不同細胞因子和刺激分子的共刺激T細胞培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種於6孔細胞培養板中，毎孔5ml，於37°C、5%CO2培養箱培養，每2天半量換液1次，並調整細胞密度為5×104/mL，收集培養7天的共刺激T細胞，加入PerCP-Py5.5標記的CD3、FITC標記的CD56單抗進行細胞表面標誌檢測。LDH釋放法檢測三葉青提取物（TH-W3）誘導的共刺激T細胞對SW-1990殺傷活性：取經不同濃度（分別為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12、10.24μg/ml）三葉青提取物（Th-w3）誘導48h後的共刺激T細胞配成2×109/L，作為效應細胞；對數生長期的胰腺癌細胞SW-1990配成2×108/L，作為靶細胞；將效靶細胞各取0.5ml等量混合（效靶細胞比例=10:1），同時設置不加三葉青提取物為對照組。置37°C、5%CO2培養箱中孵育6h後，輕輕混勻，重懸細胞，1500r/min離心10min，收集上清液。LDH試劑盒按說明書要求操作，340nm波長下Encore自動生化分析儀測定LDH的活性單位(U/L)。每檢測樣本設3個復管，重複3遍，取平均值。共刺激T細胞的殺傷活性=（測定管LDH單位－效應細胞自然釋放LDH管）/（靶細胞最大釋放LDH管－靶細胞自然釋放LDH管）×100%。流式細胞儀檢測共刺激T細胞上穿孔素和顆粒酶B和CD107a的表達：將培養成功的共刺激T細胞配成濃度為1.0×105/ml的細胞懸液，接種於6孔培養板，每孔3ml，然後加入終濃度分別為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三葉青提取物（TH-W3），每組3個復孔。於37℃、5%CO2培養箱中培養48h。收集細胞並用磷酸鹽緩衝液（PBS）洗滌2次，每管加入CD56-FITC抗體20μl，避光孵育30min。加入100μl固定液室溫避光孵育15min，PBS洗滌1次。每管加100μl破膜液，100μlanti-Perforin抗體及anti-granzymeB-PE抗體和APC標記的CD107a抗體，室溫避光孵育15min，PBS洗滌後，重懸於0.5ml的PBS溶液中，分別用流式細胞術檢測穿孔素、顆粒酶B和CD107a的表達。統計方法：採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。結果如下：三葉青提取物（TH-W3）對共刺激T細胞中顆粒酶B、穿孔素表達的影響結果：與0μg/ml對照組相比，濃度分別為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三葉青提取物（TH-W3）作用共刺激T細胞48h後，其穿孔素和顆粒酶B陽性表達均明顯升高，在0.1μg/ml~1.6μg/ml濃度時，具有一定的劑量依賴性。其中，0.2μg/ml三葉青提取物組的穿孔素、顆粒酶B和CD107a陽性表達率達到最高值，分別為90.48%±2.31%、69.66%±1.29%和93.37%±5.11%，而濃度超過6.25μg/ml時穿孔素和顆粒酶B陽性表達率有所下降，結果見圖7。三葉青提取物（TH-W3）誘導的共刺激T細胞對SW-1990殺傷活性如下：實驗結果顯示，濃度為0.64～0.02μg/ml三葉青提取物（TH-w3）作用72h後的共刺激T細胞細胞對胰腺癌細胞SW-1990的殺傷活性顯著高於對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在0.16μg/ml時殺傷活性達最高為56.21%，與對照組（42.7%）比較差異有統計學意義（P＜0.05）。三葉青濃度高於2.56μg/ml時，殺傷活性隨濃度增高逐漸降低，當濃度為達2.56-10.32μg/ml時，可抑制共刺激T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性（P＜0.05），結果見圖8。實施例5：三葉青提取物對共刺激T細胞ERK1/2蛋白表達實驗實驗材料：無血清培養基和共刺激T細胞培養基（浙江博納生物科技有限公司產品）；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞碸(dimethylsμlfoxideDMSO)(Sigma公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)；IL-2、IL-15和IL-21（廈門特寶生物公司）；INF-γ購於Abender公司；人AB血清(徐州市血站)；FITC和PE標記的CD3、FITC標記的CD56（聯科生物有限公司）；GAPDH、Bcl-2購自Abcam.；垂直式電泳裝置、電轉移槽（北京希亞克技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧雲天生物技術研究所）。共刺激T細胞培養及鑑定：取健康獻血者外周抗凝血10ml，淋巴細胞分離液分離單個核細胞，用含有細胞生長因子和刺激分子的共刺激T細胞培養基調整細胞密度為3.5×105/mL，接種於6孔細胞培養板中，毎孔5ml，於37°C、5%CO2培養箱培養，每2天半量換液1次，並調整細胞密度為5×105/mL，收集培養7天的共刺激T細胞，加入PerCP-Py5.5標記的CD3、FITC標記的CD56單抗進行細胞表面標誌檢測。Westernblot檢測三葉青提取物Th-w3作用前後共刺激T細胞p-ERK表達的變化：取培養7天的共刺激T細胞，配成5×108/L細胞懸液，分別接種於6孔板，3ml/孔，加入三葉青提取物Th-w3（終濃度分別至0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml），同時設置不加Th-w3對照組。繼續培養48h後，加細胞裂解液500μl裂解細胞，提取蛋白，Forlin檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉2h，一抗孵育：加入新鮮配製的1:500稀釋鼠抗人p-ERK1/2抗體，置於4°C冰箱過夜；二抗孵育：加入1:1000稀釋的鹼性磷酸酶標記馬抗鼠IgG，將濾膜浸入NBT/BCIP顯色液，終止反應後取出條帶晾乾，ODSEEY上機掃描。用ImageJ圖像分析軟體進行分析。統計方法：採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。結果如下：三時青提取物Th-w3對共刺激T細胞ERK1/2表達：不同濃度三葉青提取物Th-w3作用48h後的CD3AK細胞其ERK1/2蛋白表達較對照組均有所上調，濃度在0.64-0.01μg/ml時，ERK1/2蛋白表達均高於對照組，以0.16μg/m最明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），結果見圖9，10實施例6：三葉青提取物（Th-w3）對SW-1990細胞株移動能力實驗實驗材料：無血清培養基（浙江博納生物科技有限公司產品）；四甲基偶氮唑藍(methlthiazolyltetrazolium,MTT)和二甲基亞碸(DMSO)(Sigma公司)；24孔transweUplate(孔徑8μm，膜直徑6．5mm)和6孔細胞培養板(Coming公司)；淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所)。細胞遷移實驗：按實驗設計分為對照組和三葉青提取物Th-w3（濃度為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml）幹預組。取對數生長期的SW-1990細胞，調整密度為1.0×108/L，吸取200μL細胞懸液加入24孔遷移小室（transwellchambers）的上室，下室緩慢加入500μL培養基，37℃、50mL/LCO2培養箱中孵育48h，取出小室用RPMI1640洗滌3次，用棉球擦去上室面的細胞，下室面用無水乙醇固定10min，PBS漂洗後用0.1%的結晶紫染色10min，PBS漂洗3次。顯微鏡下計數穿過transwell小孔的細胞，觀察5個視野並拍照，實驗重複3次。侵襲抑制率（IR）=（1-實驗組遷移細胞數/對照組遷移細胞數）×100%。劃痕癒合實驗：將對數生長期的胰腺癌細胞SW-1990用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，加入6孔細胞培養板中，當SW-1990細胞生長融合達到90%時，用200μL的移液器槍頭，在培養板每孔中央的縱軸方向劃痕，吸去原培養基，用RPMI1640培養基洗2次，去除劃痕區的漂浮細胞。每孔加入10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養5ml，然後分別加入終濃度分別為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三葉青提取物Th-w3幹預組，同時設不加藥物的對照組，37℃、50mL/LCO2恆溫培養箱中孵育，在培養0、24、48h時分別於倒置顯微鏡下觀察細胞融合生長情況並拍照，每組設3個復孔，實驗重複3次。統計方法：採用SPSS13.0軟體進行統計學處理，計量資料使用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較採用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗水準α=0.05，P≤0.05有統計學意義。結果如下：劃痕癒合實驗：經濃度為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三葉青提取物Th-w3誘導48h後，胰腺癌SW-1990的融合率以0.16μg/ml時低，與對照組比較有統計學意義。其他漢黃芩濃度組誘導的SW-1990融合率也較對照組低。結果見圖11。遷移實驗結果：經濃度為0.01、0.04、0.16、0.64、2.56μg/ml的三葉青提取物Th-w3誘導48h後，胰腺癌SW-1990通過transwell小孔細胞數以三葉青提取物Th-w3濃度為0.16μg/ml時最低；濃度在0.01-2.56μg/ml時，細胞穿過率也低於對照組，各濃度Th-w3誘導組SW-1990細胞穿過率與對照組比較均有統計學差異。通過染色後洗脫液的比色結果換算的侵襲抑制率：藥物誘導的各組遷移率均低於對照組。結果見圖12。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp