異黃酮初提物的分離方法

2023-08-03 20:13:21

專利名稱：異黃酮初提物的分離方法
技術領域：
本發明涉及有機物提取工藝，尤其是對從紅車軸草中提取的異黃酮類物質的分離。
背景技術：
我們在申請專利"從紅車軸草提取異黃酮類物質的工藝"(申請號為200710153810.0) 中公開了初提物的成分較為複雜，在初提物中存在多種異黃酮類物質和親水性物質，其中主 要的異黃酮類物質為鷹嘴豆芽素A和芒柄花素，目前還沒有有效的分離工藝對紅車軸草異黃 酮初提物進行分離，就把異黃酮初提物作為產品直接上市銷售了，偶爾有一、兩篇關於分離 的報導，其工藝流程模糊，不具備操作性和實用性。
異黃酮類物質具有多種藥用功效，可以預防和治療婦女更年期綜合症，防癌抗癌，降低 心血管病的發病率，預防骨質疏鬆症。因此提高異黃酮類物質的純度，加強療效，得到了有 關人士的重視和關心。
大孔樹脂是目前常用的分離物，具有吸附量大、解吸附速度快，分離效率高的特點，使 用後可以再生，是異黃酮初提物分離可供選擇分離物。

發明內容
本發明的目的為提供一種分離效率高、易操作、成本低的異黃酮初提物的分離方法。
實現上述發明目的技術方案如下 異黃酮初提物的分離方法，具有以下步驟-(1)大孔樹脂處理-
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h(lBV為一個樹脂床體積)流 速通過樹脂層，洗至流出液加蒸餾水後不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨殘留 乙醇，然後用酸鹼處理，即用2BV的5XHCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而 後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2%的NaOH溶液以5BV/h的流速 通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性；
(2) 將處理的大孔樹脂裝入層析分離柱，層析分離柱尺寸為(H5畫X300mm;
(3) 異黃酮初提物的準備將2g異黃酮初提物用5-10g甲醇或乙醇或水溶解，再加去 離子水至500ml，調ra值為8;
(4) 異黃酮初提物的吸附將上步溶液注入層析分離柱，以2BV-4BV/h流速上樣，待 第一次上樣完成後，流出液重複上樣，上樣完後用1BV的去離子水淋洗，最後對流出液做三波長紫外比色，確定無產品流出，已全部被大孔樹脂吸附；
(5) 部分雜質的洗脫
用10-20%的乙醇作為|^脫液通入層析分離柱進行洗脫，流速2BV/h，洗脫液體積3BV， 去除親水性雜質，再以同樣流速用1BV的去離子水衝洗；
(6) 異黃酮類物質的洗脫
以65-75%乙醇作為洗脫液，以3BV/h流速通入層析分離柱,洗脫液體積4BV，待洗出 液顏色變深時開始收集，直至顏色變淺時停止。將收集液在5(TC， 0.07MP下減壓蒸餾，得異 黃酮幹品。
(7) 樹脂的再生
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過樹脂層，洗至流 出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後用酸 鹼處理，即用2BV的5XHCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h,而後用蒸餾水以同 樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2X的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並 浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性。
所述的大孔樹脂為DA201或D101或AB-8或DM301，優選的大孔樹脂為AB-8。
異黃酮初提物優選的溶劑為甲醇。
上述技術方案的原理是利用大孔樹脂對欲分離物質的吸附作用(範德華引力或產生氫 鍵)與篩選作用(樹脂本身多孔結構)，以大孔樹脂為固定相，使天然物提取液通過裝有它的 柱子，其中有效成分有選擇性的被吸附在樹脂上，雜質成分不被吸附或者吸附很弱，經過適 當的溶劑洗脫，往往在低洗脫濃度下，結合很弱的雜質先洗出，稍高濃度的洗脫液便可把結 合較強的有效成分洗出。以異黃酮為例，它的-OH可以與大孔樹脂形成氫鍵，而雜質由於沒 有此結構，與樹脂結合很弱，所以在低的醇濃度下先洗出雜質，再以較高的醇濃度洗出有效 成分。這樣異黃酮類物質可以從初提物中分離出來。
試驗內容
1、大孔樹脂的選擇
1. 1根據大孔樹脂的物理性質選取DA201, D101, AB-8， DM301四種樹脂，進行選擇試驗。 1.2樹脂的預處理
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過樹脂層，洗至流 出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨乙醇，然後用酸鹼處理，即用 2BV的5%HC1溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至 pH值為中性，接著用2BV的2%的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h,而後用蒸餾水以同樣的流速洗至PH為中性。 1. 3異黃酮水溶液的準備
將乙酸乙酯提取紅車軸草的異黃酮初提物lg，用250ml適量去離子水溶解備用。 1. 4紅車軸草異黃酮的測定方法 L4.1標準曲線的繪製 釆用三波長紫外分光光度法進行測定，精確稱取乾燥至恆重的的鷹嘴豆芽素A5. 8mg， 用甲醇溶解並定容至25mL。準確吸取O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5，和0. 6mL此溶液於10mL 容量瓶中，分別加入甲醇使成0.6mL，再用80%乙醇定容至10mL，用UV-2100分光光度計在 242， 262， 282nm三個波長處測其吸光度，計算AA(AA二A262-(A242+A282)/2)，將得到的結 果AA與鷹嘴豆芽素A濃度的關係，建立回歸方程為AA:0.0324C+0.0175，其中C是鷹嘴 豆芽素A濃度，單位為ug/mL在1. 2-10ug/mL時，線性關係良好，R=0.9997。 1.4.2測定異黃酮含量
採用三波長紫外分光光度法進行測定，將異黃酮溶液稀釋至適當濃度，在242， 262， 282nm 三個波長處測其吸光度，計算AA(AA:A262-(A242+A282)/2)，將AA代入上述回歸方程即得 到相應的異黃酮濃度C。(本實驗用鷹嘴豆芽素A的濃度來反映總異黃酮的含量)
1. 5大孔樹脂對紅車軸草異黃酮的靜態吸附及解吸附實驗(此時均用1. 4的方法測定異 黃酮的濃度)
1. 5.1大孔樹脂吸附率的測定
準確稱取預處理好的樹脂0. 5g裝入150mL具塞錐型瓶中中，精確加入1. 3步紅車軸異黃 酮水溶液60mL，置20'C恆溫振蕩器中振蕩24h,振蕩頻率140次/min,充分吸附後，過濾，測 定濾液中剩餘異黃酮濃度，按下式計算大孔樹脂室溫下的吸附率(mg/g)
麵審^ / 、吸附前溶液濃度(mg/mL)-吸附後溶液濃度(mg/mL)、戶、誠汰壬口廣,、 吸附率(mg/g)=-砲匕^旦，、-x溶液體積(mL)
樹月曰煩裡(g)
1. 5. 2大孔樹脂解吸率的測定
取按1.5. l方法吸附飽和的樹脂，精確加入60mL80X的乙醇，置20。C恆溫振蕩器中振蕩 24h，過濾，測定濾液中異黃酮的濃度，並按下式計算室溫下的解吸率。
縱脇窓 w、 _解吸液濃度(mg/mL)x解吸液體積(mL) 肸及傘(〕 樹脂質量(g)x吸附率(mg/g)^Xl00
1. 5. 3大孔樹脂的靜態吸附動力學特徵
準確稱取預處理好的樹脂0. 5g裝入150mL具塞錐型瓶中，精確加入紅車軸異黃酮水溶液 60mL，置20。C恆溫振蕩器中以振蕩頻率140次/min振蕩，，每隔一定時間移取0. lmL上清液，用80X乙醇定容至10mL，測定異黃酮含量，繪製靜態吸附動力學曲線。
1. 5. 4大孔樹脂的靜態解吸附動力學特徵
取按1. 5. 1方法吸附飽和的樹脂，精確加入60mL80X的乙醇，置20。C恆溫振蕩器中振蕩， 每隔一定時間移取O. lmL上清液，用80X乙醇定容至10mL，測定異黃酮含量，繪製靜態解吸 附動力學曲線。
比較大孔樹脂DA201, DlOl， AB-8， DM301的吸附率、解吸率、吸附靜態動力學曲線和 解吸附動力學曲線，最終選擇了AB-8樹脂，它具有吸附量大(同時間內，相同質量的的樹脂 吸附待分離產品多)，解吸附速度快，解吸附效率高(在洗脫時，短時間內有用組分即從樹脂 分離，而且最後樹脂上幾乎沒有殘餘)的特點。
2. 柱層析分離
2. 1按1. 2步處理樹脂，然後裝柱(15mm*300mm) 2. 2上樣液的準備
2g異黃酮初提物先用5-10ml甲醇溶解後，再加去離子水至500ml，調pH值8，保證溶解 良好。
2. 3異黃酮初提物被大孔樹脂的吸附
2. 4部分雜質的洗脫
2. 5異黃酮類物質的洗脫
2. 6結果
通過柱層析分離得到的異黃酮其雜質明顯減少(見圖譜)，純度為50%-70%，起到了進一 步分離純化的作用。每lg的乙酸乙酯提取物能得到產品0. 25-0. 35g 本發明具有以下有益效果
1、 通過本發明方法分離後，異黃酮中的雜質明顯減少，提高了純度，純度為50-70%， 在lg初提物中能得到異黃酮類物質0. 25-0. 35g。
2、 大孔樹脂可以反覆使用，降低了分離的成本。
3、 工藝簡單、易操作。
4、 採用乙醇溶液作為洗脫液，經洗脫工序後沒有殘留毒性，有利於以後作為藥品和保健 品的原料。


圖1為四種大孔樹脂的靜態吸附動力學曲線；
圖2為四種大孔樹脂的靜態解吸附動力學曲線； 圖3為鷹嘴豆芽素A的液相色譜曲線；圖4為芒柄花素的液相色譜曲線；
圖5為從紅車軸草中提取的異黃酮初提物液相色譜；
圖6為異黃酮初提物的一個樣品經本發明分離後的液相色譜曲線；
圖7為異黃酮初提物的另一樣品經本發明分離後液相色譜曲線。
具體實施例方式
現通過以下實施例對本發明的技術方案作進一步說明 實施例1
(1) 大孔樹脂處理
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過AB-8樹脂層，洗 至流出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後 用酸鹼處理，即用2BV的5XHCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h,而後用蒸餾水 以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2%的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層， 並浸泡3h,而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性；
(2) 將處理的大孔樹脂裝入層析分離柱，層析分離柱尺寸為cH5ramX300mm;
(3) 異黃酮初提物的準備將2g異黃酮初提物用5g甲醇溶解，再加去離子水至500ml， 調PH值為8;
(4) 異黃酮初提物的吸附將上步溶液注入層析分離柱，以2BV/h流速上樣，待第一 次上樣完成後，流出液重複上樣，上樣完後用1BV的去離子水淋洗，最後對流出液做三波長 紫外比色，確定無產品流出，已全部被大孔樹脂吸附；
(5) 部分雜質的洗脫
用10%的乙醇作為洗脫液通入層析分離柱進行洗脫，流速2BV/h，洗脫液體積3BV，去除 親水性雜質，吉以同樣流速用1BV的去離子水衝洗；
(6) 異黃酮類物質的洗脫
以65%乙醇作為洗脫液，以3BV/h流速通入層析分離柱,洗脫液體積4BV，待洗出液顏
色變深時開始收集，直至顏色變淺時停止。將收集液在5(TC， 0.07MP下減壓蒸餾，得異黃酮 工口
實施例2 (2)大孔樹脂處理
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h,接著用乙醇以2BV/h流速通過AB-8樹脂層，洗 至流出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後 用酸鹼處理，即用2BV的5XHCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h,而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2%的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層， 並浸泡3h,而後用蒸餾水以同^^的流速洗至pH為中性；
(2) 將處理的大孔樹脂裝入層析分離柱，層析分離柱尺寸為415mmX300mm;
(3) 異黃酮初提物的準備將2g異黃酮初提物用10g甲醇溶解，再加去離子水至500ml， 調PH值為8;
(4) 異黃酮初提物的吸附將上步溶液注入層析分離柱，以4BV/h流速上樣，待第一 次上樣完成後，流出液重複上樣，上樣完後用1BV的去離子水淋洗，最後對流出液做三波長 紫外比色，確定無產品流出，己全部被大孔樹脂吸附；
(5) 部分雜質的洗脫
用20%的乙醇作為洗脫液通入層析分離柱進行洗脫，流速2BV/h，洗脫液體積3BV，去除 親水性雜質，再以同樣流速用1BV的去離子水衝洗。
(6) 異黃酮類物質的洗脫
以75%乙醇作為洗脫液，以3BV/h流速通入層析分離柱，洗脫液體積4BV，待洗出液顏 色變深時開始收集，直至顏色變淺時停止。將收集液在5(TC， 0.07MP下減壓蒸餾，得異黃酮 幹品。
實施例3
(1) 大孔樹脂處理
先用體積分數95%的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過AB-8樹脂層，洗 至流出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後 用酸鹼處理，即用2BV的5XHCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水 以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2%的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層， 並浸泡3h,而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性；
(2) 將處理的大孔樹脂裝入層析分離柱，層析分離柱尺寸為4)15mmX300mra;
(3) 異黃酮初提物的準備將2g異黃酮初提物用8g甲醇溶解，再加去離子水至500ml， 調PH值為8;
(4) 異黃酮初提物的吸附將上步溶液注入層析分離柱，以3BV/h流速上樣，待第一 次上樣完成後，流出液重複上樣，上樣完後用1BV的去離子水淋洗，最後對流出液做三波長 紫外比色，確定無產品流出，巳全部被大孔樹脂吸附；
(5) 部分雜質的洗脫
用15%的乙醇作為洗脫液通入層析分離柱進行洗脫，流速2BV/h，洗脫液體積3BV，去除
親水性雜質，再以同樣流速用1BV的去離子水衝洗。(6)異黃酮類物質的洗脫
以70%乙醇作為洗脫液，以3BV/h流速通入層析分離柱,洗脫液體積4BV，待洗出液顏 色變深時開始收集，直至顏色變淺時停止。將收集液在5(TC， 0.07MP下減壓蒸餾，得異黃酮 幹品。
權利要求
1、異黃酮初提物的分離方法，其特徵為具有以下步驟(1)先用體積分數95％的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過樹脂層，洗至流出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後用酸鹼處理，即用2BV的5％HCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2％的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性；(2)將處理的大孔樹脂裝入層析分離柱，層析分離柱尺寸為φ15mm×300mm；(3)異黃酮初提物的準備將2g異黃酮初提物用5-10g甲醇或乙醇或水溶解，再加去離子水至500ml，調PH值為8；(4)異黃酮初提物的吸附將上步溶液注入層析分離柱，以2BV-4BV/h流速上樣，待第一次上樣完成後，流出液重複上樣，上樣完後用1BV的去離子水淋洗，最後對流出液做三波長紫外比色，確定無產品流出，已全部被大孔樹脂吸附；(5)部分雜質的洗脫用10-20％的乙醇作為洗脫液通入層析分離柱進行洗脫，流速2BV/h，洗脫液體積3BV，去除親水性雜質，再以同樣流速用1BV的去離子水衝洗；(6)異黃酮類物質的洗脫以65-75％乙醇作為洗脫液，以3BV/h流速通入層析分離柱，洗脫液體積4BV，待洗出液顏色變深時開始收集，直至顏色變淺時停止。將收集液在50℃，0.07MP下減壓蒸餾，得異黃酮幹品；(7)樹脂的再生先用體積分數95％的乙醇充分浸泡24h，接著用乙醇以2BV/h流速通過樹脂層，洗至流出液加蒸餾水不呈白色混濁為止，再用蒸餾水以同樣流速洗淨樹脂上殘留的乙醇，然後用酸鹼處理，即用2BV的5％HCl溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH值為中性，接著用2BV的2％的NaOH溶液以5BV/h的流速通過樹脂層，並浸泡3h，而後用蒸餾水以同樣的流速洗至pH為中性。
2、 根據權利要求1所述的異黃酮初提物的分離方法，其特徵為大孔樹脂為DA201或DIOI 或AB-8或DM301。
3、 根據權利要求1或2所述的異黃酮初提物的分離方法，其特徵為大孔樹脂為AB-8。
4、 根據權利要求1所述的異黃酮初提物的分離方法，其特徵為異黃酮初提物用甲醇溶解。
全文摘要
本發明為異黃酮初提物的分離方法，涉及有機物提取工藝領域，從紅車軸草中提取的異黃酮初提物成分較為複雜，將異黃酮類物質從初提物中分離，目前還沒有有效的分離工藝，本發明採用AB-8大孔樹脂作為分離物，將異黃酮初提物用甲醇溶解，以2BV-4V/R的流速通過層析分離柱，異黃酮初提物被大孔樹脂吸附，經濃度為10-20％的乙醇溶液將部分雜質洗脫，再用濃度為65-75％的乙醇溶液將異黃酮類物質洗脫出來，經減壓蒸餾得到異黃酮幹品，本發明具有分離物純度高，純度為50-70％，1g初提物中能得到0.25-0.35g異黃酮類物質，無殘留毒性，分離成本低，工藝簡單易操作的有益效果。
文檔編號C07D311/36GK101407507SQ20071016351
公開日2009年4月15日 申請日期2007年10月12日 優先權日2007年10月12日
發明者周振亞, 白高英, 趙志光, 馬曉軍, 亮 黃 申請人:蘭州大學