基因毒性檢測的製作方法

2023-08-03 15:09:51

專利名稱：基因毒性檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於檢測引起或促進DNA損傷的介質(agent)的方法，並且涉及可以在這樣的方法中應用的分子和轉染的細胞系。特別地，本發明涉及在人類細胞培養物中用於檢測DNA損傷的生物傳感器。
DNA損傷由許多介質誘導，諸如紫外線，X射線，自由基，甲基化介質和其它誘變化合物。DNA損傷還可以由影響與DNA相互作用的酶和蛋白(包括聚合酶和拓撲異構酶)的介質或由前誘變劑(可以被代謝成為誘變物的介質)間接引起。這些介質的任何一種都可能引起包括生物體遺傳密碼的DNA的損傷並且在基因中引起突變。在動物中，這樣的突變可以引起致癌作用，或可以損傷配子，在後代中引起先天性缺陷。這樣的DNA損傷劑全部叫作基因毒素。
這些DNA損傷劑可以化學修飾包括DNA的核苷酸，並且還可以斷裂連接核苷酸的磷酸二酯鍵或者破壞鹼基之間的締合(T-A或C-G)。為了抵抗這些DNA損傷劑的作用，細胞已經進化了許多機制。例如，大腸桿菌(E.coli)中的SOS應答是由DNA損傷誘發的非常有特徵的細胞應答，其中一系列的蛋白被表達，包括修復受損傷的DNA的DNA修復酶。在哺乳動物中，核苷酸切除修復和鹼基切除修復機制在DNA損傷修復中起重要作用，並且是用於移除大的DNA加合物和修飾的鹼基的主要機制。
在許多情況下，確定是什麼介質引起或促進DNA損傷是重要的。當評估將人暴露於這些介質是否安全時，檢測引起DNA損傷的介質是特別重要的。例如，檢測這些介質的方法可以用作用於篩選候選藥物、食品添加劑或化妝品的化合物的基因毒性檢測，以評估目的化合物是否誘導DNA損傷。備選地，檢測DNA損傷劑的方法可以用於監測含有誘變化合物的汙染物質對水源的汙染。
用於確定介質毒性的許多方法，諸如埃姆斯試驗，體外小核檢測和小鼠淋巴瘤檢測(MLA)，是已知的，但由於許多原因並不令人滿意。例如，當通常需要在較短時限內獲得基因毒性數據時，樣品的溫育卻可能花費許多周。並且，許多已知的檢測DNA損傷的方法(包括埃姆斯試驗和相關方法)檢測在錯誤修復的DNA形式(突變和重組)中作為末端的持久的DNA損傷或在片段化DNA形式中的未修復損傷。然而，大多數DNA損傷在這樣的末端可以被檢測到之前被修復，並且持久的DNA損傷只發生在條件如此嚴峻以致所述修復機制已經被飽和時。
WO 98/44149中公開了一種改進的基因毒性檢測，其涉及包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiaie)調控元件的重組DNA分子，所述調控元件應答DNA損傷而激活可有效地連接到編碼發光報導蛋白，諸如綠色螢光蛋白(GFP)的DNA序列上的基因表達。這樣的DNA分子可以用於轉化酵母細胞，以用在檢測引起或促進DNA損傷的介質的存在的基因毒性檢測中。所述細胞可以受到介質的影響，並且所述發光報導蛋白(GFP)從細胞的表達表明所述介質引起DNA損傷。在WO 98/44149中所描述的基因毒性檢測檢測到能夠防止要到達的終點的修復活性的誘導。因此，在WO 98/44149中所描述的方法可以用於檢測DNA損傷劑的存在。
US 6,344,324公開了一種包括倉鼠GADD153上遊啟動子區域的調控元件的重組DNA分子，所述調控元件應答廣泛範圍的細胞脅迫條件而激活連接到編碼GFP的DNA序列上的基因表達。這種報導系統在人頭部和頸部鱗狀細胞癌細胞系中實行。然而，與這種報導系統相關的問題是，在引起少於10％的細胞存活的檢測介質濃度下，它需要至少4天的處理周期，接著通過流式細胞術進行螢光分析。另外，當在這種毒性水平下用介質檢測時，任何基因誘導的生物相關性都是有爭議的。並且，這種發展沒有公開具體監測可能引起或促進DNA損傷的介質存在的方法，並且GADD153誘導的機制尚不清楚。因此，這一系統作為人類DNA損傷生物傳感器應用非常有限。
因此，本發明實施方案的目的是闡述與現有技術相關的問題，並且提供用於在人類細胞培養物中檢測DNA損傷的改進的生物傳感器。
按照本發明的第一方面，提供了包括編碼報導蛋白的DNA序列的表達盒，其DNA序列可有效地連接到人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件上，其中安排所述人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件使其應答於DNA損傷而激活所述DNA序列的表達。
術語「調控元件」，我們意指調控與其締合的基因的轉錄的DNA序列，即，編碼報導蛋白的DNA序列。
術語「有效地連接」，我們意指所述調控元件能夠誘導所述報導蛋白的表達。
按照本發明的第二方面，提供了包括按照第一方面的表達盒的重組載體。
按照本發明的第三方面，提供了含有按照本發明第二方面的重組載體的細胞。
按照本發明的第四方面，提供了檢測引起或促進DNA損傷的介質的存在的方法，其包括將按照本發明第三方面的細胞處於介質的影響下；並且監測所述報導蛋白從所述細胞的表達。
本發明第四方面的方法代表了一種新型、節約的基因毒性篩選，其可以用於為製藥工業和其中需要檢測顯著數目的介質或化合物的其它應用提供預調控篩選檢測。它提供比現有的體外和體內哺乳動物基因毒性檢測更高的通量和更低的化合物消耗，並且對廣譜誘變物質敏感。
本發明第四方面的方法適於評估一種介質是否引起DNA損傷。當評估將人暴露於DNA損傷介質是否安全時，對於檢測引起DNA損傷的介質特別有效。例如，所述方法可以用作篩選已知的介質，諸如候選藥物、製藥業或工業化學藥品、殺蟲劑、殺真菌劑、食品或化妝品，是否誘導DNA損傷的基因毒性檢測。備選地，本發明的方法可以用於監測含有DNA損傷介質的汙染物對水源、瀝出液和流出物的汙染。
本發明第四方面的方法還可以用於評估介質是否促進DNA損傷。例如，某些介質可以通過抑制DNA修復(例如，通過妨礙修復蛋白的表達或功能)而不是直接造成DNA損傷而引起DNA損傷的累積。
令人驚訝地，除了人GADD45α基因啟動子外，人GADD45α基因調控元件在按照本發明第一方面的表達盒中的應用，極大地增強所述表達盒對基因毒性脅迫以及因此在按照第三方面的細胞中的DNA損傷的應答。有利地，所述表達盒可以僅僅在24小時之內或之後簡單地通過評估檢測培養物中的蛋白而分析報導蛋白的表達。所述細胞可能受到所述檢測介質或化合物的影響，並且報導蛋白在細胞中的表達表明所述檢測介質是否引起DNA損傷。
本發明人已經發現，編碼人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件的DNA可以可有效地連接報導蛋白，以形成按照本發明第一方面的盒子，並且然後有利地用於按照本發明第四方面的基因毒性檢測中。這樣的盒子可以包括完整的GADD45α基因(包括編碼序列)，條件是其可有效地連接到編碼發光報導分子的DNA上。例如，盒子可以按照本發明第一方面製備，其包括完整的，或基本上全部的GADD45α基因(包括調控元件和啟動子)，編碼報導分子的DNA插入GADD45α啟動子的3』(例如，在GADD45α編碼序列之內或在所述編碼序列的3』)。目的是安排使其應答於DNA損傷而激活所述DNA序列的表達。
優選地，人GADD45α基因啟動子序列誘導RNA聚合酶結合DNA分子，並且開始轉錄編碼報導蛋白的DNA。優選地，所述啟動子序列包括人GADD45α基因啟動子序列和5』非翻譯區。所述啟動子序列可以獲得於pHG45-HC質粒，其圖示在圖3中。在圖9中可以看到按照本發明的每一種表達盒的啟動子序列，並且GADD45α基因啟動子的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 1，2，3，4和5中顯示為鹼基4-2254。應該理解，所述啟動子可以包括鹼基4-2254的每一個，或者備選地可以是其功能性衍生物和功能性片段。功能性衍生物和功能性片段可以容易地確定評估轉錄酶是否將結合推定的啟動子區域，並且然後將引起標記蛋白的轉錄。備選地，當與GADD45α基因天然締合時，這樣的功能性衍生物和功能性片段可以通過在GADD45α啟動子上進行誘變而檢驗，並且評估GADD45α表達是否可以發生。
在按照本發明的表達盒中的調控元件可以包括GADD45α基因啟動子序列的下遊序列。所述調控元件可以包括功能性DNA序列，諸如編碼用於核糖體結合的翻譯起始序列的那些DNA序列，或與在DNA損傷之後促進基因表達的轉錄因子結合的DNA序列。按照本發明的表達盒中的調控元件可以包括GADD45α基因的至少一個外顯子。例如，所述調控元件可以包括GADD45α基因的外顯子1，外顯子2，外顯子3，和/或外顯子4，或者它的至少一個區域，或它的任何組合。因此，所述調控元件可以包括GADD45α基因的4個外顯子的任何組合，或它的至少一個區域。
在一個優選實施方案中，所述調控元件包括GADD45α基因外顯子1的至少一個區域，並且優選地GADD45α基因外顯子3的至少一個區域，並且更加優選地，GADD45α基因外顯子4的至少一個區域。特別優選地，所述調控元件包括GADD45α基因外顯子1的全部，並且優選地GADD45α基因外顯子3的至少一個區域，並且更加優選地，GADD45α基因外顯子4的全部。
在按照本發明的每種表達盒中的優選調控元件圖示在圖9中。GADD45α基因外顯子3的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 2，3和4中顯示為鹼基3405-3642。GADD45α基因外顯子3的優選區域的核苷酸序列在SEQ ID No.4中顯示為鹼基3503-3642。GADD45α基因外顯子4的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 2，3和4中顯示為鹼基4716-5391。
備選地，或額外地，所述調控元件可以包括非編碼DNA序列，例如，GADD45α基因的至少一個內含子。例如，所述調控元件可以包括GADD45α基因的內含子1，內含子2，和/或內含子3，或它的至少一個區域，或它的任何組合。因此，所述調控元件可以包括GADD45α基因3個內含子的任何組合，或它的至少一個區域。
在優選實施方案中，按照本發明的表達盒中的所述調控元件包括GADD45α基因內含子3的至少一個區域。GADD45α內含子3在圖9中圖示，並且GADD45α基因內含子3的核苷酸序列在序列表SEQ IDNo.s 2，3和4中顯示為鹼基3643-4715。
在優選的實施方案中，按照本發明的表達盒包括GADD45α基因的啟動子序列，以及在基因組GADD45α基因序列本身的內含子中發現的基因調控元件。儘管本發明人不希望受到任何假說的束縛，但是他們相信，GADD45α基因的內含子3含有推定的p53結合基序，並且正是這種p53基序令人吃驚地增強所述表達盒針對基因毒性脅迫的應答。所述推定的p53結合基序顯示為SEQ ID No.s 2，3和4的核苷酸鹼基3830-3849。
本發明人還相信GADD45α基因的內含子3可以含有推定的TRE基序，其可以編碼AP-1結合位點。所述推定的TRE基序顯示為SEQ ID No.s2，3和4的核苷酸鹼基3879-3885。因此，儘管本發明人不希望受到任何假說的束縛，但是他們假定這種推定的AP-1結合位點還可以促成針對基因毒性介質的改善的應答。
優選地，所述表達盒包括GADD45α基因內含子3的至少p53結合基序和/或AP-1結合基序。
所述調控元件可以包括GADD45α基因的3』不翻譯(UTR)區域，其核苷酸序列在SEQ ID No.s 2，3和4中顯示為鹼基4830-5391。儘管本發明人不希望受到任何假說的束縛，但是他們相信這種3』UTR可以參與mRNA盒的穩定，並且因此，當與其餘的調控元件，諸如內含子3一起應用時，可以是令人吃驚地重要。
術語「報導蛋白」，我們意指一種蛋白，當其應答本發明DNA分子的調控元件表達時，通過適當的檢測方法可以檢測到。優選地，所述報導蛋白包括發光報導蛋白。編碼發光報導蛋白的DNA序列可以編碼任何發光蛋白，例如螢光素酶和綠色螢光蛋白。然而，優選所述DNA序列編碼基本上螢光的蛋白。
編碼發光報導蛋白的優選DNA序列編碼綠色螢光蛋白(GFP)，及其發光衍生物。GFP來自水母Aequorea victoria，並且能夠吸收藍色光和再發射易於檢測到的綠色光，並且因此適於作為報導蛋白。由於其測定簡單而且無需介質並且所述蛋白是無毒性的，所以GFP可以有利地用作報導蛋白。
GFP衍生物包括編碼能夠發生光的GFP的多肽類似物和多肽片段的DNA序列。這些衍生物中有許多在與Aequorea victoria中內源發現的GFP不同的波長下，吸收並且再發射光。
例如，按照本發明第一方面優選的表達盒包括編碼人增強的GFP(hEGFP)，也叫作GFP的GFPmut1變體的DNA序列。這由含有Phe-64變成Leu，和Ser-65變成Thr的雙胺基酸取代的GFP野生型組成。HEGFP基因的編碼序列還含有多於190個沉默鹼基改變，其與相對於天然Aequorea victoria序列的人密碼子應用優先選擇相對應。這對於在人類DNA損傷報導系統中的應用特別有利。所述hEGFP序列可以獲得於

圖1中所顯示的pEGFP-N1質粒(例如，獲得於Clontech)。hEGFP序列可見於圖9中按照本發明的每種表達盒中，並且hEGFP的核苷酸序列在序列表SEQ ID No.s 1，2，3，4和5中顯示為鹼基2550-3278。
GFP產生良好量子產量的螢光，並且與在螢光激活的細胞分選儀中應用的氬離子雷射的輸出量相匹配。按照本發明第四方面的方法，可以應用按照本發明第三方面的細胞，其含有編碼hEGFP的DNA分子。
因此，按照本發明優選的表達盒包括可有效地連接到編碼GFP、或其發光衍生物或類似物(例如YFP等)的DNA序列上的人GADD45α基因調控元件和人GADD45α基因啟動子。最優選的表達盒包括可有效地連接到編碼GFP或其發光衍生物的DNA序列上的人GADD45α基因啟動子，和GADD45α基因的內含子3。
在第一個實施方案中，按照第一方面的表達盒優選地為5-31，(在圖9中圖示為GD531的盒)。表達盒5-31的核苷酸序列在序列表中顯示為SEQ ID No.2。
在第二個實施方案中，按照第一方面的表達盒優選地為5-32，(在圖9中圖示為GD532的盒)。表達盒5-32的核苷酸序列在序列表中顯示為SEQ ID No.3。
在第三個實施方案中，按照第一方面的表達盒優選地為5-33，(在圖9中圖示為GD533的盒)。表達盒5-33的核苷酸序列在序列表中顯示為SEQ ID No.4。
例如，按照本發明第二方面的重組載體可以是質粒、黏端質粒和噬菌體。當複製所述表達盒時，這樣的重組載體有很大用途。並且，對於用所述表達盒轉染細胞，重組載體是非常有用的，並且還可以促進報導蛋白的表達。
重組載體可以這樣設計，以便所述載體在細胞的細胞質中自主的複製，或者可以用於整合到基因組中。在這種情形中，重組載體中可能需要誘導DNA複製的元件。適當的元件在本領域內是公知的，並且例如，可以衍生於pCEP4(Invitrogen，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，PA49RF，UK)，pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech UK，21 InBetween Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，United Kingdom)或pCI和pSI(Promega UK ltd，Delta house，chilworth Science Park，SouthamptonSO16 7NS，UK)。
這樣的複製載體可以在轉化子中引起多個拷貝的DNA分子，並且因此當需要報導蛋白的過量表達(並且因此增加發光)時特別有用。另外，優選地，所述載體能夠在人、靈長類和/或犬類細胞中複製。優選地，所述載體包括複製起點，並且優選地，至少一種選擇標記。所述選自標記可以賦予對抗生素，例如，潮黴素或新黴素的抗性。因此，適當的元件衍生於pCEP4質粒(Invitrogen，3 Fountain Drive，Inchinnan Business Park，Paisley，PA4 9RF，UK)，其在圖2中圖示。
在第一個實施方案中，按照第二方面的重組載體優選地為pEP-GD531，如在圖5中所圖示。
在第二個實施方案中，按照第二方面的重組載體優選地為pEP-GD532，如在圖6中所圖示。
在第三個實施方案中，按照第二方面的重組載體優選地為pEP-GD533，如在圖7中所圖示。
按照本發明的第二方面，所述重組載體結合在細胞內。優選地，所述細胞為真核的。這樣的宿主細胞可以是哺乳動物源性細胞和細胞系。優選的哺乳動物細胞包括人、靈長類、鼠科或犬類細胞。所述宿主細胞可以是淋巴瘤細胞或細胞系，諸如小鼠淋巴瘤細胞。所述細胞可以是無限增殖的，例如，淋巴細胞。
優選的宿主細胞為人細胞系。優選地，所述宿主細胞是具有完全功能性p53的人細胞系，例如，ML-1(具有野生型p53的人骨髓白血病細胞系)，TK6(具有野生型p53的人類淋巴母細胞細胞系)。然而，也考慮了宿主細胞系WI-L2-NS和WTK1(兩者為TK6的姊妹系並且具有突變的p53蛋白)。這些細胞系全部可以在歐洲細胞培養物收藏中心(EuropeanCollection of Cell Cultures，ECACC General Office，CAMR，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4OJG， United Kingdom)找到。
對於按照本發明方法的應用，本發明人已經發現TK6人細胞是特別優選的細胞系。儘管本發明人不希望受到任何假說的束縛，但是他們相信TK6細胞是最有效的，原因在於它們具有完全功能性的p53。
儘管並不排除不穩定轉染的(瞬時的)細胞的應用，理想地，用於表達由所述DNA分子編碼的蛋白的宿主細胞穩定地轉染。
按照本發明第三方面的轉染細胞可以通過在實施例中描述的下述方法形成。所述細胞理想地為人細胞系，例如TK6。按照本發明第四方面的方法，可以應用這樣轉染的細胞來評估介質是否誘導或促進DNA損傷。應答DNA損傷誘導GFP表達，並且應用已知的適當技術，可以容易地測定GFP發出的光。
按照本發明第三方面最優選的細胞是轉化了載體pEP-GAD532的TK6細胞。本申請中這些細胞叫作GenTK-T01。
還考慮到按照本發明的表達盒可以整合到宿主細胞的基因組中。有經驗的技術人員應該理解用於將所述盒子整合到所述基因組的適當的方法。例如，所述表達盒可以由反轉錄病毒載體攜帶，與包裝細胞系組合時，所述反轉錄病毒載體可以產生不需輔助病毒的重組反轉錄病毒，然後所述反轉錄病毒可以被引入宿主細胞中。然後，所述盒子可以將其本身整合到基因組中。適當的無需輔助病毒的反轉錄載體系統包括具有BING反轉錄病毒包裝細胞系的pBabePuro質粒[Kinsella和Nolan，1996.Episomal VectorsRapidly and Stably Produce High-Titer Recombinant Retroviruses.HumanGene Therapy.71405-1413.]。
對於檢測在低濃度誘導DNA損傷的介質，本發明第四方面的方法特別有效。所述方法可以用於篩選化合物，諸如候選藥物、食品添加劑或化妝品，以評估將生命有機體，特別是人暴露於這樣的化合物是否安全。備選地，本發明第四部分的方法可以用來檢測水源是否被DNA損傷介質或促進DNA損傷的介質汙染。例如，所述方法可以用於監測工業流出液中可能在暴露於所述汙染的人或其它生物體中導致增加的DNA損傷的汙染物的存在。
本發明的方法優選地這樣實行，即，通過生長轉染了按照本發明第二方面的重組載體(諸如pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533)的細胞，將所述細胞用推定引起DNA損傷的介質培養預先確定的時間，並且直接從所述細胞的樣品監測發光報導蛋白的表達。
細胞優選地在低螢光生長培養基中生長。這可以消除在進行測定之前洗滌細胞的需要，並且因此進一步減少所述方法步驟的數目。例如，按照本發明第三方面優選的人細胞可以在低螢光培養基中生長。適宜的培養基可以是改良的RPMI 1640培養基，並且最優選地含有低濃度的，或者優選地，沒有維生素B2或酚紅。本發明人已經發現，在螢光標記物，諸如GFP的檢測中，這樣的培養基的應用令人驚訝地有效。當測量螢光時，這樣的培養基的應用減少「信號與噪聲比例」。因此，按照本發明的第四方面，提供了不含有，或含有降低水平(相對於標準細胞培養基)的維生素B2或酚紅的培養基，以用於螢光檢測。最優選地，所述培養基不含有維生素B2並且不含有酚紅。
優選地，將所述培養基這樣改進，以便其不含有維生素B2。由於應該理解，培養基中通常需要維生素B2，對於有經驗的人員，這樣改良的培養基的應用是與直覺相反的。這是因為大多數細胞需要維生素B2才能夠生長和存活。本發明人認識到，可以將在含有維生素B2的常規生長培養基中生長的細胞從這樣的培養基中移出；放入沒有維生素B2的培養基中；並且對於實行可靠的螢光檢測的目的將保持存活。當按照本發明第四方面的方法檢測時(特別當所述報導蛋白是GFP或其衍生物時)，殘留在常規培養基(含有維生素B2和/或酚紅)中的細胞傾向於提供更不令人滿意的螢光值。
優選地，當實行按照本發明第四方面的檢測時，應用按照本發明第五方面的培養基。最優選地，當用GFP作為報導子進行基因毒性檢測時，應用這樣的培養基。
具有低自發螢光的優選培養基是改良的RPMI 1640培養基，其不含有維生素B2或酚紅。最優選的培養基在實施例1的表1中公開。
其它可以改良成低自發螢光的培養基包括Dulbecco改良Eagle培養基(D-MEM)、F-10營養混合物(Ham)、F-12營養混合物(Ham)、和Fischer’s培養基(GIBCO，Invitrogen，Paisley，UK)。最適當的培養基可以用於可被用作重組報導載體的宿主的不同的細胞類型。
按照本發明方法的優選實施方案，TK6細胞可以用pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533轉染，並且在不含有維生素B2的RPMI培養基中生長。然後，將推定的DNA損傷介質(例如，食品添加劑或潛在的藥物或包含在水樣或流出物樣品中的介質)添加到含有所述細胞的培養基中。然後允許所述細胞生長規定的時間周期，此後，將細胞樣品移出，並且測定其螢光。
有經驗的技術人員應該知道螢光檢測和定量的適當方法，並且在實施例中描述了一種方法。在US 6,509,161中描述了一種螢光檢測的優選方法。當所述發光報導蛋白為GFP或其衍生物時，這種方法特別有效。
按照本發明方法的優選實施方案，從轉染了pEP-GD531，pEP-GD532，或pEP-GD533的TK6細胞，例如，從微量培養板的孔中，記錄螢光和吸收讀數。適當的微量培養板的實例為96孔、黑色、透明底部的微量培養板，由Matrix ScreenMates製備，目錄號4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，NetherlandsCat.No.3651)。應用適當的微量培養板讀數儀，例如，Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)微量培養板讀數儀激發485nm/發射535nm，具有額外的分色鏡(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，可以記錄螢光和吸收測定。吸收可以通過適當的濾光片，例如，620nm濾光片，進行測量。
用於實施本發明第四部分的方法的最優選的流程在實施例1，3和4中描述。
從螢光和吸收測定中，對於按照本發明第三方面的細胞，「亮度值」和螢光誘發比例可以如在實例中所描述的那樣獲得。
在GADD45α-EGFP構建體中存在GFP的背景(「組成型的」)表達，因此細胞密度越高，培養物更加螢光性。為了校正隨生長導致的螢光增長，將螢光數據(GFP)除以吸收數據(細胞密度)，以給出『亮度單位』，即，每細胞平均螢光的測定。這不取決於培養物密度。因此，吸收的測定可以主要用於螢光信號的標準化，而不是DNA損傷介質毒性的測定。因此，應該考慮到，為了通過細胞生存能力和程序性細胞死亡確定毒性，二級檢測可以與吸收測定聯合應用。例如，應用Biovison生物發光細胞毒性檢測法(Biovison Bioluminescence Cytotoxicity Assay，Biovison Incoperated，2455-D Old Middlefield Way，Mountain View，California 94043，USA)，或Vybrant程序性細胞死亡檢測試劑盒(Molecular probes Inc.，29851 WillowCreek Road，Eugene，OR 97402，USA)。
有時候，化合物自發地表現出螢光，或者誘導細胞自發螢光。因此，當評估增強的GFP表達時，從報導細胞系的亮度值中減去對照細胞系的亮度值。這去除了數據的幹擾。因此，優選地，按照本發明第四方面的方法應用含有對照載體的細胞，所述對照載體是基於按照本發明第二方面的報導載體。這樣的對照載體可以對應於報導載體，但是具有引入發光報導基因中的無義突變。
優選地，所述重組對照載體可以是分別在圖18和19中圖示的pEP-GD500C或pEP-GD532C所描述的載體。
按照本發明第四方面的優選的方法將應用按照本發明第三方面的細胞(例如，GenTK-T01)和基於轉化了載體pEP-GD532C的TK6細胞的對照細胞系(本文叫作GenTK-C01)。
應該理解，一些非基因毒性的化合物可以通過細胞代謝被化學改變。在哺乳動物中，這種流程通常叫作代謝激活(MA)。MA可以將某些(certina)非基因毒性化合物(例如，前誘變劑)轉變成基因毒性化合物。最經常地，MA發生在肝臟中。由於這種原因，通常優選地，採用這樣的基因毒性檢測，即，在存在或不存在能夠像在體內代謝化合物那樣代謝化合物的肝臟提取物時，進行測試化合物的檢測。實施例4舉例說明按照本發明第四方面的優選的方法，其應用叫作S9的肝臟提取物(有經驗的人員所知的)。包含這樣的提取物允許測定法檢測到只在通過肝臟後變成基因毒性的化合物。
本文所描述的所有特徵(包括任何附屬的權利要求，摘要和附圖)，和/或因此公開的任何方法或流程的所有步驟，可以以任何組合與上述方面的任一個結合，但其中所述特徵和/或步驟的至少一些互相排斥的組合除外。
現在，僅通過實例方式，參考下述實施例和圖，將進一步描述本發明的實施方案，其中圖1顯示載體pEGFP-N1的限制性圖譜；圖2顯示載體pCEP4的限制性圖譜；圖3顯示載體pHG45-HC的限制性圖譜；圖4顯示載體pEP-GD500的限制性圖譜；圖5顯示載體pEP-GD531，按照本發明的一種優選的重組載體的限制性圖譜；圖6顯示載體pEP-GD532，按照本發明的一種優選的重組載體的限制性圖譜；圖7顯示載體pEP-GD533，按照本發明的一種優選的重組載體的限制性圖譜；圖8顯示載體pEP-GD534的限制性圖譜；圖9顯示按照本發明的報導表達盒的實施方案；圖10顯示MMS對GADD45α報導細胞系的誘導效果；圖11顯示通過MMS對GADD45α報導細胞系誘導的亮度效果；圖12顯示從在具有血清的RPMI 1640(A)或如實施例2中所討論的具有血清的改良低自發螢光培養基(B)中培養的報導細胞系中直接測定的甲磺酸甲酯誘發的螢光；圖13顯示實施例2中在RPMI 1640或改良的低自發螢光培養基中的人類淋巴母細胞細胞系的生長；圖14顯示實施例3中48小時培養後在96孔平板檢測中MMS對相對細胞密度的作用；圖15顯示實施例3中在96孔平板檢測中MMs對螢光誘發比例的作用；圖16顯示實施例4中具有和不具有S9的環磷醯胺對GenTK-C01細胞的相對細胞密度的作用；圖17顯示實施例4中具有和不具有S9的環磷醯胺對GenTK-C01細胞的螢光誘發的作用；圖18顯示命名為pEP-GD500C的對照載體的限制性圖譜；和圖19顯示命名為pEP-GD532C的對照載體的限制性圖譜。
實施例1下述實施例概述在構建按照本發明第一和第二方面的一系列GADD45α-EGFP人細胞培養物DNA損傷生物傳感器/報導子中應用的成分。另外，本實施例描述所述生物傳感器(按照本發明第三方面的細胞)的構建，並且舉例說明當在按照本發明第四方面的方法中應用時，它們怎樣應答基因毒性介質，例如，甲磺酸甲酯(MMS)。
1.1系統組成(i)啟動子—來自GADD45αGADD45α啟動子的來源是來自Albert J.Fornace Jr.，M.D.(NationalCancer Institute，Building37，Room6144，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland 20892，USA)的質粒pHG45-HC，其在圖3中圖示。
(ii)螢光蛋白-Clontech’s EGFP綠色螢光蛋白的來源是Clontech質粒pEGFP-N1(BD BiosciencesClontech UK，21 In Between Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，UnitedKingdom)，其在圖1中圖示。pEGFP-N1編碼野生型GFP的紅移變體，其已經被最優化成為哺乳動物細胞中更亮的螢光和更高的表達。(最大激發＝488nm；最大發射＝507nm。)質粒pEGFP-N1編碼GFPmut1變體，其包含Phe-64到Leu和Ser-65到Thr的雙胺基酸取代。EGFP基因的編碼序列包含多於190個沉默鹼基變化，其對應人類密碼子應用的優先選擇。
1.2生物傳感器報導分子盒的構建應用在圖2中圖示的Invitrogen pCEP4質粒作為骨架，在一些步驟中進行構建一系列的重組載體，其中每一種都包含GADD45α-EGFP報導分子盒。質粒pCEP4是一種附加型哺乳動物表達載體，其應用巨細胞病毒(CMV)直接早期增強子/啟動子用於在多克隆位點插入的重組基因的高水平轉錄。這一質粒攜帶埃巴病毒複製起點(oriP)和核抗原(由EBNA-1基因編碼)，以允許在人類、靈長類和犬類細胞中的染色質外(extrachromosomal)複製。pCEP4還攜帶在轉染細胞中用於穩定選擇的潮黴素B抗性基因。
步驟1(將EGFP模塊插入pCEP4)-EGFP模塊(由人最優化綠色螢光蛋白和SV40多聚腺苷酸化信號組成)通過PCR從圖1顯示的Clontech質粒pEGFP-N1(BD Biosciences Clontech UK，21 In Between Towns Road，Cowley，Oxford，OX4 LY，United Kingdom)上擴增。EGFP基因兩側有BglII-Asc I(5』)和Pac I-XhoI(3』)位點。這被插入圖2顯示的由Bgl II-Xho I切割的pCEP4(Invitrogen)中。這一步驟還導致將CMV啟動子從pCEP4去除。
步驟2(插入GADD45α啟動子)—將GADD45α5』啟動子從圖3中圖示的由Albert J.Fornace Jr.，M.D.(National Cancer Institute，Building37，Room6144，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland 20892，USA)友好饋贈的質粒pHG45-HC PCR擴增，從-2253bp直到並且包含5』UTR(非翻譯區)和起始密碼子，兩側具有切割Bgl II(5』)和AscI I(3』)位點。這被插入步驟1獲得的質粒中。由此獲得的質粒命名為pEP-GD500，其在圖4中顯示。
步驟3(插入GADD45α基因序列)一各種GADD45α基因序列(基因的3』端)通過PCR與克隆位點一起擴增，並且克隆到步驟2獲得的質粒(pEP-GD500)中，以給出4種其它報導子質粒。
這些質粒命名為(i)pEP-GD531(從+1034到+3149的3』序列)-如在圖5中顯示。這一質粒包括人GADD45α基因內含子3的全部，其包括p53結合基序；(ii)pEP-GD532(從+1147到+3149的3』序列)-如在圖6中顯示。這一質粒包括人GADD45α基因內含子3的全部，其包括p53結合基序；(iii)pEP-GD533(從+1248到+3149的3』序列)-如在圖7中顯示。這一質粒包括人GADD45α基因內含子3的全部，其包括p53結合基序；和(iv)pEP-GD534(從+3155到+3149的3』序列)-如在圖8中顯示。這一質粒不包括人GADD45α基因內含子3的全部，並且不包括p53結合基序。這一質粒包括GADD45α3』非翻譯區。
用於步驟3的克隆位點pEP-GD531兩側有Not I(5』)和Xho I(3』)的PCR產物。克隆到Not I-XhoI切割的pEP-GD500中。
pEP-GD532兩側有EcoRV(5』)和Xho I(3』)的PCR產物。克隆到Hpa I-Xho I切割的pEP-GD500中。
pEP-GD533兩側有Pac I(5』)和Xho I(3』)的PCR產物。克隆到Pac I-XhoI切割的pEP-GD500中。
pEP-GD534兩側有Not I(5』)和Xho I(3』)的PCR產物。克隆到Not I-XhoI切割的pEP-GD500中。
步驟4(製備對照載體)—將報導子質粒用Asc I酶切，並且將5』突出端用克列諾酶填滿。然後將修飾的DNA片段重新環化。這在EGFP基因中引入4bp的移碼。由此獲得的蛋白是無功能的。由此獲得的對照質粒用字母C作後綴，並且在圖18和19中圖示。
質粒pEP-GD500，pEP-GD531，pEP-GD532，pEP-GD533和pEP-GD534中每種表達盒的DNA序列在序列表中分別顯示為SEQ ID No.1，SEQ IDNo.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
參考圖9，顯示的是分別排列在人GADD45α基因下的按照本發明的一系列報導分子盒。質粒pEP-GD531，pEP-GD532和pEP-GD533的GADD45α-EGFP報導基因融合體以如此構建以使GADD45α-EGFP融合體的全長等同於天然GADD45α基因，如在圖9中所示。質粒pEP-GD531和pEP-GD532中，hEGFP的GADD45αDNA下遊以及hEGFP本身被轉錄成為mRNA，並且經受剪接。pEP-GD533中，只有hEGFP基因被轉錄成mRNA。轉錄在GADD45α基因序列前的SV40多聚腺苷酸化信號處停止。這些質粒是按照本發明第一方面的。pEP-GD534盒更短一些，並且不包括GADD45α基因內含子3中的p53基序。
1.3細胞系選擇和轉染當考慮一種細胞系用作新的哺乳動物DNA損傷報導子系統的宿主時，重要的是要考慮所選擇的細胞系以允許所述報導子的必要的應答的方式應答基因毒性損傷的能力。研究了P53對分子生物學和/或遺傳毒性學中通常所用的兩種細胞系的下遊基因的地位和作用，並且本文描述了這一工作。這些細胞係為(i)TK6，人類淋巴母細胞細胞系(wt p53)；和TK6的姐妹株，(ii)WI-L2-NS(突變的p53蛋白)。
功能異常的p53蛋白可以導致增強的輻射抵抗性(即，增強的存活)和對輻射的誘變和誘裂作用增強的敏感性。儘管這些特徵使得細胞系適合用於檢測突變的末端，但是相同的特徵意味著，在帶有突變的p53狀態的細胞系中，用於DNA損傷的替代的生物標記的誘導最好的情況下也是差的。為此，將TK6細胞系選作生物傳感器(即，按照本發明第三方面的細胞)。據信，科學目的的其它數據可以從它的具有重組GADD45α-EGFP報導子載體的姐妹細胞系的應用中獲得。
應用從Xia和Liber[Methods in Molecular biology，Vol.48Animal CellElectroporation and Electrofusion Protocols，1995.Edited by J.A.Nickoloff.Humana Press Inc.，Totowa，NJ，USA，Pages 151-160]改編的方法，將TK6細胞通過電穿孔轉染載體，並且在2周後用潮黴素B選擇攜帶所述報導子質粒的克隆。
轉化了pEP-GAD532的TK6細胞在本文中叫作GenTK-T01。也製備了等價的對照細胞系，叫作GenTK-C01，其中故意將GFP報導基因置於閱讀框外。因此，GFP不能從這種對照細胞系表達。
1.4測試培養基—改良的RPMI常規培養基可以用在本發明的方法中。然而，本發明人發現，在與EGFP激發(488nm最大)和發射(520nm最大)相關的波長處，許多傳統的細胞培養基是自發螢光的。在本工作中，發現這種螢光的主要作用因素是維生素B2。因此，優選地，應用改良的低自發螢光的培養基。
可以製備許多這樣的培養基，並且通過實例的方式，本發明研發了改良的低白髮螢光RPMI 1640培養基(見表1)。這種培養基代表按照本發明第五方面應用的優選的培養基，其沒有含有任何維生素B2，並且可以與生物傳感器一起應用，以輔助生物傳感器培養物的直接螢光讀取。
表1低自發螢光哺乳動物細胞培養基成分的工作濃度。
1.5分析方法—微量培養板讀取儀應用具有額外的分色鏡(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)的Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)微量平板讀取儀激發485nm/發射535nm，從微量培養板收集螢光和吸收數據。吸收通過620nm濾光片測定。將數據傳輸到微軟Excel電子數據表中，並且轉化成繪圖數據。吸收數據給出增殖潛力減少的指示，並且將這些數據針對未處理的對照(＝100％生長)進行標準化處理。將螢光數據除以吸收數據，以給出『亮度單位』，每個細胞平均GFP誘導的測定。將這些數據針對未處理的對照(＝1)進行標準化處理。這樣，人們可以區別少量高度螢光性的細胞和大量微弱螢光性的細胞。為了校正誘導的細胞自發螢光和內在化合物螢光，從攜帶報導質粒的5種細胞系的亮度值中減去未轉染的TK6細胞系的亮度值。這使得所述數據的可見評估更加可靠。用和不用這一校正核對所有的數據。從這種「亮度」數據計算螢光誘導的比例。
1.6生物傳感器的MMS誘導作為報導子誘導的一個實例，將6種細胞系(TK6，沒有質粒，和攜帶5種報導質粒之一)用不同濃度的MMS處理。本領域的那些技術人員已知MMS為一種基因毒性和細胞毒性介質，並且當應用本發明的方法時，可以用作陽性對照。
將在1ml改良的RPMI 1640培養基(見上述1.4)+10％馬血清中的1×106個細胞用0μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，和25μg/ml MMS培養過夜(37℃，5％CO2，100％溼度)。
培養後，將細胞在PBS中洗滌，重懸在300μl PBS中，並且然後分成兩份注入96孔、黑色、透明底部的微量培養板的兩個孔中。例如MatrixScreenMates，目錄號4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目錄號3651)。記錄螢光和吸收讀數，並且計算螢光誘導比例。
這種測量重複3次，並且計算平均誘導和標準誤差。所述結果在圖10中圖示。
參考圖11，顯示來自5種報導細胞系和未轉染的母本細胞系TK6的未處理的亮度值。通過測定全部GFP螢光，計算每種細胞系-MMS組合的亮度值，並且然後，用620nm的吸收將所述亮度值標準化。因此，應該理解，當與未轉染的母本細胞系TK6相比較時，質粒pEP-GD531，pEP-GD532，和pEP-GD533的每一種顯示背景螢光的增加，並且當用MMS處理時，這些細胞系在人細胞系TK6的螢光中顯示出基本程度的劑量依賴性。相反，儘管與TK6相比較，攜帶質粒pEP-GD500或pEP-GD534的細胞系顯示出背景螢光的增加，通過MMS處理，這種螢光不會被進一步誘導。儘管本發明人不希望受到任何假說的束縛，他們相信，在質粒pEP-GD534中添加GADD45α3』不翻譯區穩定由此獲得的mRNA，與攜帶質粒pEP-GD500的細胞系相比較，這在攜帶這一質粒的細胞系中導致更高背景水平的螢光。
總之，本發明應用人DNA-損傷可誘導基因GADD45α的調控序列來控制EGFP在p53野生型人類淋巴母細胞細胞系TK6中的產生。人基因GADD45α在體外激發DNA切補修復，並且抑制細胞進入S期。按照本發明的報導子不僅應用GADD45α基因的上遊啟動子，還結合在其基因組基因序列中發現的基因調控元件。這包括在GADD45α基因第三個內含子中的推定的p53結合位點。令人驚訝地，這些序列的應用增強了所述生物傳感器對基因毒性脅迫的應答。在僅僅24小時後，通過簡單測定檢測培養物的螢光，對於螢光誘導，可以分析這種報導子系統。可以將細胞受到介質的影響，並且細胞的發光報導蛋白(GFP)的表達指示所述介質引起DNA損傷。據信，這種生物傳感器在短期預調控性藥物篩選中具有應用。
實施例2為了可以開發優選的培養基以用於按照本發明第四方面的方法，實施進一步的實驗來評估由常規培養基引起的自發螢光的作用。
除非指明相反，應用實施例1中所描述的構建體、細胞和方案。
除了維生素B2(見1.4)，本發明人確定，細胞培養基自發螢光的第二主要的貢獻因素是酚紅(通常用在培養基中的pH指示劑染料)。酚紅的螢光還隨著pH而變化。因此，優選地，將按照本發明應用的培養基配製成改良的低自發螢光的培養基，其中酚紅或維生素B2，但是優選地酚紅和維生素B2兩者，被省略(見表1)。
參考圖12，常規RPMI 1640培養基的應用減少螢光信號與噪聲的比例，並且增加螢光測量的可變性。因此，對於直接的螢光讀數，常規RPMI1640培養基的螢光不是最優的。相反，改良的低自發螢光細胞培養基的應用(對應正常的培養基，除了維生素B2和酚紅被省略)有助於基因毒素誘導的螢光讀數的直接測定。
參考圖13，發現從培養基中省略維生素B2和酚紅兩者導致低自發螢光的培養基，其在96小時期間不會影響細胞生長和4種細胞分裂。因此，這樣的培養基是按照本發明第五方面應用的優選培養基。
因此，應該理解，優選地，按照本發明第四方面的方法中應用的培養基可以包括常規培養基(例如，RPMI 1640)，但是優選地按照本發明第五方面改良，以便其不包含酚紅或維生素B2。
實施例3
實施進一步的實驗來研發對於在96孔平板中實行按照本發明第四方面的方法的最優選的方案。
除非指明相反，應用實施例1中所描述的構建體、細胞和方案。
按照本發明第四方面檢測DNA損傷的優選的方法包括步驟(1)準備用於檢測的微量培養板；(2)在微量培養板中實行檢測；(3)收集並分析數據；和(4)做出關於DNA損傷和所述結果的判斷。
下面給出實施DNA損傷的最優選的檢測的步驟(1)-(4)的詳情。
3.1微量培養板準備.
檢測在96孔、黑色、透明底板的微量培養板中進行。例如MatrixScreenMates，目錄號4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目錄號3651)。儘管發現獨立的製造商的平板之內和之間的可變的背景吸收和螢光是可變的，並且在一些情形中是不可接受的，還是評估了許多備選的微量培養板。因此，應該理解，按照本發明所用的微量培養板優選地在平板和其批次之間具有一致的吸收和螢光。應該理解，當選擇適當的微量培養板時，有經驗的技術人員應該給予認真的考慮。
應用液體操作機器人，可以充滿檢測平板。例如來自Hamilton GB Ltd.，Birmingham的MicroLabS單一取樣器(probe)，或Genesis 8-取樣器機器人(Tecan UK Ltd.Theale.UK)。還可以應用多通道移液管快速並且有效地將微量培養板充滿。
3.2檢測可以遵循下述標準方案。在2％v/v水性DMSO中製備測試化學藥品或含有推定引起DNA損傷的樣品的2mM或1000μg/ml(最低的那一個)儲液，並且將所述儲液用於在96孔微量培養板上製備2份同樣的稀釋系列和對照(見下文)。為了獲得這種結果，將150微升測試化學藥品溶液注入2個微量培養板孔中。通過轉移75微升到75微升2％DMSO中，混合，並且然後取出75微升到下一個孔中，將每種樣品連續稀釋。這產生每份75微升的9次連續稀釋。在微量培養板上，測試化學藥品/樣品的最終頂點濃度為1mM或500μg/ml。
對照按如下添加a.測試化合物/含有僅在檢測培養基中的介質的樣品，以提供關於化合物吸收/螢光的信息b.僅用1％DMSO稀釋的人細胞培養物，以給出最大增殖潛力的測定c.MMS作為基因毒性和細胞毒性對照『high』＝50μg/ml，『low』＝10μg/ml v/vd.僅有2％DMSO稀釋液，以確定沒有稀釋物吸收/螢光e.僅有生長培養基，以確定無菌/沒有汙染將按照本發明的細胞系(例如GenTK-C01和GenTK-T01)的指數生長培養物在D-PBS中洗滌，並且以2×106個細胞/ml的密度懸浮在按照本發明的兩倍濃度的低自發螢光的檢測培養基中。將75微升細胞懸浮液添加到稀釋的化學藥品的每個孔中GenTK-C01到一個系列，和GenTK-T01到第二個，並且到適當的標準和對照中。將平板充滿後，應用透氣性膜(例如，Breath-easy，Diversified Biotech，USA)或塑料蓋將它們密封，並且然後不搖動在37℃，5％CO2，95％溼度培養24小時。
3.3數據收集和處理.
緊接著24小時培養後，從所述微量培養板收集螢光和吸收數據。應用結合螢光和吸收函數的兩種不同的微量培養板，並且獲得參照數據。這些是Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)激發485nm/發射535nm，具有額外的分色鏡(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，和WallacVictor2(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Monza，Italy)激發485nm/發射535nm。在兩種儀器中，通過620nm濾光片測量吸收。應用透氣性膜(例如Breath-easy，Diversified Biotech，USA)或塑料蓋將微量培養板重新密封，並且然後不搖動在37℃，5％CO2，95％溼度繼續培養24小時。然後收集進一步的吸收和應用測定。將所述結果傳輸到微軟Excel電子數據表中，並且轉化成繪圖數據(參見實施例2的圖14和15中的典型數據)。數據處理是最小化的吸收數據給出增殖潛力降低的指示，並且將這些數據用未處理的對照(＝100％生長)標準化處理。將螢光數據除以吸收數據，以給出『亮度單位』，每個細胞的平均GFP誘導測定。將這些數據用未處理的對照(＝1)標準化處理。這樣，人們可以區別少量高度螢光性的細胞和大量微弱螢光性的細胞。為了校正誘導的細胞自發螢光和內在化合物螢光，從GenTK-T01細胞系的亮度值中減去GenTK-C01細胞系的亮度值。這使得所述數據的可見評估更加可靠。用和不用這一校正核對所有的數據，並且關於化合物是否分類為基因毒性的決定(見下文)不受影響。
3.4決定閾值.
對常規檢測的陽性和陰性結果的清楚定義是有用的，並且，考慮到系統的最大噪聲和其中關於基因毒性和作用機制存在清楚的結果的化學藥品的數據，已經得到這樣的定義。本質上，對於使用者審查所述數字和繪圖數據並得出他們自己的結論是可能的。例如沒有越過閾值的基因毒性數據的向上趨勢仍舊可以區別兩種化合物。決定閾值設定如下細胞毒性閾值設定在未處理的對照細胞達到的細胞密度的80％。這大於背景的標準偏差的3倍。如果1或2個化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度，那麼推定為陽性細胞毒性結果(+)。當(i)3個或更多個化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度，或(ii)至少1種化合物稀釋液產生低於60％閾值的終細胞密度時，推定為強陽性細胞毒性結果陽性(++)。當沒有化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度時，推定為陰性結果(-)。最低有效濃度(LEC)是產生低於80％閾值的終細胞密度的最低的測試化合物濃度。
如果測試化合物是顯著吸收性的，化合物吸收對照允許產生警告。如果化合物對照孔與僅充滿培養基的孔的吸收比例＞2，那麼存在幹擾解釋的風險。細胞毒性對照表明，所述細胞系表現正常。『高』MMS標準應該將終細胞密度減少到80％閾值以下，並且應該是比『低』標準更低的值。
基因毒性閾值設定在1.5的相對GFP誘導(即，50％增加)。這大於背景標準偏差的3倍。如果1或2個化合物稀釋液產生大於1.5閾值的相對GFP誘導，那麼推定為陽性基因毒性結果(+)。當(i)3個或更多個化合物稀釋液產生大於1.5閾值的相對GFP誘導，或(ii)至少1種化合物稀釋液產生大於1.8閾值的相對GFP誘導時，推定為強陽性基因毒性結果(++)。當沒有化合物稀釋液產生大於1.5閾值的相對GFP誘導時，推定為陰性基因毒性結果(-)。LEC是產生大於1.5閾值的相對GFP誘導的最低的測試化合物濃度。基因毒性對照證明所述細胞系正常應答DNA損傷。『高』MMS標準必須產生＞2的螢光誘導，並且是比『低』MMS標準更大的值。當所述毒性引起低於空白的30％的終細胞密度時，產生反常的亮度數據。不計算超出這一毒性閾值的基因毒性數據。再檢測基因毒性檢測為陰性的化合物，直到10mM或5000μg/ml，或者到溶解度或細胞毒性的極限。
當化合物是高度自發螢光性時，所述化合物螢光對照允許產生警告。如果化合物對照孔與充滿培養基的孔的螢光比例＞5，那麼存在幹擾解釋的風險。在這些情形中，可以應用螢光極化(polarisation)來區別GFP與螢光的其它來源(Knight等.，2000，2002)。Tecan儀器具有這一工具。有時候，儘管化合物自身不是螢光性的，但是化合物誘導細胞的自發螢光。在不存在來自只有化學藥品的對照的螢光時，這顯而易見地是來自對照(GenTK-C01)細胞系中增加的亮度。從GenTK-T01數據中常規減去GenTK-C01去除了對所述數據的幹擾。
實施例4為了在具有和沒有S9代謝激活作用的24孔平板中實施按照本發明第四方面的方法，實施進一步的研發工作，以開發其它最優選的方案。
S9是肝臟提取物(有經驗的技術人員已知)，其可能區別基因毒性化合物和可以通過肝細胞新陳代謝被化學改變而在體內產生基因毒性化合物的非基因毒性化合物。
除非指明相反，應用實施例1中所描述的構建體、細胞和方案。
按照本發明第四方面檢測DNA損傷的優選方法包括步驟(1)準備用於代謝激活檢測的24孔板；(2)在24孔平板中實施檢測並且在96孔平板中處理樣品；(3)收集並分析數據；和(4)做出關於DNA損傷和所述結果的判斷。
下面給出實施DNA損傷的最優選的檢測的步驟(1)-(4)的詳情。
4.1微量培養板準備.
檢測在24孔平板(Corning BV，Schiphol-Rijk The Netherlands)和96孔、黑色、透明底部的微量培養板上實行。例如Matrix ScreenMates，目錄號4929，Apogent Discoveries，USA，或Corning(BV，Netherlands目錄號3651)。儘管獨立的製造商的平板之內和之間的可變的背景吸收和螢光通常是不可接受的，還是評估的許多備選的微量培養板，這導致現在優選的選擇。因此，應該理解，按照本發明所用的微量培養板優選地在平板和其批次之間具有一致的吸收和螢光。
應用液體操作機器人，可以充滿檢測平板。例如來自Hamilton GB Ltd.，Birmingham的MicroLabS單一探針，或Genesis 8-探針機器人(Tecan UKLtd.Theale.UK)。還可以應用多通道移液管快速並且有效地將微量培養板充滿。
4.2檢測可以遵循下述標準方案。對於24孔平板的每一排，將1ml下列細胞系培養基組合添加到每個孔中i)在RPMI 1640培養基中的1×106個細胞/ml GenTK-C01ii)在RPMI 1640培養基中的1×106個細胞/ml GenTK-T01iii)在RPMI 1640培養基+10％S9混合物中的1×106個細胞/mlGenTK-C01iv)在RPMI 1640培養基+10％S9混合物中的1×106個細胞/mlGenTK-T01RPMI 1640培養基優選為如本發明第五方面所定義的改良的培養基(例如表1中公開的培養基)。
在100％v/v水性DMSO中製備測試化學藥品或含有推定引起DNA損傷的樣品的100mg/ml儲液，並且將所述儲液用於在24孔平板上製備4份同樣的稀釋系列和『對照』(見下文)。為了獲得這種結果，將200微升測試化學藥品溶液注入無菌的7ml玻璃小瓶或1.5ml小型管中。通過轉移100微升到100微升100％DMSO中，混合，並且然後取出100微升到下一個孔中，將每種樣品連續稀釋。這產生每份100微升的3次連續稀釋。對於24孔平板的每個孔，在24孔平板上，測試化學藥品/樣品的最終頂點濃度為1mg/ml。
對照按如下添加a.僅用10μl 100％DMSO稀釋的人細胞培養物，以給出最大增殖潛力的測定b.在S9存在下，30μg/ml環磷醯胺作為陽性基因毒性和細胞毒性對照。
將所述平板充滿後，應用透氣性膜(例如Breath-easy，DiversifiedBiotech，USA)或塑料蓋將它們密封，並且然後不搖動在37℃，5％CO2，95％溼度培養24小時。在24小時培養之後，將細胞轉移到1.5ml微量管中，並且通過在2500rcf離心5分鐘收集下來。將細胞在500μl預溫的D-PBS(Sigma-Aldrich，Gillingham，UK)中洗滌，並且通過如前述的離心收集下來。將細胞重懸在150μl D-PBS中，並且將細胞懸浮液轉移到視覺上透明底、黑色聚苯乙烯96孔微量培養板(MatrixTechnologies，Wilmslow，UK)的孔中。作為空白，將150μl D-PBS添加到2個孔中。
4.3數據收集和處理.
將細胞懸浮液轉移到96孔平板中後，收集螢光和吸收數據。應用結合螢光和吸收函數的2中不同的微量培養板讀數儀，並且獲得參照數據。這些是Tecan Ultra-384(Tecan UK Ltd.)激發485nm/發射535nm，具有額外的分色鏡(反射320nm-500nm，透射520nm-800nm)，和WallacVictor2(PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Monza，Italy)激發485nm/發射535nm。在兩種儀器中，通過620nm濾光片測量吸收。將所述結果傳輸到微軟Excel電子數據表中，並且轉化成繪圖數據(參見實施例3的圖16和17中的典型數據)。數據處理是最小化的吸收數據給出增殖潛力降低的指示，並且將這些數據用未處理的對照(＝100％生長)標準化處理。將螢光數據除以吸收數據，以給出『亮度單位』，每個細胞的平均GFP誘導測定。將這些數據用未處理的對照(＝1)標準化處理。這樣，人們可以區別少量高度螢光性的細胞和大量微弱螢光性的細胞。為了校正誘導的細胞自發螢光和內在化合物螢光，從GenTK-T01的亮度值中減去GenTK-C01細胞系的亮度值。這使得所述數據的可見評估更加可靠。用和不用這一校正核對所有的數據，並且關於化合物是否分類為基因毒性的決定(見下文)不受影響。
4.4決定閾值.
對常規檢測的陽性和陰性結果的清楚定義是有效的，並且，考慮到系統的最大噪聲和其中關於基因毒性和作用機制存在清楚的結果的化學藥品的數據，已經得到這樣的定義。本質上，對於使用者審查所述數字和繪圖數據並得出他們自己的結論是可能的。例如沒有越過閾值的基因毒性數據的向上趨勢仍舊可以區別兩種化合物。決定閾值設定如下細胞毒性閾值設定在未處理的對照細胞達到的細胞密度的80％。這大於背景的標準偏差的3倍。如果1或2個化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度，那麼推定為陽性細胞毒性結果(+)。當(i)3個或更多個化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度，或(ii)至少1種化合物稀釋液產生低於60％閾值的終細胞密度時，推定為強陽性細胞毒性結果陽性(++)。當沒有化合物稀釋液產生低於80％閾值的終細胞密度時，推定為陰性結果(-)。最低有效濃度(LEC)是產生低於80％閾值的終細胞密度的最低的測試化合物濃度。
如果測試化合物是顯著吸收性的，化合物吸收對照允許產生警告。如果化合物對照孔與僅充滿培養基的孔的吸收比例＞2，那麼存在幹擾解釋的風險。細胞毒性對照表明，所述細胞系表現正常。
基因毒性閾值設定在1.3的相對GFP誘導(即，30％增加)。這大於背景標準偏差的3倍。如果1或2個化合物稀釋液產生大於1.3閾值的相對GFP誘導，那麼推定為陽性基因毒性結果(+)。當(i)3個或更多個化合物稀釋液產生大於1.3閾值的相對GFP誘導，或(ii)至少1種化合物稀釋液產生大於1.6閾值的相對GFP誘導時，推定為強陽性基因毒性結果(++)。當沒有化合物稀釋液產生大於1.3閾值的相對GFP誘導時，推定為陰性基因毒性結果(-)。LEC是產生大於1.3閾值的相對GFP誘導的最低的測試化合物濃度。基因毒性對照證明所述細胞系正常應答於DNA損傷。具有S9時，環磷醯胺標準必須產生＞1.3的螢光誘導，沒有S9時，不能產生＞1.1的螢光誘導。當所述毒性引起低於空白的30％的終細胞密度時，產生反常的亮度數據。不計算超出這一毒性閾值的基因毒性數據。再檢測基因毒性檢測為陰性的化合物，直到10mM或5000μg/ml，或者到溶解度或細胞毒性的極限。
序列表110傑特尼克斯傑特尼克斯有限公司120基因毒性檢測130PCB/AH/P89625PWO1605170PatentIn version 3.121012113516212DNA213智人220
221GADD45α啟動子222(4)..(2254)223
220
221GADD45α5』UTR222(2255)..(2549)223
220
221EGFP基因222(2550)..(3278)223
220
221SV40 polyA222(3432)..(3482)223
4001atcagatctt gggtggggca ctttaggact gtggttcatt tgaattggtg taaacaatac60accggttcta ctgtcctaca gcctccattc agatgactga agtcatggga ctttcagcat120agctagctga tgacagtgca tactattttg tcccaaaatc cagttcaagc atggacatac180caataagagc ctaagctctt taaaggcaaa ggaccaggaa ttgtacagtt cttggtatag240aagaagacag gcaaaagtgt ttttgaacta acgttaaatg tgcaatatgt tagaattcat300gcaatgcaca ggactgcagg attctgatat cttatttaac tctcaaattc tattcaactc360aataaacctt gactgtgctt ctactaaatg caggtattgt actaggagct gaggacacca420aactgatgaa gtccttgctg tcaagaaact cacatgattc cctaattctt tgtcagcttg480ctgtgatcac attttcttcc caagaacctc taagaaatgc ctagtggata gaaccttgga540gttccacgga acatattaac aatcgccaaa tgatgactca ggctagattg tgtaattcag600gttttgtctg caaaactgaa aatgcttcgg taacctacct aaatttcaat gttgaggaat660tctttaagaa agacatcaaa tgttaagatt taaggcatag atatgagata catagtcatg720cttaggtgaa ttatgcactg accatgacca tttctttact caaatgttgt ccatggctga780caacacagtg aaaaaatgag tgcaaaatga caactcaaat aaatgaacca gaaaacctat840cacttttctt ttccaccaaa ttaagatcaa gagagctgga gaatattttg tctagagtga900taaaaacata agggtgcaaa acttccaggt acctttgcag aaattacttc tgtgaccttt960ggctgtacag caaccttaat aatgcaagca ctgttttgaa tgcaagcatg tgggagccat1020tttcaccact tttgatgact tcagtaggtt taagaaatgt ttttgctttt attgcataaa1080ccataaaaca aaggaaggga cttttgaact actcagtgag agtctatata ttaaagtttg1140
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aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac3000aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc3060aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac3120acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc3180gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc3240gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg cgactctaga3300tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc3360tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag3420cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt3480cactgcattc tagttgttaa ttaatgcctc gagcgc 351621022115411212DNA213智人220
221GADD45α啟動子222(4)..(2254)223
220
221GADD45α5』UTR222(2255)..(2549)223
220
221EGFP基因222(2550)..(3278)223
220
221GADD45α外顯子3222(3405)..(3642)223
220
221GADD45α內含子3222(3643)..(4715)223
220
221p53基序222(3830)..(3849)223
220
221AP-1基序222(3879)..(3885)223
220
221GADD45α外顯子4222(4716)..(5391)223
220
221GADD45α3』UTR222(4830)..(5391)
223
4002atcagatctt gggtggggca ctttaggact gtggttcatt tgaattggtg taaacaatac60accggttcta ctgtcctaca gcctccattc agatgactga agtcatggga ctttcagcat120agctagctga tgacagtgca tactattttg tcccaaaatc cagttcaagc atggacatac180caataagagc ctaagctctt taaaggcaaa ggaccaggaa ttgtacagtt cttggtatag240aagaagacag gcaaaagtgt ttttgaacta acgttaaatg tgcaatatgt tagaattcat300gcaatgcaca ggactgcagg attctgatat cttatttaac tctcaaattc tattcaactc360aataaacctt gactgtgctt ctactaaatg caggtattgt actaggagct gaggacacca420aactgatgaa gtccttgctg tcaagaaact cacatgattc cctaattctt tgtcagcttg480ctgtgatcac attttcttcc caagaacctc taagaaatgc ctagtggata gaaccttgga540gttccacgga acatattaac aatcgccaaa tgatgactca ggctagattg tgtaattcag600gttttgtctg caaaactgaa aatgcttcgg taacctacct aaatttcaat gttgaggaat660tctttaagaa agacatcaaa tgttaagatt taaggcatag atatgagata catagtcatg720cttaggtgaa ttatgcactg accatgacca tttctttact caaatgttgt ccatggctga780caacacagtg aaaaaatgag tgcaaaatga caactcaaat aaatgaacca gaaaacctat840cacttttctt ttccaccaaa ttaagatcaa gagagctgga gaatattttg tctagagtga900taaaaacata agggtgcaaa acttccaggt acctttgcag aaattacttc tgtgaccttt960ggctgtacag caaccttaat aatgcaagca ctgttttgaa tgcaagcatg tgggagccat1020tttcaccact tttgatgact tcagtaggtt taagaaatgt ttttgctttt attgcataaa1080ccataaaaca aaggaaggga cttttgaact actcagtgag agtctatata ttaaagtttg1140tttttcaaaa atgtgtaact accatttgca gttttaaagg tctgctttcc acctacaagt1200tgccattatc tcaaaggtga aattttagca tatgactaaa aacttcctat agttacagct1260tcatgattca gcatctaaca tcaataattc acagtgagat cataggaggc tctctgtgga1320aggtaacgac atacatacgt taggaaagga agcttagggc atatcgagag cattttgaat1380ttagacttgt gggctgtgtg ggtgtcagat ggttgtctct cagctggtgg gcgtccagaa1440ggatccttgt ttgggcaagg ctctttgaga aaggagaatc tgggttgcca gggattccca1500catgtggtca ccagctcccc acgcagacca gctcacgatt tcccagttac accgggcagg1560tgggaaaccg ttctgctttc tgtggaaaag attctaactt ggttccctgc catccctgaa1620
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221EGFP基因222(2550)..(3278)223
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220
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1.一種表達盒，其包括編碼報導蛋白的DNA序列，其中所述DNA序列可有效地連接到人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件上，安排所述人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件使其應答於DNA損傷而激活所述DNA序列的表達。
2.按照權利要求1的表達盒，其中所述調控元件包括GADD45α基因的外顯子1，外顯子2，外顯子3，和/或外顯子4，或其至少一個區域，或其任何組合。
3.按照權利要求2的表達盒，其中所述調控元件包括GADD45α基因外顯子1的至少一個區域，GADD45α基因外顯子3的至少一個區域，和GADD45α基因外顯子4的至少一個區域。
4.按照前述權利要求任一項的表達盒，其中所述調控元件包括GADD45α基因的內含子1，內含子2，和/或內含子3，或其至少一個區域，或其任何組合。
5.按照權利要求4的表達盒，其中所述調控元件包括GADD45α基因內含子3的至少一個區域。
6.按照權利要求5的表達盒，其中所述調控元件包括推定的p53結合基序。
7.按照權利要求5或權利要求6的表達盒，其中所述調控元件包括推定的AP-1基序。
8.按照前述權利要求任一項的表達盒，其中所述DNA序列編碼發光報導蛋白。
9.按照前述權利要求任一項的表達盒，其中所述DNA序列編碼綠色螢光蛋白(GFP)，及其發光衍生物。
10.按照前述權利要求任一項的表達盒，其中所述DNA序列編碼人增強的GFP(hEGFP)，其由含有Phe-64到Leu和Ser-65到Thr的雙胺基酸取代的GFP野生型組成。
11.表達盒5-31，基本上如在圖9中圖示的那樣。
12.表達盒5-32，基本上如在圖9中圖示的那樣。
13.表達盒5-33，基本上如在圖9中圖示的那樣。
14.一種重組載體，其包括按照權利要求1-13中任一項的表達盒。
15.按照權利要求14的重組載體，其中所述載體包括來自pCEP4質粒的DNA。
16.重組載體PEP-GD531，基本上如在圖5中圖示的那樣。
17.重組載體PEP-GD532，基本上如在圖6中圖示的那樣。
18.重組載體PEP-GD533，基本上如在圖7中圖示的那樣。
19.一種含有按照權利要求15-18中任一項的重組載體的細胞。
20.按照權利要求19的細胞，其中所述細胞為人細胞。
21.按照權利要求20的細胞，其中所述細胞為具有完全功能性的p53的人細胞。
22.按照權利要求20的細胞，其中所述細胞為TK6人細胞系。
23.一種檢測引起或促進DNA損傷的介質的存在的方法，其包括使按照權利要求19-22中任一項的細胞經受介質的影響；並且監測所述報導蛋白從所述細胞的表達。
24.按照權利要求23的方法，其中所述介質被進一步篩選，以評估將有生命的生物體暴露於所述介質是否安全。
25.按照權利要求23或權利要求24的方法，其中所述介質是候選藥物、食品添加劑或化妝品。
26.按照權利要求23-25中任一項的方法，其中發光報導蛋白從所述細胞的表達被監測。
27.按照權利要求26的方法，其中所述發光報導蛋白是綠色螢光蛋白。
28.按照權利要求27的方法，其包括生長轉染了按照權利要求14-18中任一項的重組載體的細胞，用所述介質培養所述細胞持續預先確定的時間，並且直接監測綠色螢光蛋白從所述細胞樣品的表達。
29.按照權利要求23-28中任一項的方法，其中所述細胞在低螢光生長培養基中生長。
30.按照權利要求29的方法，其中所述低螢光生長培養基是不包含維生素B2的RPMI培養基。
31.按照權利要求29或30的方法，其中所述低螢光生長培養基是不包含酚紅的RPMI培養基。
32.按照權利要求26-31中任一項的方法，其中螢光通過比較來自按照本發明第三方面的細胞的螢光和來自包括按照本發明第二方面的載體的對照細胞的螢光而確定，其中編碼發光報導子的核酸被置於閱讀框外。
33.不包含或包含相對於標準細胞培養基減少水平的維生素B2或酚紅的細胞培養基在螢光檢測中的應用。
34.按照權利要求33的應用，其中所述培養基是如權利要求30或31所定義的培養基。
35.按照權利要求33或34的應用，其中所述螢光檢測是由權利要求23-32中任一項所定義的方法。
全文摘要
本發明涉及檢測推定引起或促進DNA損傷的介質的存在的方法，其包括將細胞(含有編碼可有效地連接到人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件DNA序列，其中安排所述人GADD45α基因啟動子和人GADD45α基因調控元件使其應答於DNA損傷而激活所述DNA序列的表達)處於介質的影響下；並且監測所述報導蛋白從所述細胞的表達。本發明還涉及可以按照這樣的方法應用的表達盒、載體和細胞，並且還涉及可以在螢光檢測和本發明方法的優選實施方案中應用的改良的培養基。
文檔編號C12Q1/68GK1961080SQ200580016172
公開日2007年5月9日 申請日期2005年5月18日 優先權日2004年5月20日
發明者P·哈斯特威爾, R·沃姆斯利 申請人:傑特尼克斯有限公司